NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VÀ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHITINASE CỦA VI KHUẨN Bacillus thuringiensis

56 Lê Thị Mai, Lê Vũ Khánh Trang, Cáp Kim Cương, Lê Quang Trường, Nguyễn Thị Huyền Trang NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN VÀ KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TỚI KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP CHITINASE CỦA VI KHUẨN Bacillus thuringiensis STUDY ON SELECTION OF CHITINASE – PRODUCING Bacillus thuringiensis AND SURVEY THEIR CHITINASE BIOSYNTHESIS AFFECTING FACTORS Lê Thị Mai1, Lê Vũ Khánh Trang1, Cáp Kim Cương2, Lê Quang Trường1, Nguyễn Thị Huyền Trang1 Trường Đại học Sư phạm – Đại học Đà Nẵng; ltmai_smt@ued.udn.vn, lvkhanhtrang @ued.udn.vn, letruongqb198@gmail.com, huyentrang16cnsh@gmail.com Trường Đại học Quốc gia Kangwon, Hàn Quốc; kimcuong.cap@gmail.com Tóm tắt - Nghiên cứu tiến hành với mục đích tìm chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis có hoạt tính chitinase mạnh làm sở khoa học cho việc sản xuất chế phẩm chitinase ứng dụng phòng trừ bệnh hại trồng Từ 25 mẫu đất hợp tác xã Túy Loan, huyện Hòa Vang, Tp Đà Nẵng, phân lập chủng vi khuẩn Bacillus sp có hoạt tính sinh tổng hợp chitinase (T1, T2 T3) Trong đó, chủng T3 có khả sinh tổng hợp chitinase mạnh Kết định danh phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA cho thấy, chủng T3 có độ tương đồng 99,86% với lồi Bacillus thuringiensis SRG2 Hoạt tính chitinase cao chủng T3 tìm thấy mơi trường ni cấy sau 48h với nguồn nitơ pepton, cacbon lactose, pH = Các dạng chitin (chitosan, gel chitin, vỏ tôm) bổ sung vào môi trường nuôi cấy ảnh hưởng không đáng kể đến khả sinh tổng hợp chitinase chủng T3 Abstract - The study is conducted with the aim of finding Bacillus thuringiensis with the highest chitinase activity and optimal conditions for chitinase biosynthesis for the chitinase production in application for plant diseases control From 25 soil samples collected from Tuy Loan, Hoa Vang district, Da Nang city, we have isolated strains of Bacillus thuringiensis with chitinase activity (T1, T2 and T3) Among them, T3 strain has the highest chitinase activity The result of identification by sequencing 16S rRNA shows that, the T3 strain has 99.86% similarity to Bacillus thuringiensis SRG2 The highest chitinase activity of T3 strain is obtained after 48h culture in medium containing peptone and lactose as nitrogen and carbon source respectively, pH = 7, The different forms of chitin (chitosan, colloidal chitin, shrimp shells) supplemented to the culture medium not significantly affect the ability of chitinase activity of T3 strain Từ khóa - Bacillus thuringiensis; chitinase; tinh thể độc; enzyme; bào tử Key words - Bacillus thuringiensis; chitinase; toxic crystal; enzyme; spore Đặt vấn đề Phân giải chitin phương pháp sinh học, sử dụng enzyme chitinase quan tâm rộng rãi an tồn, sản phẩm phụ so với phương pháp hóa học Những sản phẩm phân giải từ chitin có tiềm lớn y học, nguyên liệu điều chế số dược phẩm quý chữa trị bệnh: Viêm khớp, viêm phổi, viêm sưng dày, chống nhiễm trùng…, Oligo N-acetylDglucosamine – sản phẩm tạo từ chitin cịn có khả chống khối u, kháng nấm kháng vi khuẩn [1] Bên cạnh đó, có nhiều ứng dụng to lớn enzyme nhiều lĩnh vực khác thu nhận tế bào trần, sản xuất chitooligosaccharides, glucosamine, sản xuất thuốc trừ sâu sinh học kiểm sốt nấm kí