(LUẬN văn THẠC sĩ) phân lập và khảo sát một số đặc tính sinh học của vi khuẩn ornithobacterium rhinotracheale gây bệnh hô hấp trên đàn gà ở một số tỉnh phía bắc

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ ÁI PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA VI KHUẨN ORNITHOBACTERIUM RHINOTRACHEALE GÂY BỆNH HÔ HẤP TRÊN ĐÀN GÀ Ở MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC Chuyên ngành : Thú y Mã số : 60 64 01 01 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Chu Đức Thắng NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2016 download by : skknchat@gmail.com LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi Các số liệu, kết nêu luận văn trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tơi xin cam đoan thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Ái i download by : skknchat@gmail.com LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, ngồi cố gắng thân, tơi ln nhận quan tâm giúp đỡ tổ chức, quan, nhà khoa học, thầy cô giáo, bạn bè đồng nghiệp người thân gia đình Nhân dịp này, tơi xin cảm ơn giúp đỡ giảng viên khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam giảng dạy suốt thời gian học tập Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc hướng dẫn, giúp đỡ chân tình, đầy trách nhiệm hết lịng khoa học PGS.TS Chu Đức Thắng Tôi xin gửi lời cảm ơn tới sâu sắc tới ban lanh đạo, đồng nghiệp, đặc biệt phòng vi trùng – Trung tâm Kiểm nghiệm thuốc thú y TWI nơi làm việc tạo điều kiện giúp đỡ cho tơi hồn thành luận văn Cuối xin gửi lời cảm ơn tới người thân gia đình ln quan tâm, động viên giúp tơi hồn thành luận văn Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Ái ii download by : skknchat@gmail.com MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục từ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii Trích yếu luận văn ix Thesis abstract xi Phần Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề .1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Phần Tổng quan tài liệu 2.1 Lịch sử tình hình nghiên cứu bệnh ort 2.1.1 Tình hình nghiên cứu ORT giới 2.1.2 Tình hình nghiên cứu ORT Việt Nam 2.2 Căn bệnh 2.2.1 Phân loại 2.2.2 Hình thái cấu trúc vi khuẩn 2.2.3 Tính chất nuôi cấy 2.2.4 Đặc tính sinh hóa .8 2.2.5 Cấu trúc kháng nguyên độc lực 2.2.6 Sức đề kháng 2.3 Truyền nhiễm học 2.3.1 Loài mắc bệnh 2.3.2 Chất chứa mầm bệnh .10 2.3.3 Phương thức truyền lây 10 2.3.4 Định serotype phân loại chủng 11 2.3.5 Khả gây bệnh 11 2.3.6 Khả miễn dịch .12 iii download by : skknchat@gmail.com 2.4 Triệu chứng bệnh tích .12 2.4.1 Triệu chứng gà mắc bệnh ORT 12 2.4.2 Bệnh tích gà mắc bệnh ORT 13 2.5 Chẩn đoán .14 2.5.1 Chẩn đoán lâm sàng .14 2.5.2 Phân lập, nuôi cấy vi khuẩn 14 2.5.3 Phát kháng nguyên 15 2.5.4 Huyết học 15 2.5.5 Chẩn đoán phân biệt 16 2.6 Biện pháp phòng trị bệnh 18 2.6.1 Phòng bệnh 18 2.6.2 Điều trị 18 Phần Nội dung phương pháp nghiên cứu 20 3.1 Địa điểm nghiên cứu 20 3.2 Đối tượng nghiên cứu 20 3.3 Nội dung nghiên cứu 20 3.4 Nguyên vât liệu .20 3.4.1 Mẫu bệnh phẩm .20 3.4.2 Các loại mơi trường, hố chất 21 3.4.3 Máy móc, giống vi khuẩn 22 3.4.4 Dụng cụ 22 3.5 Phương pháp nghiên cứu .22 3.5.1 Phương pháp quan sát triệu chứng lâm sàng 22 3.5.2 Phương pháp mổ khám 22 3.5.3 Phương pháp lấy mẫu bảo quản mẫu 23 3.5.4 Phương pháp nuôi cấy phân lập vi khuẩn 23 3.5.5 Phương pháp nhuộm Gram 24 3.5.6 Phương pháp thử đặc tính sinh hố chủng vi khuẩn phân lập 25 3.5.7 Phương pháp PCR 26 3.5.8 Phương