CONOTOXIN TỪ NỌC ỐC CỐI BIỂN (Conus) VÀ ỨNG DỤNG CỦA CHÚNG TRONG Y DƯỢC HỌC

TAP CHI SINH HOC 264-268 Conotoxin từ nọc2016, ốc cối38(2): biển (Conus) DOI: 10.15625/0866-7160/v38n2.7080 CONOTOXIN TỪ NỌC ỐC CỐI BIỂN (Conus) VÀ ỨNG DỤNG CỦA CHÚNG TRONG Y DƯỢC HỌC Lê Thị Bích Thảo1, Bùi Thị Huyền1, Đồn Việt Bình1, Nguyễn Thị Kim Dung1, Nguyễn Thị Minh Phương1, Đỗ Hữu Chí1, Bùi Quang Nghị2, Nguyễn Bích Nhi1, Phan Văn Chi1 Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam, *lethao@ibt.ac.vn Viện Hải Dương học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam TĨM TẮT: Những conotoxin có nọc loài ốc cối biển đa dạng cấu trúc, giàu liên kết disulfide khoá chọn lọc điện áp phối tử kênh ion nên ứng dụng làm thuốc giảm đau Chúng khảo sát conotoxin nọc loài ốc cối Việt Nam phân tích sắc ký lỏng nano kết nối khối phổ Để ứng dụng y dược, ω-conotoxin MVIIA tái tổ hợp biểu E coli xác định hoạt tính giảm đau mơ hình thử nghiệm chuột Kết conotoxin tự nhiên nhận diện thuộc siêu họ O, M, A số peptide nhỏ chưa biết thiếu liệu DNA protein MVIIA tái tổ hợp (CTX) biểu dung hợp với thioredoxin có trọng lượng phân tử khoảng 20.5 kDa (Trx-CTX) peptide CTX tinh có kích thước < kDa sau loại bỏ thioredoxin histag Cả peptide CTX protein dung hợp Trx-CTX có hoạt tính giảm đau lidocain morphine Do vậy, conotoxin tái tổ hợp có tiềm làm thuốc cho điều trị giảm đau hiệu Từ khóa: Conotoxin, ốc cối, protein/peptide, protein tái tổ hợp, ω-conotoxin MỞ ĐẦU Các loài ôc cối giống Conus thuộc họ Conidae, phân bố chủ yếu vùng biển nhiệt đới với khoảng 700 loài [22, 5] Trong nọc loài ốc cối có chứa 1.000 conopeptide, đó, gần 0,1% nghiên cứu mặt dược lý, protein màng điển hình với độ đặc hiệu cao [15] Conopeptide có khả gắn đặc hiệu với receptor màng khác nhau, kênh ion, chất vận chuyển hệ thần kinh trung ương cơ, sử dụng công cụ vạn khoa học thần kinh dược phẩm có giá trị mà đích hệ thần kinh người [22, 4] Đã có 2.354 trình tự nucleotide (80 lồi), 6.113 protein (102 loài) 156 cấu trúc 3D (33 loài) phát [7] có 98 conotoxin có tiềm điều trị bệnh liên quan đến thần kinh tổn thương thần kinh [2] Conotoxin có khối lượng phân tử thấp (< kDa) với 10-30 amino acid, nhóm giàu liên kết disulfide chủ yếu nọc ốc cối làm tăng khả bám conotoxin với đích đặc hiệu [15] Conotoxin quan tâm nghiên cứu thành thuốc giảm đau hiệu điều trị đau thần kinh, bệnh Parkinson hay tâm thần [12, 4, 5] Prialt thuốc tạo dạng 264 dung dịch pha chế ziconotide sử dụng cho bệnh nhân điều trị đau mạn Ziconotide dạng tổng hợp hoá học omega conopeptide (ωconopeptide, MVIIA) tự nhiên gồm 25 amino acid có nọc ốc cối biển C magus MVIIA tác động cách bao vây kênh Ca bề mặt tế bào thần kinh tham gia dẫn truyền tín hiệu đau tuỷ sống làm giảm cảm giác đau có tác dụng giảm đau mạnh morphine từ 100-1.000 lần [4, 45] Ngồi tác dụng giảm đau, conotoxin cịn có triển vọng nghiên cứu hội chứng rối loạn co giật, đột quỵ, nhồi máu tim, bảo vệ tế bào thần kinh mơ hình gây đột quỵ não [6] Trong nghiên cứu này, khảo sát nhận dạng conotoxin tự nhiên nọc loài ốc thu thập vùng biển Nha Trang nghiên cứu tạo conotoxin tái tổ hợp có hoạt tính giảm đau nhằm định hướng ứng dụng y dược học VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU loài ốc cối thu thập vùng biển Nha Trang: C betulinus, C caracteristicus, C