sinh trồng [2] Chitinase tách chiết từ nhiều nguồn khác động vật, thực vật vi sinh vật Quy trình thu nhận chitinase từ động vật, thực vật phức tạp, giá thành cao đáp ứng nhu cầu thực tế Trong đó, vi sinh vật nguồn quý giá vơ tận để thu nhận chitinase Trong tự nhiên, có nhiều lồi vi khuẩn có khả sinh chitinase, phải kể đến Bacillus thuringiensis (Bt), tác nhân kiểm soát sinh học quan tâm nghiên cứu Bt lồi vi khuẩn gram dương có khả sản xuất protein diệt côn trùng gọi protein tinh thể (Cry) Tinh thể Cry độc tố hình thành lỗ gây chết tế bào chế khác [3] Nhiều nghiên cứu báo cáo chitinase phát chủng Bt [4], [5] Trong q trình diệt trùng, chitinase Bt sinh tổng hợp góp phần đục thủng hàng rào màng peritrophic, để tạo điều kiện cho xâm nhập protein Cry vào màng biểu mô gây chết tế bào côn trùng [3] Tại Việt Nam có nhiều nghiên cứu chủng vi sinh vật có khả sinh tổng hợp chitinase, nhiên nghiên cứu khả sinh tổng hợp chitinase từ vi khuẩn Bt cịn hạn chế Vì vậy, việc tuyển chọn chủng vi khuẩn Bt có hoạt tính chitinase khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp chitinase chúng cần thiết Phương pháp nghiên cứu 2.1 Phương pháp lấy mẫu Thu 25 mẫu đất từ hợp tác xã Túy Loan, huyện Hòa Vang, Tp Đà Nẵng Mỗi mẫu thu cách gạt bỏ lớp đất mặt khoảng 2–3 cm, lấy lớp đất phía tùy loại trồng canh tác mà độ sâu lấy mẫu khác từ 5–20 cm Sau đó, mẫu lưu trữ lọ vơ trùng kín 4◦C phân tích 2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn Tiến hành pha loãng mẫu đất nước muối sinh lý NaCl 0,9% đến 10-10 Loại bỏ tế bào sinh dưỡng vi sinh vật khác cách tiến hành gia nhiệt bể ổn nhiệt 80◦C 10 phút Hút 100µl dịch pha lỗng cấy trải mơi trường Luria Bertani (LB): Cao nấm men 5g/l; Tryptone 10g/l; NaCl 5g/l; pH - 7,2 Sau đó, chuyển đĩa vào ủ 37◦C 24 Chọn khuẩn lạc đặc trưng cho Bacillus thuringiensis, tiến hành nhuộm Gram, nhuộm Coomassie brilliant blue phút để quan sát hình dạng tế bào, tinh thể bào tử [6] 2.3 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis có hoạt tính chitinase cao Tiến hành xác định hoạt tính chitinase phương pháp cấy chấm điểm [7] thực môi trường LB bổ ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, VOL 18, NO 11, 2020 sung 0,5% dịch huyền phù chitin Sau ngày nuôi cấy xác định khả phân giải chitin cách nhuộm với dung dịch Lugol 1% 2.4 Phương pháp xác định vi khuẩn tuyển chọn Vi khuẩn Bacillus thuringiensis giả định có hoạt tính chitinase mạnh định danh sơ đặc điểm sinh lý, sinh hóa Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn tuyển chọn tiến hành theo phương pháp theo Claus Berkeley [8] với phép thử sinh hóa Oxidase, Catalase, Voges Proskauer (VP), khả sử dụng Citrate, khả phân giải Gelatin, khả sử dụng loại đường glucose, sucrose, đặc điểm sinh trưởng 5◦C, 42◦C nồng độ 10% NaCl Sau đó, tiến hành định danh phương pháp giải trình tự vùng gen 16S rRNA [9] Ni cấy thu sinh khối vi khuẩn môi trường LB máy lắc 180 vòng/phút 16 Tách chiết DNA tổng số, khuếch đại vùng gen 16S rRNA phản ứng PCR, sản phẩm PCR tinh chế gửi giải trình tự Cơng ty TNHH MTV Sinh hóa Phù Sa (Cần Thơ) Sử dụng cơng cụ BLAST website NCBI để tìm kiếm trình tự tương đồng cho kết 2.5 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng số điều kiện ni cấy đến hoạt tính chitinase chủng vi khuẩn tuyển chọn Tiến hành nuôi cấy vi khuẩn tuyển chọn môi trường (LB) với tỷ lệ tiếp giống 7%, pH = 7, nhiệt độ 37◦C, tốc độ lắc 200rpm Tiến hành khảo sát điều