pháp xác định khả mẫn cảm vi khuẩn với kháng sinh 27 3.5.9 Phương pháp xư lý số liệu 29 iv download by : skknchat@gmail.com Phần Kết thảo luận 30 4.1 Tình hình mắc bệnh đường hơ hấp đàn gà nói chung tình hình mắc bệnh ort nói riêng tỉnh hà nội, bắc ninh, bắc giang Hưng Yên từ tháng năm 2015 đến tháng năm 2016 30 4.1.1 Tình hình mắc số bệnh đường hô hấp đàn gà tỉnh Hà Nội, Bắc Ninh, Bắc Giang Hưng Yên 30 4.1.2 Tình hình mắc số bệnh đường hô hấp theo lứa tuổi 32 4.1.3 Tình hình mắc số bệnh đường hô hấp theo mùa vụ 35 4.1.4 Tình hình mắc nghi mắc bệnh ORT tỉnh Hà Nội, Bắc Ninh, Bắc Giang Hưng Yên 37 4.1.5 Kết nghiên cứu biểu triệu chứng lâm sàng bệnh tích đại thể gà mắc nghi mắc bệnh ORT .38 4.2 Kết phân lập vi khuẩn ORT .46 4.2.1 Kết giám định vi khuẩn ORT kĩ thuật PCR .46 4.2.2 Kết phân lập vi khuẩn ORT .48 4.2.3 Kết xác định tỷ lệ phân lập vi khuẩn ORT số quan gà mắc bệnh .51 4.3 Kết giám định số đặc tính sinh hóa vi khuẩn ort phân lập gà 53 4.4 Kết xác định tính mẫn cảm vi khuẩn với số loại kháng sinh 56 Phần Kết luận kiến nghị 60 5.1 Kết luận 60 5.2 Kiến nghị .61 Tài liệu tham khảo .62 v download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Tên viết tắt Nghĩa tiếng Việt AGP Accelerated Graphics Port BEAs Boiled Extract Antigens BHB Brain Heart Infusion Broth CBA Columbia Blood Agar CRD Chronic Respiratory Disease DIA Dot Immunobinding Assay DNA Deoxyribonucleic Acid ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay GAP Agar Gel Precipitation IB Infectious Bronchitis ILT Infectious Laryngo Tracheitis IgM Immunoglobulin M ORT Ornithobacterium rhinotracheale PAP Peroxidase - Anti Peroxidase PB Pasteurella Broth PBS Phosphate Saline Buffer PCR Polymerase Chain Reaction PGNR Pleomorphic Gram Negative Rod rRNA Ribosomal Ribonucleic Acide RT-PCR Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction TBE Tris-borate-EDTA SPAT Standard Plate Agglutination Test vi download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC BẢNG Bảng 21 Phản ứng enzyme O.Rhinotrachaele Bảng 3.1 Bảng tiêu chuẩn nhà cung cấp giấy tẩm kháng sinh 28 Bảng 4.1 Tình hình mắc số bệnh đường hô hấp gà tỉnh Hà Nội, Bắc Ninh, Bắc Giang Hưng Yên 31 Bảng 4.2 Tình hình mắc số bệnh đường hơ hấp theo lứa tuổi 33 Bảng 4.3 Tình hình mắc số bệnh đường hô háp theo mùa vụ 36 Bảng 4.4 Kết thu thập mẫu bệnh phẩm nghi mắc bệnh ORT tỉnh 38 Bảng 4.5 Triệu chứng lâm sàng gà mắc nghi bệnh ORT 38 Bảng 4.6 Phân biệt triệu chứng lâm sàng gà mắc bệnh đường hô hấp 41 Bảng 4.7 Kết mổ khám kiểm tra bệnh tích đại thể 110 gà mắc nghi mắc bệnh ORT 42 Bảng 4.8 Kết giám định vi khuẩn ORT kĩ thuật PCR .47 Bảng 4.9 Kết phân lập vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm theo nhóm gà 49 Bảng 4.10 Kết phân lập vi khuẩn ORT từ mẫu bệnh phẩm 52 Bảng 4.11 Kết phản ứng sinh hóa ORT .56 Bảng 4.12 Bảng tổng hợp kết thử tính mẫn cảm ORT với số loại kháng sinh .57 vii download by : skknchat@gmail.com DANH MỤC HÌNH Hình 2.1 Hình ảnh nhuộm gram Hình 3.1 Hình ảnh thạch máu có bổ sung gentamycin 21 Hình 4.1 Tỷ lệ gà mắc số bệnh đường hô hấp tỉnh Hà Nội, Bắc Ninh, Bắc Giang Hưng Yên 32 Hình 4.2 Tình hình mắc số bệnh đường hô hấp gà theo lứa tuổi 34 Hình 4.3 Tình hình mắc số bệnh hô hấp theo mùa vụ 37 Hình 4.4 Tỷ lệ gà mắc nghi mắc bệnh ORT .39 Hình 4.5 Triệu chứng gà khó thở, lơng xơ xác 40 Hình 4.6 Trứng méo mó, sần sùi 40 Hình 4.7 Triệu chứng sưng mặt, chảy nước mắt .40 Hình 4.8 Phổi viêm đỏ sẫm 43 Hình 4.9 Khí quản viêm – có dịch nhầy 44 Hình 4.10 Khí quản xuất huyết 44 Hình 4.11 Phổi viên – có mủ 45 Hình 4.12 Phổi viêm – có mủ nhánh phế quản 45 Hình 4.13 Túi khí dày, đục màu 46 Hình 4.14 Kết giám định có mặt vi khuẩn ORT kỹ thuật PCR 46 Hình 4.15 Kết giám định vi khuẩn kĩ thuật PCR theo nhóm gà 47 Hình 4.16 Khuẩn lạc ORT nuôi cấy thạch máu sau 48 48 Hình 4.17 Kết phân lập vi khuẩn theo nhóm gà 49 Hình 4.18 Tỷ lệ phân lập vi khuẩn theo nhóm gà .50 Hình 4.19: Hình ảnh vi khuẩn ORT kính hiển vi 51 Hình 4.20 Tỷ lệ phân lập ORT từ mẫu bệnh phẩm .52 Hình 4.21 Phản ứng catalase ORT .54 Hình 4.22: Phản ứng Oxidase ORT .54 Hình 4.23 Phản ứng Indol ORT 55 Hình 4.24 Phản ứng Urease .55 Hình 4.25 Tỷ lệ mẫn cảm tỷ lệ kháng vi khuẩn ORT với số loại kháng sinh 57 Hình 4.26 Kết kiểm tra tính mẫn cảm vi khuẩn ORT loại kháng sinh thạch .58 viii download by : skknchat@gmail.com TRÍCH YẾU LUẬN VĂN Tên tác giả: Nguyễn Thị Ái Tên luận văn: Phân lập khảo sát số đặc tính sinh học vi khuẩn Ornithobacterium rhinotracheale gây bệnh hơ hấp đàn gà số tỉnh phía Bắc Ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Tên sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt Nam I Mục đích nghiên cứu - Phân lập vi khuẩn ORT từ gà mắc bệnh đường hô hấp - Xác định hình thái, tính chất ni cấy, đặc tính sinh hố vi khuẩn ORT - Xác định tính mẫn cảm vi khuẩn với số kháng sinh II Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp quan sát triệu chứng lâm sàng pháp mổ khám - Phương pháp lấy mẫu bảo quản mẫu - Phương pháp nuôi cấy phân lập vi khuẩn - Phương pháp thực phản ứng nhận biết - Phương pháp PCR - Phương pháp kiểm tra khả mẫn cảm kháng sinh chủng vi khuẩn ORT phân lập III Kết thu kết luận đề tài - Bắc Giang tỉnh có số gà mắc bệnh đường hô hấp cao (51,37%) - Giai đoạn gà 3-6 tuần tuổi có tỷ lệ mắc bệnh đường hô hấp cao (49,81%) - Vụ đơng xn có tỷ lệ mắc số bệnh đường hô hấp cao vụ hè thu (46,59% > 44,02) - Triệu chứng bệnh tích chủ yếu gà mắc ORT: sốt, thở gấp, ủ rũ, giảm/bỏ ăn, khó thở, phân lỗng, mặt sưng, phù, gầy, lơng xơ xác, mũi, miệng có nhớt, chậm lớn, giảm tỷ lệ đẻ, trứng méo mó, tập trung chủ yếu gà giai đoạn 3-6 tuần tuổi - Giám định vi khuẩn ORT kĩ thuật PCR: số mẫu dương tính với vi khuẩn ORT chiếm tỷ lệ 45,45% Trong gà – tuần tuần tuổi có tỷ lệ nhiễm cao 54,35%, gà đẻ 41,86% gà thịt có tỷ lệ nhiễm thấp 33,33% - Vi khuẩn ORT phát triển tốt mơi trường thạch Columbia Blood Agar (có bổ sung 5% máu thỏ, 10µg/ml Gentamycin, ni điều kiện 37°C, 5% CO2) Khuẩn lạc nhỏ, to đầu đinh gim, trịn, đục, có mầu xám đến xám trắng, gây dung ix download by : skknchat@gmail.com Kết hình 4.16 cho thấy: môi trường thạch CBA (Colombia Blood Agar) quan sát thấy khuẩn lạc nhỏ đầu đinh ghim, trịn, đục, khơng dung huyết xung quanh, có màu xám tới xám trắng đơi có màu đỏ hung, bờ mặt lồi với bờ rìa rõ ràng Kết phù hợp với nghiên cứu trước công bố (Mohammet Zahra et al., 2013; Võ Thị Trà An cs, 2014) Lựa chọn mẫu có khuẩn lạc điển hình ORT, cấy chuyển sang môi trường tương tự, nuôi cấy điều kiện 37oC, 5% CO2 với thời gian 24 – 48 Kết thu được trình bày bảng 4.9 Bảng 4.9 Kết phân lập vi khuẩn từ mẫu bệnh phẩm theo nhóm gà Số gà thu thập (con) Số mẫu phân lập (mẫu) Số mẫu dương tính (mẫu) Tỷ lệ (%) Gà 3–6 tuần 25 250 187 74,80 Gà thịt 70 25 35,71 Gà đẻ 18 180 89 49,44 Tổng 50 500 301 60,20 Nhóm gà Hình 4.17 Kết phân lập vi khuẩn theo nhóm gà 49 download by : skknchat@gmail.com Hình 4.18 Tỷ lệ phân lập vi khuẩn theo nhóm gà Từ số