kiện nuôi cấy ảnh hưởng đến hoạt tính chitinase bao gồm: Thời gian ni cấy: Thu dịch enzyme thô sau 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 72 Nguồn nitơ: Các nguồn nitơ bao gồm pepton, Ure, NaNO3, (NH4)2SO4 nồng độ 0,5% (w/v) sử dụng thay cho Tryptone môi trường LB Nguồn carbon: Các nguồn carbon: glucose, lactose, saccharose, mantose nồng độ 0,5% (w/v) bổ sung cho nguồn carbon môi trường LB pH: Khảo sát pH là: 6, 7, 8, Cơ chất chitin: Khảo sát dạng chitin bao gồm chitosan, bột vỏ cua, gel chitin với nồng độ bổ sung 5g/lit Hoạt tính chitinase định tính theo phương pháp khuếch tán đĩa thạch Tiến hành ly tâm dịch ni cấy 6.000 vịng/phút 15 phút để thu phần dịch (enzyme thô) Đĩa thạch chứa chất chitin huyền phù 0,5% đục lỗ đường kính 0,8 cm Mỗi giếng nhỏ 100 µl dịch enzym thơ để - tiếng 4ºC để enzym khuếch tán vào thạch Sau chuyển đĩa vào ủ 37ºC, 14 – 16 lấy nhuộm dung dịch Lugol 1% [5], [10] 2.6 Phương pháp xử lý số liệu Các thí nghiệm lặp lại ba lần lấy giá trị trung bình Số liệu thực nghiệm xử lý thống kê sử dụng phần mềm Microsoft excel Kết nghiên cứu thảo luận 3.1 Kết phân lập chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis Sau thu 25 mẫu đất hợp tác xã Túy Loan, huyện 57 Hịa Vang, Tp Đà Nẵng, nhóm tác giả tiến hành tuyển chọn chủng Bacillus thuringiensis theo phương pháp Traves [6] Dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc ni 37◦C mơi trường LB 48 quan sát hình dạng tế bào, tinh thể bào tử nhuộm với Coomassie brilliant blue theo phương pháp Fadel [11], thu chủng vi khuẩn kí hiệu từ T1 đến T4, có 03 chủng khả Bacillus thuringiensis (T1, T2 T3) (Bảng 1) Bảng Đặc điểm hình thái khuẩn lạc số đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn phân lập 37 oC Kí hiệu Hình thái khuẩn lạc chủng (KL) Hình thái tế bào T1 KL màu trắng sữa, có núm giữa, viền lan rộng, nhìn nghiêng bề mặt sần sùi Hình que, xếp thành chuỗi, bào tử tâm, tinh thể hình cầu + + T2 KL có màu trắng sữa, Hình que, xếp riêng lõm lớn, viền lẻ, bào tử tâm, + lan rộng trịn nhăn tinh thể hình cầu + T3 KL màu trắng đục, trịn đều, có ria nhỏ tỏa đều, nhầy Hình que, xếp riêng lẻ, bào tử tâm, + tinh thể hình cầu hình trám + T4 KL màu vàng nhạt, trịn đều, có nhầy Hình que, không sinh bào tử - Bào Tinh tử thể - Ghi chú: (+) kết dương tính; (-) kết âm tính Kết thể Bảng nhận thấy, chủng thuộc chi Bacillus có diện tinh thể độc Những chủng vi khuẩn có đặc điểm giống với vi khuẩn Bacillus thuringiensis cơng bố, là: Khuẩn lạc màu trắng, bề mặt nhăn khơng, có viền lan rộng; Tế bào có dạng hình que, đầu tù, bào tử hình trứng tâm; Tinh thể có hình lưỡng tháp, hình lập phương hình cầu [9] 3.2 Kết tuyển chọn chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis có khả sinh enzyme chitinase Từ chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis giả định phân lập, tiến hành thu dịch enzyme vi khuẩn xác định hoạt tính phân giải chitin theo phương pháp cấy chấm điểm Kết trình bày Bảng Hình Bảng Kết thử hoạt tính chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis giả định Kí hiệu chủng Đường kính vịng phân giải Mức độ hoạt tính (D - d) mm T1 11,0 ± 1,08 Trung bình T2 15,5 ± 1,75 Trung bình T3 20,0 ± 1,01 Mạnh Kết Bảng Hình cho thấy, chủng Bacillus thuringiensis giả định có khả sinh tổng hợp enzyme chitinase Tuy nhiên, chủng T3 có khả phân giải chitin mạnh nhất, đường kính vịng phân giải 20 ± 1,01mm Dựa vào kết sàng lọc trên, nhóm tác giả chọn chủng vi khuẩn T3 có hoạt tính chitinase cao để tiến hành thí nghiệm Nếu so sánh với kết Trịnh Thị Thu Hà, hoạt tính chủng T3 thấp hơn, chủng Bt MSS1.1 có hoạt tính chitinase đạt 29mm [12] Lê Thị Mai, Lê Vũ Khánh Trang, Cáp Kim Cương, Lê Quang Trường, Nguyễn Thị Huyền Trang 58 hành khảo sát đặc tính sinh lý sinh hóa chủng T3 Đặc điểm sinh học chủng vi khuẩn tuyển chọn tiến hành theo phương pháp theo Claus Berkeley [8] T Kết Bảng cho thấy, T3 có phản ứng dương tính liên quan đến xét nghiệm catalase, phản ứng VP, có khả di động, khả T2 T3 phân giải gelatin, có khả T1 sử dụng citrate loại đường glucose, sucrose, T2 lactose làm nguồn cacbon Vi khuẩn T3 tăng trưởng 42°C không sinh trưởng 5°C T phát triển mơi trường có chứa NaCl 10%, đặc điểm để phân biệt loài B thuringiensis với loài B cereus Như vậy, với đặc điểm sinh hóa chủng T3, dựa vào khóa phân loại Claus Berkeley [8], khẳng định sơ T3 Bacillus T3 thuringiensis Hình Vịng phân giải chitin enzyme chitinase Để định danh xác chủng T3, nhóm tác giả gửi sản chủng T1,T2, T3 phẩm khuếch đại đọc trình tự Công ty TNHH MTV Sinh 3.3 Kết định danh chủng T3 hóa Phù Sa (Cần Thơ) thu kết sau: Trình tự Các chủng Bacillus thuringiensis đặc trưng tương đồng 99,86% với loài Bacillus thuringiensis SRG 2, diện protein tinh thể Tuy nhiên, để phân biệt cho phép kết luận chủng T3 loài Bacillus thuringiensis Bacillus thuringiensis Bacillus cereus nhóm tác giả tiến (Phụ lục 1) Bảng Kết thử nghiệm sinh hóa chủng T3 Oxidase Catalase + + Khả sử dụng Glucose Sucrose Lactose + + + Điều kiện sinh trưởng Citrate 5◦C 42◦C NaCl 10% Phân giải gelatin VP Di động + - + - + + + Ghi chú: (+) kết dương tính; (-) kết âm tính hoạt tính chitinase cao 314 U/ ml 355 U/ml Sự khác biệt giải thích chủng T3 có thời gian sinh trưởng ngắn so với chủng vi sinh vật khác 20 18 18 16 16 14 14 12 12 10 10 8 6 Mật số tế bào ( log CFU/m1) 3.4 Ảnh hưởng thời gian ni cấy đến hoạt tính chitinase chủng vi khuẩn tuyển chọn Để xác định thời gian thích hợp thu nhận chitinase cần phải tiến hành khảo sát thời gian nuôi cấy Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hoạt tính chitinase chủng vi khuẩn T3 thể Hình Kết nghiên cứu cho thấy, điều kiện nuôi cấy tĩnh, vi khuẩn T3 sinh trưởng, phát triển mạnh 48h nuôi cấy, tế bào vào pha cân sau 48h, mật độ tế bào đạt 1,7.10 ± 0,05 CFU/ml Đây thời điểm ghi nhận hoạt tính chitinase chủng T3 mạnh với đường kính vịng phân giải đạt 18,1 ± 1,01mm Sau 60h nuôi cấy, mật độ tế bào giảm sau 72h, mật độ tế bào đạt 9.108 ± 0,03 CFU/ml, đồng thời hoạt tính enzyme giảm mạnh, đường kính vịng phân giải thu 7,3 ± 0,4 mm Kết nghiên cứu tương đồng với nghiên cứu Chanpen Wiwat khảo sát tăng trưởng sản xuất chitinase B thuringiensis ssp kurstaki HD-1 (G) thấy rằng, hoạt tính chitinase cao sau ngày nuôi cấy (19,3 mU / ml) giảm sau ni cấy thêm [13] Điều giải thích, vào pha suy vong thiếu chất dinh dưỡng, chất độc hại tạo làm bất hoạt enzyme lysosome tế bào giải phóng enzyme phân giải bào quan tế bào dẫn tới giảm suất enzyme [14] Nghiên cứu M Liu cs [4] có khác biệt, chủng Bacillus thuringiensis T13003 T04A001 có hoạt động chitinase xuất vào lúc đến 10 giờ, lúc bắt đầu sinh bào tử tăng dần toàn giai đoạn bào tử Các hoạt động chitinase tối đa phát sau 72 nuôi cấy, tương ứng với giai đoạn giải phóng bào tử, với 4 2 Đường kính phân giải CFU/ml 24h 36h 48h 60h 72h Hình Ảnh hưởng thời gian ni cấy đến hoạt tính chitinase chủng vi khuẩn