liệu bảng 4.9 hình 4.17, 4.18 chúng tơi nhận thấy: tổng số 500 mẫu kiểm tra có tới 301 mẫu cho kết dương tính, chiểm tỷ lệ 60,20% Trong đó, gà 3-6 tuần tuổi có 250 mẫu có tới 187 mẫu cho kết dương tính, chiếm tỷ lệ 74,80% Đây nhóm gà có tỷ lệ nhiễm cao phù hợp với nghiên cứu trước cho gà lứa tuổi – tuần có tỷ lệ nhiễm cao Tiếp theo gà đẻ, có 180 mẫu 89 mẫu cho kết dương tính, chiếm tỷ lệ 49,44% Cuối gà thịt có tỷ lệ nhiễm thấp nhất, 70 mẫu kiểm tra có 25 mẫu cho kết dương tính, chiếm 35,71% Để xác định hình thái vi khuẩn ORT, chúng tơi tiến hành chọn khuẩn lạc điển hình mơi trường thạch máu nhuộm gram theo quy trình hướng dẫn nhà sản xuất: Bước 1: Nhỏ dung dịch Crytal violet solution, để phút Bước 2: Rửa nước vòng 10-15 giây Bước 3: Nhỏ dung dịch Lugol’s solution stabilised, để phút Bước 4: Rửa nước vòng giây, vảy khô Bước 5: Nhỏ dung dịch Decorozation solution, để vòng giây Bước 6: Rửa nước vòng 5-10 giây 50 download by : skknchat@gmail.com Bước 7: Nhỏ dung dịch Safranine solution reagens 5, để vòng phút Bước 8: Rửa nước vòng 10-15 giây, vảy khơ tiến hành soi kính độ phóng đại 100 Kết thu được thể thông qua hình 4.19 Hình 4.19: Hình ảnh vi khuẩn ORT kính hiển vi Kết hình 4.19 cho thấy : vi khuẩn ORT phân lập gram âm (bắt mầu đỏ) đa dạng hình thái kiểm tra kính hiển vi Kết phù hợp với nghiên cứu trước cho rằng: ORT phân lập gram âm đa hình thái (Van Empel Hafez, 1999; Chin et al., 2008) 4.2.3 Kết xác định tỷ lệ phân lập vi khuẩn ORT số quan gà mắc bệnh Để xác định quan phận vi khuẩn ORT tập chung nhiều nhất, tiến hành so sánh tỷ lệ dương tính nguồn mẫu Tiến hành lấy 10 loại mẫu bệnh phẩm khác từ quan phận gà có triệu chứng, bệnh tích ORT Kết thể bảng 4.10 51 download by : skknchat@gmail.com Bảng 4.10 Kết phân lập vi khuẩn ORT từ mẫu bệnh phẩm STT Bệnh phẩm Số mẫu xét nghiệm Số mẫu dương Tỷ lệ (mẫu) tính (mẫu) (%) Phổi 50 50 100,00 Khí quản 50 50 100,00 Dịch Swab 50 48 96,00 Túi khí 50 48 96,00 Tuyến tụy 50 26 52,00 Tim 50 24 48,00 Thận 50 19 38,00 Gan 50 15 30,00 Lách 50 11 22,00 10 Ruột 50 10 20,00 Tổng 500 301 60,20 Hình 4.20 Tỷ lệ phân lập ORT từ mẫu bệnh phẩm 52 download by : skknchat@gmail.com Kết bảng 4.10 hình 4.20 thấy: số 500 mẫu bệnh phẩm xét nghiệm lấy từ quan phận khác gà mắc bệnh ORT tỉnh Chúng tối xác định 301 mẫu dương tính với vi khuẩn ORT (Phân lập vi khuẩn ORT) Tỷ lệ phân lập vi khuẩn bình quân 60,20% Trong phổi khí quản nơi vi khuẩn tập chung nhiều nhất, chiếm tỷ lệ 100%, dịch Swab túi khí chiếm tỷ lệ 96% Tuyến tụy nơi vi khuẩn tập trung nhiều, chiếm tỷ lệ 52%, tim chiếm 48%, thận chiếm 38%, gan chiếm 30% Cơ quan vi khuẩn tập chung lách chiếm 22% ruột chiếm 20% Kết hoàn toàn phù hợp với chế gây bệnh vi khuẩn ORT, mầm bệnh xâm nhập theo đường hô hấp, sinh trưởng phát triển niêm mạc đường hơ hấp sau đến phổi gây viêm phổi, màng phổi, viêm túi khí Vì phổi, khí quản, túi khí dịch Swab có tỷ lệ phân lập cao so với quan khác Theo kết nghiên cứu vào năm 1981, lần người ta phân lập chủng ORT từ dịch nước mũi, dịch phù mặt, mủ tơ huyết túi khí bị viêm gà tây tuần tuổi phía Bắc nước Đức Bock et al., 1995 tìm thấy vi khuẩn mẫu bệnh phẩm đường hô hấp gia cầm Israel Như thấy gà mắc bệnh vi khuẩn tập chung khí quản, túi khí, phổi, dịch Wsab với tỷ lệ cao có mặt hầu khắp quan với tỷ lệ thấp Kết phân lập vi khuẩn ORT từ mẫu bệnh giúp người chăn ni ý khí lấy mẫu xét nghiệm, nghi gà mắc ORT nên tập chung lấy mẫu phổi, khí quản, dịch Swab túi khí cho kết xác cao nhanh