T3 3.5 Ảnh hưởng nguồn nitơ bổ sung môi trường nuôi cấy đến hoạt tính chitinase chủng vi khuẩn T3 Bản chất enzyme protein Vì nguồn nitơ có ảnh hưởng sâu sắc đến trình sinh tổng hợp enzyme tiền chất cuối sinh tổng hợp protein Nguồn nitơ ảnh hưởng đến độ pH môi trường nuôi cấy, ảnh hưởng đến hoạt động tính ổn định enzyme [15] Kết khảo sát ảnh hưởng nguồn nitơ bổ sung mơi trường ni cấy đến hoạt tính chitinase chủng vi khuẩn T3 ghi nhận Bảng Hình ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, VOL 18, NO 11, 2020 Bảng Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh tổng hợp enzyme chitinase chủng T3 Nguồn nitơ Peptone Ure NaNO3 (NH4)2SO4 Đường kính phân giải (mm) 20,3 ± 2,3 15,5 ± 1,75 11,2 ± 1,58 9,2± 0,58 Peptone Mức độ hoạt tính Mạnh Trung bình Trung bình Yếu Ure 59 lượt 0,78; 0,74 0,69 U/ml [12] 3.6 Ảnh hưởng nguồn carbon bổ sung mơi trường ni cấy đến hoạt tính chitinase chủng vi khuẩn T3 Kết khảo sát ảnh hưởng nguồn carbon đến khả sinh tổng hợp enzyme chitinase chủng T3 ghi nhận Bảng Qua kết Bảng cho thấy, Lactose Mantose làm tăng hoạt tính phân giải chitin chủng T3, đường kính vịng phân giải chitin 19mm ± 0.58 16mm ± 0,41 Kết trùng hợp với nghiên cứu Eman Zakaria Gomaa [5] sử dụng đường Lactose Mantose cho sản xuất chitinase B thuringiensis, hoạt tính chitinase tương ứng 10 U/ml U/ml Tuy nhiên, theo tác giả khả sinh enzyme Bacillus thurgiensis tìm 2SO4 thấy trongNaNO môi trường gel chitin(NH sửa4)đổi với galactose cao (16,02 U/ml) Bảng Ảnh hưởng nguồn carbon đến khả sinh tổng hợp chitinase chủng T3 Mức độ hoạt tính Lactose Đường kính phân giải (mm) 19,5 ± 0,58 Mantose 16,3 ± 0,41 Trung bình Saccharose 11,3 ± 0,41 Trung bình Glucose 11,2 ± 1,86 Trung bình Nguồn Carbon NaNO3 (NH4)2SO4 Hình Đường kính vịng phân giải chitin chủng T3 nguồn nitơ Kết Bảng Hình cho thấy, mơi trường có nguồn nitơ khác đường kính vịng phân giải chitin chủng T3 khác Nếu sử dụng (NH 4)2SO4 đường kính vịng phân giải nhỏ (9,2 ± 0,58 mm) lượng enzyme sinh không nhiều, khả phân giải chitin không cao Kết trùng hợp với nghiên cứu Abdel- Abdel-Mawgoud AM cs [16] Makkar RS [17] Trong nghiên cứu hai tác giả thấy số chủng Bacillus spp sử dụng (NH4)2SO4 để sinh trưởng phát triển sản xuất chất hoạt động bề mặt; Tuy nhiên, chủng sử dụng NaNO3, NH4NO3 KNO3 Một nghiên cứu khác Trịnh Thị Thu Hà cho thấy sử dụng urê làm nguồn nitơ hoạt tính chitinase thu thấp (đạt 0,47 U/ml) [12] Khi nguồn nitơ hữu vịng phân giải chitin chủng T3 tăng lên Đạt giá trị cao sử dụng 5g peptone, đường kính 20,3 ± 2,3 mm Việc thay peptone cho tryptone giúp giảm chi phí sản xuất giá thành tryptone cao so với peptone Kết hoàn toàn phù hợp với đặc điểm sinh trưởng Bacillus thurgiensis nghiên cứu tương tự Theo Eman Zakaria Gomaa [5], nguồn nitơ hữu giàu axit amin peptide ngắn hỗ trợ sản xuất enzyme Trong nghiên cứu tác giả casein mang lại kết cao sản xuất chitinase B thuringiensis đạt 19,21 U/ml Còn nghiên cứu Trịnh Thị Thu Hà khảo sát ảnh hưởng nguồn nitơ chủng Bt MSS1.1 cho thấy, sử dụng bột đậu tương làm nguồn nitơ hoạt tính chitinase thu cao (đạt 0,87 U/ml), tiếp đến cao nấm men, peptone cao thịt hoạt tính lần Mạnh Theo Trịnh Thị Thu Hà [12], chủng Bt MSS1.1 môi trường sử dụng bột ngơ làm nguồn carbon chính, hoạt tính chitinase đạt cao (0,79 U/ml), cao so với môi trường sở ban đầu sử dụng glucose làm nguồn carbon (hoạt tính đạt 0,71 U/ml) Hoạt tính chitinase sinh thấp (0,56 U/ml) mơi trường