chóng có biện pháp phịng chữa trị bệnh vi khuẩn ORT gây ra, giảm thiệt hại cho người chăn nuôi 4.3 KẾT QUẢ GIÁM ĐỊNH MỘT SỐ ĐẶC TÍNH SINH HĨA CỦA VI KHUẨN ORT PHÂN LẬP ĐƯỢC TRÊN GÀ Mỗi loại vi khuẩn có đặc tính sinh học khác như: đặc tính sinh hóa, tính chất chuyển hóa loại đường, khả sinh sản hợp chất sinh học trung gian q trình trao đổi chất vào mơi trường ni cấy Các chủng phân lập có khuẩn lạc phù hợp với Ornothobacterium rhinotracheale chọn làm số phản ứng sinh hóa để khẳng định Kết thể hình 4.21 53 download by : skknchat@gmail.com Hình 4.21 Phản ứng catalase ORT Kết hình 4.21 cho thấy, với khuẩn lạc vi khuẩn ORT môi trường CBA cho kết phản ứng Catalase âm tính (ORT khơng lên men Catalase nên chúng khơng có khả phân hủy H2O2 O2 phản ứng khơng tạo bọt) Chọn khuẩn lạc điển hình mơi trường thạch máu, phết lên mặt giấy tẩm sẵn thuốc thử Oxidase, quan sát thấy giấy tẩm chuyển sang màu tím than (ORT cho phản ứng Oxidase dương tính) Kết phù hợp với nghiên cứu trước (Mohammed Zahra et al., 2013; Võ Thị Trà An cs, 2014) Hình 4.22 Hình 4.22: Phản ứng Oxidase ORT Để thử phản ứng Indol, chúng tơi chọn khuẩn lạc điển hình cấy vào mơi trường trypton ủ 37oC, 5% CO2 24 giờ, sau nhỏ thuốc thử Indol vào cho kết âm tính (khơng xuất vịng trịn màu hồng cánh sen) Kết phù hợp với nghiên cứu trước (Alongkorn Amonsin and et al., 1997) Thể hình 4.23 54 download by : skknchat@gmail.com Hình 4.23 Phản ứng Indol ORT Chúng tiếp tục lựa chọn khuẩn lạc điển hình cấy vào canh thang ure (đã chia sẵn ống nghiệm), ủ 37oC, sau 24 – 48 cho kết phản ứng Ure dương tính (mơi trường có mầu tím đỏ) (hình 4.24) Hình 4.24 Phản ứng Urease 55 download by : skknchat@gmail.com Kết thử phản ứng sinh hóa thể bảng 4.11 Bảng 4.11 Kết phản ứng sinh hóa ORT Các phản ứng Tỷ lệ (-) (%) Tỷ lệ (+) (%) 100 100 100 100 100 0 100 0 100 Glucose Lactose 0 100 100 Fructose 100 Oxidase Catalase Indone Urease Gelatinase Succarose Maltose Kết thử bảng 4.11 cho thấy: Phản ứng Oxidase dương tính 100% Phản ứng Catalase âm tính 100% Phản ứng Indone âm tính 100% Phản ứng Urease dương tính 100% 100% số mẫu thử có khả lên men đường loại đường: maltose, glucose, lactose, fructose 100% số mẫu thử khơng có khả lên men đường succarose khơng có khả hóa lỏng gelatinase Như kết trùng khớp với kết nghiên cứu trước Charlton cs., 1993, Hafez cs., 1996 4.4 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TÍNH MẪN CẢM CỦA VI KHUẨN VỚI MỘT SỐ LOẠI KHÁNG SINH Để xác định tính mẫn cảm vi khuẩn ORT với số loại kháng sinh, từ làm sở cho việc đưa phác đồ điều trị có hiệu việc làm cần thiết bối cảnh Vì vậy, sau phân lập giám định chủng vi khuẩn ORT lưu hành tiến hành tăng sinh khuẩn lạc môi trường BHB, ủ 37ºC, 5% CO2 thời gian 24 - 48 Pha loãng canh khuẩn đến nồng độ thích hợp (so với độ đục chuẩn) Tiến hành hút 100µl canh khuẩn cấy láng môi trường Mueller Hinton 56 download by : skknchat@gmail.com chuẩn bị sẵn Đặt loại kháng sinh lựa chọn vào vị trí khác đĩa (đã đánh dấu trước); ủ 37ºC, 5% CO2 thời gian 24 - 48 tiến hành đọc kết Kết kiểm tra mức độ mẫn cảm với loại kháng sinh vi khuẩn ORT phân lập trình bày Bảng 4.12 hình 4.25 Bảng 4.12 Bảng tổng hợp kết thử tính mẫn cảm ORT với số loại kháng sinh Kết STT Tên kháng sinh Số mẫu kiểm tra Số mẫu mẫn cảm Tỷ lệ (%) Số mẫu kháng Tỷ lệ (%) Amoxcicilin/ Clavulanic acid 15 15 100,00 0,00 Ampicillin Tetracycllin Erythromycin Cephalexin Lincomycin Doxycilin 15 15 15 15 15 15 11 15 0 73,33 100,00 60,00 0,00 0,00 0,00 0 26,67 0,00 40,00 100,00 100,00 100,00 Hình 4.25 Tỷ lệ mẫn cảm tỷ lệ kháng vi khuẩn ORT với số loại kháng sinh Kết bảng 4.12 hình 4.25 cho thấy: tổng số 15 mẫu ORT phân lập kiểm tra, mức độ mẫn cảm với loại kháng sinh Amoxicillin/ 57 download by : skknchat@gmail.com lavulanic acid Tetracycline chiếm tỷ lệ 100% (15/15 mẫu); kết phù hợp với nghiên cứu trước (Võ Thị Trà An cs, 2014) Tiếp đến loại kháng sinh Ampicillin chiếm tỷ lệ 73,33% (11/15 mẫu) Erythromycine kháng sinh chuyên điều trị bệnh đường hô hấp; thời điểm kiểm tra, tỷ lệ kháng thuốc giảm xuống khoảng 60% (9/15 mẫu) Riêng loại kháng sinh Cephalexin, Lincomycine Doxycycline có tỷ lệ mẫn cảm thấp (0%) Hiện tượng giải thích sau: loại kháng sinh sử dụng thường xuyên thời gian dài trại nói chung hộ gia đình nói riêng để điều trị bệnh nhiễm khuẩn nói chung gây Vì vậy, gây tượng kháng thuốc chủng vi khuẩn kiểm tra chủng vi khuẩn kiểm tra thu nạp plasmid kháng thuốc tượng truyền ngang loài vi khuẩn khác gây nên Với kết thu phịng thí nghiệm nghiên cứu đưa khuyến cáo cho cán thú y sở: Amoxicillne Tetracycline hai loại kháng sinh đặc hiệu dùng q trình điều trị với vi khuẩn ORT (ngồi sử dụng kháng sinh Erythromycine để điều trị trường hợp gà bị nhiễm vi khuẩn ORT) Tuy nhiên, cần có chiến lược biện pháp cụ thể để hướng dẫn người chăn nuôi chủ trang trại sử dụng kháng sinh có ý thức thận trọng, tránh tượng vi khuẩn kháng đồng thời với nhiều loại kháng sinh khác Có vậy, việc sử dụng kháng sinh điều trị bệnh đem lại hiệu cao mong đợi Hình 4.26 Kết kiểm tra tính mẫn cảm vi khuẩn ORT loại kháng sinh thạch 1) Kháng sinh Lincomycine; 2) Amoxicilln/Clavulanic acid; 3) Ampicillin; 4) Tetracycllin; 5)Cephalexin; 6) Doxycycline 7) Erythromycin 58 download by : skknchat@gmail.com Kết hình 4.26 cho thấy: loại kháng sinh Amoxicilln/Clavulanic acid Tetracycllin có vịng trịng vơ khuẩn lớn (khả mẫn cảm vi khuẩn ORT với loại kháng sinh lớn nhất) Tiếp theo kháng sinh Ampicillin vòng tròn vơ khuẩn lớn; bên vịng trịn khơng trong/thuần (không phát thấy khuẩn lạc mọc bên vịng trịn vơ khuẩn) Cuối kháng sinh Erythromycin; có vịng trịn vơ khuẩn nhỏ bên vịng trịn vơ khuẩn khơng phát thấy khuẩn lạc mọc (kích thước vịng vơ khuẩn đạt ngưỡng mẫn cảm mẫn cảm yếu) Ba loại kháng sinh lại: Cephalexin, Lincomycine Doxycycline bị vi khuẩn ORT kháng lại (khuẩn lạc phát triển bình thường xung quanh kháng sinh) 59 download by : skknchat@gmail.com PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1 KẾT LUẬN 1) Tình hình mắc bệnh đường hơ hấp đàn gà nói chung tình hình mắc bệnh ORT nói riêng tỉnh Hà Nội, Bắc Ninh, Bắc Giang Và Hưng Yên từ tháng năm 2015 đến tháng năm 2016 - Bắc Giang tỉnh có số gà mắc số bệnh đường hô hấp cao chiếm tỷ lệ 51,37%; gà mắc nghi mắc bệnh ORT chiếm tỷ lệ cao 14,14% - Gà giai đoạn 3-6 tuần có tỷ lệ mắc số bệnh đường hô hấp cao (49,81%), gà đẻ (46,06%) gà thịt có tỷ lệ nhiễm thấp (40,38%) - Vụ đơng xn có tỷ lệ mắc số bệnh đường hô hấp cao vụ hè thu (46,59% > 44,02%) - Triệu chứng gà mắc ORT: vật sốt, khó thở, giảm bỏ ăn, vật gầy, lơng xơ xác, miệng mũi có dịch nhớt, mặt sưng, phù, giảm đẻ, trứng méo mó - Bệnh tích chủ yếu gà mắc bệnh ORT tập chung khí quản, phổi, túi khí mặt 2) Kết phân lập vi khuẩn ORT - Bằng kĩ thuật PCR cho kết dương tính vi khuẩn ORT chiếm tỷ lệ 45,45% Trong gà – tuần tuổi có tỷ lệ dương tính cao 54,35%, gà đẻ 41,86% gà thịt có tỷ lệ dương tính thấp 33,33% - Vi khuẩn ORT phát triển tốt mơi trường thạch Columbia