có nguồn carbon lactose 3.7 Nghiên cứu ảnh hưởng pH môi trường ni cấy đến hoạt tính chitinase chủng T3 pH môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến số ion chuyển hóa H+ OH- tính thấm màng tế bào vi khuẩn, từ hỗ trợ phát triển tế bào khả sản xuất enzyme Phần lớn vi khuẩn sản xuất chitinase đạt hiệu tối đa nuôi cấy mơi trường trung tính axit yếu [18] Kết khảo sát ảnh hưởng pH môi trường nuôi cấy đến hoạt tính chitinase chủng vi khuẩn T3 ghi nhận Bảng Bảng Ảnh hưởng pH mơi trường ni cấy đến hoạt tính chitinase chủng vi khuẩn T3 Nồng độ pH Đường kính phân giải (mm) Mức độ hoạt tính pH6 11 ± 0.67 Trung bình pH7 21,1 ± 0,72 Mạnh pH8 20 ± 0,38 Mạnh pH9 10,4 ± 1,22 Trung bình Dựa vào Bảng nhận thấy, chủng T3 sinh tổng hợp chitinase thích hợp pH = 7.0 8.0, đường kính vịng phân giải chitin từ 20 ± 0,38 mm đến 21,1 ± 0,72mm Ở pH = pH = 9, hoạt tính enzyme mức trung bình, vịng phân giải từ 10,4 ± 1,22 mm đến 11 ± 0,67mm Kết Lê Thị Mai, Lê Vũ Khánh Trang, Cáp Kim Cương, Lê Quang Trường, Nguyễn Thị Huyền Trang 60 trùng hợp với nghiên cứu Eman Zakaria Gomaa [5] B thuringiensis B licheniformis sinh chitinase tối ưu pH 7.0 8.0 với hàm lượng 1,28 1,20 U/ml Tương tự, Nawani cộng [19] báo cáo pH tối ưu cho sản xuất chitinase Microbispora sp V2 pH Shanmugaiah V cs [20] cho rằng, độ pH tối ưu tương tự 8,0 sản xuất chitinase B pabuli K1 B laterosporus ML2270 Nghiên cứu Trịnh Thị Thu Hà cho kết tương đồng, hoạt tính chitinase chủng Bt MSS1.1 cao thu nhận pH=7 [12] 3.8 Ảnh hưởng dạng chất chitin đến hoạt tính chitinase chủng T3 Ảnh hưởng dạng chất bao gồm chitin thô, gel chitin chitosan tới khả sinh tổng hợp chitinase chủng T3 thể Bảng Bảng Ảnh hưởng dạng chất chitin bổ sung vào mơi trường ni cấy đến hoạt tính chitinase chủng vi khuẩn T3 Các dạng chitin Đường kính phân giải Mức độ hoạt tính (mm) Chitosan 11 ± 0,05 Trung bình Gel chitin 10,2 ± 0,01 Trung bình Bột vỏ cua 9,1 ± 0,08 Yếu Kết Bảng cho thấy dạng chất chitin ảnh hưởng không đáng kể đến khả sinh tổng hợp chitinase chủng T3 Hoạt tính chitinase chủng T3 dao động khoảng 8,5 ± 0,08 mm đến 11 ± 0,01 mm dạng chitin khác Kết tương đồng với nghiên cứu Đặng Thị Hường [21], theo tác giả dạng chitin ảnh hưởng không nhiều đến khả sinh tổng hợp chitinase P oxalicum 20B Hoạt tính chitinase nhận tương đương dao động khoảng 0,062 U/ml đến 0,065 U/ml trình lên men đạt cao thời điểm 120 h Theo Trịnh Thị Thu Hà [12] sử dụng bột chitin làm chất cảm ứng, hoạt độ chitinase chủng Bt MSS1.1 sinh cao đạt 0,67 (U/ml) so với nguồn chitin vỏ tôm (0,43 U/ml), vỏ cua (5,2 U/ml) Trong nghiên cứu Saima cs [22] công bố, số dạng chitin chitin dạng thô, dạng bột dạng gel, chitin dạng gel chất cảm ứng tốt cho sinh tổng hợp chitinase từ Aeromonas hydrophila HS4 từ A.punctata HS6 Theo Kim cs [23] công bố gel chitin chitin dạng bột (kích thước nhỏ 250 µm) cho hoạt tính chitinase cao ngày lên men từ Serratia marcescens QM B1466 Chen cs [24] nghiên cứu sinh tổng hợp chitinnase từ chủng Aeromonas schubertii cho thấy kích thước bột chitin khoảng 30 - 35 µm cho hoạt tính chitinase tương tự nhau, kích thước nhỏ 12µm hoạt tính chitinase nhận lại giảm nhiều Kết luận Từ 25 mẫu đất hợp tác xã Túy Loan, huyện Hòa Vang, Tp Đà Nẵng phân lập chủng vi khuẩn Bacillus sp có diện tinh thể độc có khả sinh tổng hợp chitinase (T1, T2 T3) Trong đó, chủng T3 có khả sinh tổng hợp chitinase mạnh Kết định danh phương pháp giải trình tự gen 16S rRNA cho