Blood Agar (có bổ sung 5% máu thỏ, 10µg/ml Gentamycin, ni điều kiện 37°C, 5% CO2) Khuẩn lạc nhỏ, to đầu đinh gim, trịn, đục, có mầu xám đến xám trắng, gây dung huyết yếu không gây dung huyết - Kết phân lập: tổng số 500 mẫu kiểm tra có tới 301 mẫu cho kết dương tính, chiểm tỷ lệ 60,20% Trong đó, gà 3-6 chiếm tỷ lệ 74,80, gà đẻ chiếm tỷ lệ 49,44% Cuối gà thịt chiếm 35,71% - Tiến hành phân lập vi khuẩn quan (bộ phận) cho thấy: phổi khí quản nơi tập chung nhiều vi khuẩn với tỷ lệ 100%, dịch Swab túi khí (96%), tuyến tụy (52%), tim (48%), thận (38%), gan (30%) 60 download by : skknchat@gmail.com thấp lách (22%) ruột (20%) 3) Kết giám định số đặc tính sinh hóa vi khuẩn ORT phân lập gà - Các chủng ORT phân lập mang đầy đủ đặc tính sinh học vi khuẩn ORT tài liệu nước mơ tả trước đó: Indol (-), Oxydase (+), Catalase (-), Urease (+), có khả lên men đường loại đường: maltose, glucose, lactose, fructose khơng có khả lên men đường succarose khơng có khả hóa lỏng gelatinase 4) Kết xác định tính mẫn cảm vi khuẩn với số loại kháng sinh - Vi khuẩn ORT có tính mẫn cảm cao với kháng sinh Amoxicillin/Clavulanic acid Tetracycline chiếm tỷ lệ 100%; tiếp đến Ampicillin chiếm tỷ lệ 73,33%; vi khuẩn ORT không mẫn cảm với kháng sinh: Cephalexin, Lincomycine Doxycycline (đặc biệt Gentamycine)(100% khơng có giá trị trình điều trị) 5.2 KIẾN NGHỊ 1) Đây đề tài mới, nghiên cứu bệnh hoàn toàn Việt Nam Tuy nhiên, bệnh vi khuẩn ORT gây gà dễ nhầm với bệnh đường hơ hấp khác: Mycoplasma, viêm khí quản truyền nhiễm, CRD Vì vậy, cần có nghiên cứu sâu tượng đồng nhiễm lại bệnh khác nhằm tìm biện pháp chẩn đốn phân biệt hữu hiệu giúp người chăn ni q trình phòng, trị bệnh đàn gà 2) Hiện nay, việc lạm dụng loại thuốc kháng sinh chăn nuôi diễn phổ biến Vì vậy, cần có chiến lược sử dụng kháng sinh cho hiệu q trình điều trị bệnh gà nói chung bệnh đường hô hấp gà nói riêng 3) Cho đến nay, Việt Nam chưa có văc xin phịng bệnh ORT cho đàn gà Vì vậy, cần có nghiên cứu chun sâu đặc tính sinh học, sinh học phân tử để từ làm sở cho việc sản xuất chế phẩm sinh học văc xin phòng bệnh ORT Việt Nam 61 download by : skknchat@gmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Bùi Thị Tho, Nghiêm Thị Anh Đào (2005) Giáo trình dược lý Thú y Nhà xuất Hà Nội tr 20-37 Nguyễn Thị Lan, Nguyễn Vũ Sơn, Nguyễn Hữu Nam, Nguyễn Thị Hoa Lê Văn Năm (2014) Bệnh Orninobacterium rhinotracheale (ORT) gà thơng tin để chẩn đốn, phịng trị bệnh (bài tổng hợp) Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 21(5) tr 77- 83 Nguyễn Bá Hiên, Huỳnh Thị Mỹ Lệ, Lê Văn Lãnh, Đỗ Ngọc Thúy (2012) Giáo trình bệnh truyền nhiễm Thú Y tr 398-425 Hồ Văn Năm (1982) Giáo trình chẩn đốn bệnh khơng lây gia súc Nhà xuất Nơng nghiệp Hà Nội tr 82-84 Vũ Triệu An (2006) Đại cương sinh lý bệnh gia súc Nhà xuất Y học Hà Nội tr 95-102 Võ Thị Trà An Nguyễn Thị Bích Liên, Trần Thị Ngọc Hân, Hồ Quang Dũng Niwwat Chansiripornchai (2014) Nhận dạng, phân lập xác định mước độ mẫn cảm kháng sinh vi khuẩn Orninobacterium rhinotracheale gà Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, 21(7) tr 23-27 Tiếng Anh: Alongkorn A., F X James, Wellehan, L.L Ling, P Vandamme, C Lindeman, M Edman, A Robert, Robison and V Kapur (1997) MolecularEpidemiology of Orithobacterium rhinotracheale Journal of Clinical Microbiology 35(11) pp 2894-2898 Bock R., P Fewidlin, S Tomer, M Manoim, A Inbar, A Frommar, P Vandamme, P Wilding and D Hickson (1995) Orithobacterium rhinotracheale (ORT) associater