thấy chủng T3 có độ tương đồng 99,86% với lồi Bacillus thuringiensis SRG2 Hoạt tính chitinase cao chủng T3 tìm thấy mơi trường ni cấy sau 48h với nguồn nitơ pepton, carbon lactose, pH = Các dạng chitin (chitosan, gel chitin, vỏ tôm) bổ sung vào môi trường nuôi cấy ảnh hưởng không đáng kể đến khả sinh tổng hợp chitinase chủng T3 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Kirkham, S.G and R.K Sammarasinghe, “Review article: glucosamine” Orthop Surg (Hong Kong), 2009,17: pp 72-76 [2] Nguyễn Thị Hà, “Tối ưu hóa điều kiện ni cấy chủng nấm Aspergillus protuberus sinh tổng hợp enzyme chitinase phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ”, Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ , 2012, 22b, tr.26-35 [3] Shotaro Honda, Toshiyuki Kunii, Kenta Nohara, Satoshi Wakita, Yasusato Sugahara, Masao Kawakita, Fumitaka Oyama, and Masayoshi Sakaguchi,“Characterization of a Bacillus thuringiensis chitinase that binds to cellulose and chitin”, AMB Express, 2017, (51) [4] M Liu, Q.X Cai, H.Z Liu, B.H Zhang, J.P Yan, Z.M Yuan “Chitinolytic activities in Bacillus thuringiensis and their synergistic effects on larvicidal activity”, Journal of Applied Microbiology, 2002, 93, 374–379 [5] Eman Zakaria Gomaa, “Chitinase production by Bacillus thuringiensis and Bacillus licheniformis: Their potential in antifungal biocontrol”, The Journal of Microbiology, 2012, 50, 103–111 [6] Traves R.S., Martin, P A W., Reichelderfer, C F., “Selective process for efficient isolation of soil Bacillus sp.” Applied Environmental Microbiology, 1987, 53: 1263–1266 [7] Lê Ngọc Tú cộng sự, Enzyme vi sinh vật (tập 1, tập 2), Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật Hà Nội, 1982 [8] Claus, D and Berkeley, R.C.W Genus Bacillus Cohn, 1872 In: Sneath, P.H.A., Mair, N.S., Sharpe, M.E and Holt J.G., Eds., Bergey’s Manual of Systematic Bac-teriology, The Williams & Wilkins Co., Baltimore 2, 1105-1139, 1986 [9] Nguyễn Thiên Phú, Trần Thanh Thủy, “Phân lập tuyển chọn Bacillus thuringiesis từ rừng ngập măn Cần Giờ có hoạt tính diệt sâu (Plutella xylos)” Tạp chí Khoa học Đại học Sư phạm thành phố Hồ Chí Minh, 2013, 51, 49 – 58 [10] Trịnh Thị Hồng, “Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến trình sinh tổng hợp chitinase chủng nấm metarhizium sp phân lập từ xác côn trùng Thanh hóa”, Tạp chí khoa học trường đại học Hồng Đức, 2017, số 35.70- 75 [11] Fadel A Sharif and N Gfirdal Alaeddinoglu, “A rapid and simple method for staining of the crystal protein of Bacillus thuringiensis”, Journal of Industrial Microbiology, 1988, 227 – 229 [12] Trịnh Thị Thu Hà, “Tách dịng, biểu nghiên cứu tính chất Endochitinase từ Bacillus thuringiensis phân lập Việt Nam”, Luận án Tiến sĩ, Viện Công nghệ sinh học, Viện hành lâm khoa học công nghệ Việt Nam, 2018 [13] Chanpen Wiwat, Saranya Thaithanun, Somsak Pantuwatana, and Amaret Bhumiratana, “Toxicity of Chitinase-Producing Bacillus thuringiensis ssp kurstaki HD-1 (G) toward Plutella xylostella”, Journal of Invertebrate Pathology, 2000, 76, 270–277 [14] P.M Kao, P.J Tsai, Y.C Liu, Y.C Chang, Optimization of cultivation conditions for the production of chitinase from Paenibacillus sp CHE-N1, J Chin Inst Chem Eng 37 (2006) 263–355 [15] S Nizamudeen and B.K Bajaj, “Thermo-Alkalitolerant Endoglucanase from Bacillus, Food Technol”, Biotechnol, 2009, 47 (4), 435–440 [16] Abdel-Mawgoud AM, Aboulwafa MM, Hassouna NAH, “Optimized