with a new turkry respiratory tract infectious agent Proe 33 rd Annual Convention of the Israel Branch of the World Veterinary Association pp 43-45 Charlton B R., S E Channing-Santiago, A A Bickford, C J Cardona, R P Chin, G L Cooper, R Droual, J.S Jeffrey, C.U Meteyer, H.L Shivaprasad and R Walker (1993) Preliminary characterization of a pleomorphic gram-negative rod assciated with avian respiratory disease J Vet Diagn Invest pp 47-51 10 Ferreri M., M Zahra, R Alkasir, T Yin and B Han (2013) Isolation and characterization of small-colony variants of Orithobacterium rhinotracheale 62 download by : skknchat@gmail.com Journal of Clinical Microbiology, 51(10) pp 3228-3236 11 Hafez H M (1996) Current status on the role of Orithobacterium rhinotracheale (ORT) in respiratory disease complexes in poultry Arch Gefluă gelkd 60 pp 208-211 12 Hafez H M (1994) Respiratory disease conditions in meat turkeys caused by Orithobacterium rhinotracheale: clinical signs, di-agnostics and therapy Proc West Poult Dis Conf 43 pp 113-114 13 Hinz K H., C Blome and M Ryll (1994) Acute exudative pneumonia and airsacculitis associated with Orithobacterium rhinotracheale in turkeys Vet Rec 135 pp 233-234 14 Karrimi V., M Hassanzadeh, N Fallah and I Ashrafi (2010) Molecular characterization of Orithobacterium rhinotracheale isolated from broiler chicken flocks in Iran Turk J Vet Anim Sci., 34(4) pp 526-530 15 Spenger, S J., A Back, D P Show, K V Nagaraja, D C Roepke, and D A Halvorson (1998) Orinobacterium rhinotracheale infection in turkeys: experimental reproduction of disease Avian Dis 42.pp 154-161 16 Van Empel P., H Van den Bosch, D Goovaerts and P Storm (1998) Experimental infection in turkeys and chickens with Orithobacterium rhinotracheale Avian Dis 40 pp 858-864 17 Van Empel P and Hafez H (1999) Ornithobacterium rhinotracheale: a review Avian Pathology, 28.pp 217-227 18 Vandamme P., P Segers, M Vancanneyt, K Van Hove, R Mutters, J Hommez, F D17ewhirst, B Paster, K Kerters, E Falsen, L.A Devriese, M Bisgaard, K.H Hinz and W Mannheim (1994) Orithobacterium rhinotracheale gen nov., sp nov., isolated from the avian respiratory tract Int J Syst Bacteriol 44 pp 24-37 19 Walters J., R Evans, T LeRoith, N Sriranganathan, A McElroy and F.W Pierson (2014) Experimental Comparison of Hemolytic and Nonhemolytic Ornithobacterium rhinotracheale Field Isolates In Vivo; Avian Diseases, 58(1) pp 78-82 20 Wyffels, R & Hommez, J (1990) Pasteurella anatipestifer isolated from respiratory lesions in partridges kept in captivity (Perdix perdix) Vlaams Diergeneeskundi g Tijdschrift, 59 pp 105-106 21 Zahra M., M Ferreri, R Alkasir and J Yin (2013) Isolation and characterization of small-colony variants of Orithobacterium rhinotracheale J Clin Microbiol 51(10) pp 3228-36 63 download by : skknchat@gmail.com ... skknchat@gmail.com ? ?Phân lập khảo sát số đặc tính sinh học vi khuẩn Ornithobacterium rhinotracheale gây bệnh hô hấp đàn gà số tỉnh phía Bắc? ?? 1.2 MỤC TIÊU CỦA NGHIÊN CỨU - Phân lập vi khuẩn ORT từ gà mắc bệnh. .. Tên luận văn: Phân lập khảo sát số đặc tính sinh học vi khuẩn Ornithobacterium rhinotracheale gây bệnh hô hấp đàn gà số tỉnh phía Bắc Ngành: Thú y Mã số: 60 64 01 01 Tên sở đào tạo: Học vi? ??n Nông... vi khuẩn ORT kĩ thuật PCR + Nuôi cấy phân lập vi khuẩn ORT + Xác định tỷ lệ phân lập vi khuẩn ORT số quan gà mắc bệnh 3) Giám định số đặc tính sinh học vi khuẩn ORT 4) Xác định tính mẫn cảm vi