production of Surfactin by Bacillus subtilis isolated BS5”, Biotechnology, 2008, 150 (3) 305-325 [17] Makkar RS, Cameotra SS, “Produces surfactants with a thermophilic Bacillus subtilis strain”, Biotechnology J Ind Microbiol, 1997, 18 37-42 ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, VOL 18, NO 11, 2020 [18] Sharaf EF, “A potent chitinolytic activity of Alternaria alternata isolated from Egyptian lack Sand”, Polish journal of Microbiology, 2005, vol 54, No2, 145 -151 [19] Nawani NN, Kapadnis BP, “Chitin degrading potential of bacteria from extreme and moderate environment”, Indian J Exp Biol, 2003, 41, 248–254 [20] Shanmugaiah V, Mathivanan N, Balasubramanian N, Manoharan PT, “Optimization of culture conditions for production of chitinase by Bacillus laterosporous MML2270 isolated from rice rhizosphere soil”, Afr J Biotechnol, 2008, 7, 2562–2568 [21] Đặng Thị Hường “Nghiên cứu thu nhận N-acetylglucosamine (NAG) chitinase từ Penicillium oxalicum 20B định hướng ứng dụng 61 sản xuất thực phẩm chức năng”, Luận án tiến sỹ, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội, 2017 [22] Saima, M.K., Rooh, I.Z Ahmad, “Isolation of novel chitinolytic bacteria and production optimization of extracellular chitinase” Journal of Genetic Engineering and Biotechnology, 2013 11:pp, 39-46 [23] Kim, K., A.L Creagh, and C.A Haynes Effective Production of NAcetyl-ß-Dglucosamine By Serratia mareescens Using Chitinaeeous Waste Biotechnol.Bioprocess Eng 1998, 3: pp 71-77 [24] Chen, J.K., C.R Sheng, and C.L Liu, “The Characteristics of Chitinase Expression in Aeromonas schubertii”, Appl Biochem Biotechnol, 2014 172: pp, 3827-3834 Phục lục CAGCTTGGGG GGCGTGCTAT ACATGCAAGT CGAGCGAATG GATTAAGAGC TTGCTCTTATGAAGTTAGCG GCGGACGGGT GAGTAACACG TGGGTAACCT GCCCATAAGA CTGGGATAACTCCGGGAAAC CGGGGCTAAT ACCGGATAAC ATTTTGAACC GCATGGTTCG AAATTGAAAGGCGGCTTCGG CTGTCACTTA TGGATGGACC CGCGTCGCAT TAGCTAGTTG GTGAGGTAACGGCTCACCAA GGCAACGATG CGTAGCCGAC CTGAGAGGGT GATCGGCCAC ACTGGGACTGAGACACGGCC CAGACTCCTA CGGGAGGCAG CAGTAGGGAA TCTTCCGCAA TGGACGAAAGTCTGACGGAG CAACGCCGCG TGAGTGATGA AGGCTTTCGG GTCGTAAAAC TCTGTTGTTAGGGAAGAACA AGTGCTAGTT GAATAAGCTG GCACCTTGAC GGTACCTAAC CAGAAAGCCACGGCTAACTA CGTGCCAGCA GCCGCGGTAA TACGTAGGTG GCAAGCGTTA TCCGGAATTATTGGGCGTAA AGCGCGCGCA GGTGGTTTCT TAAGTCTGAT GTGAAAGCCC ACGGCTCAACCGTGGAGGGT CATTGGAAAC TGGGAGACTT GAGTGCAGAA GAGGAAAGTG GAATTCCATGTGTAGCGGTG AAATGCGTAG AGATATGGAG GAACACCAGT GGCGAAGGCG ACTTTCTGGTCTGTAACTGA CACTGAGGCG CGAAAGCGTG GGGAGCAAAC AGGATTAGAT ACCCTGGTAGTCCACGCCGT AAACGATGAG TGCTAAGTGT TAGAGGGTTT CCGCCCTTTA GTGCTGAAGTTAACGCATTA AGCACTCCGC CTGGGGAGTA CGGCCGCAAG GCTGAAACTC AAAGGAATTGACGGGGGCCC GCACAAGCGG TGGAGCATGT GGTTTAATTT GAAGCAACGC GAAGAACCTTACCAGGTCTT GACATCCTTT GACAACCCTA GAGATAGGGC TTCTCCTTCG GGAGCAGAGTGACAGGTGGT GCATGGTTGT CGTCAGCTCG TGTCGTGAGA TGTTGGGTTA AGTCCCGCAACGAGCGCAAC CCTTGATTTTAGTTGCCATC ATTTAGTTGG GCACTCTAAG GTGACTGCCGGTGACAAACC GGAGGAAGGT GGGGATGACG TCAAATCATC ATGCCCCTTA TGACCTGGGCTACACACGTG CTACAATGGA CGGTACAAAG AGCTGCAAGA CCGCGAGGTG GAGCTAATCT CATAAAACCGTTCTCAGTTC GGATTGTAGG CTGCAACTCG CCTACATGAA GCTGGAATCGCTAGTAATCG CGGATCAGCA TGCCGCGGTG AATACGTTCC CGGGCCTTGT ACACCCCGCCCGTCCCCCCC CGAGAGTTTG TAACCCCCGA AGTCGGTGG GTAACCTTTT TGAGCCAGCCGCCTAAAGG GGGAACAGA ATA Hình Trình tự gen 16S rRNA chủng T3 Hình Kết tìm kiếm trình tự tương đồng chủng vi khuẩn T3 (BBT nhận bài: 17/4/2020, hoàn tất thủ tục phản biện: 26/11/2020)