litteratus, C marmoreus, C quericus, C striatus, C textile C vexillum Chuột nhắt Le Thi Bich Thao et al trắng dòng Swiss (25-30 g/con) từ Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương Các hóa chất: acetonitrile, Tris-HCl, Trifluoro acetic acid (Fluka, Đức), formic acid, methanol (Merck, CHLB Đức), hóa chất điện di SDS-PAGE (Bio-Rad, Hoa Kỳ), Trypsin (Sigma-Aldrich, Hoa Kỳ); Vector pBT pET32c(+) (Novagen, Hoa Kỳ), enzyme giới hạn, ghép nối, enterokinase (Thermo Life Science, Hoa Kỳ), kit PCR kit xác định trình tự (Invitrogen, Hoa Kỳ), Sepharose chelating, cột sắc ký Vydac C18 (GE Healthcare, Hoa Kỳ) Nhận diện proteins/peptides nọc ốc cối kỹ thuật proteomics Giải phẫu ốc thu nhận bầu độc ống độc theo phương pháp Cruz et al (1976) [1] Cơ quan độc cắt nhỏ, nghiền chiết đệm acetonitril (ACN) Dịch chiết protein nọc ốc phân đoạn sắc ký ngược pha HPLC qua cột phân tích Vydac C18 (4,6 mm x 250 mm) Kiểm tra SDS-PAGE phân đoạn protein theo Laemmli UK, 1970 Protein sau phân tách sắc ký RP-HPLC thuỷ phân trypsin, phân tích hệ thống sắc ký lỏng kết nối khối phổ nanoLC/MS Phổ TOF-MS thu được phân tích phần mềm Analyst QS tìm kiếm theo phương pháp mass fingerprinting Expasy [8] với ứng dụng TagIdent Phân tích MS/MS nhận diện mảnh peptide phổ phân tích phần mềm Mascot 1.8 với sở liệu NCBInr gồm triệu trình tự khác Nghiên cứu biểu hiện, tinh hoạt tính giảm đau conotoxin tái tổ hợp Hai cặp mồi mã hoá cho gen CTX nối ghép bắt cặp tạo thành DNA sợi đôi sử dụng làm khuôn để khuếch đại PCR Tách dòng đoạn gen khuếch đại vào vector pBT kiểm tra trình tự gen Gen CTX sau chuyển vào vector pET32c(+) để biểu E coli BL21(DE3) cách cảm ứng với IPTG Sinh khối tế bào thu sau h cảm ứng kiểm tra SDS-PAGE protein từ sinh khối tế bào Protein dung hợp tinh sử dụng chất giá Sepharose Chelating Imidazole (nồng độ tuyến tính từ 20 mM đến 500 mM) Chọn lọc phân đoạn protein tinh loại bỏ thioredoxin đuôi histidine enterokinase CTX tinh cột cutoff kDa (VIVASPIN 500) phân tích khối phổ MALDI-TOF xác định khối lượng phân tử peptide Xác định hoạt tính giảm đau CTX chuột nhắt mơ hình gây đau thực nghiệm formalin với đối chứng lidocain phương pháp nóng với đối chứng morphine KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Nhận diện proteins/peptides nọc ốc cối kỹ thuật proteomics Phân tích hệ protein/peptide nọc độc loài ốc cối cho thấy số conotoxin nhận diện có trùng lặp với số tác giả giới (bảng 1) Cụ thể, nọc loài C litteratus xác định ωconotoxin MVIIA (2639 Da) ω-conotoxin MVIIC (2749 Da) hai conotoxin đặc hiệu với kênh Ca++ type N, thuộc siêu họ O với cầu disulfide hay δ-conotoxin TxVIA (3034.2 Da) thuộc siêu họ O, họ delta, Y-PIIIE thuộc siêu họ M, họ  cấu trúc peptide gồm liên kết disulfide C textile phát ω-conotoxin TxVII, δ-conotoxin TxVIA Lồi C marmoreus có ω-conotoxin SVIA, SVIB, δ-conotoxin SVIE tương tự peptide phát loài C striatus δ-CTxVIA giống loài C Textile, đồng thời phát độc tố µO-MrVIB Ở lồi C caracteristicus nhận diện conotoxin Ca 1.1 thuộc siêu họ A (1875 Da) có cầu disulfide Lồi C quercinus có độc tố Qc 1.1c (2333 Da) Qc 1.2 thuộc siêu họ A Loài C betulinus phát Be 1.1 (2140 Da), Be 1.2 (1694 Da) thuộc siêu họ A với liên kết disulfide Còn loài C vexillum phát VxVIA (2778 Da) VxVIB (3821 Da) thuộc siêu họ O1 với liên kết disulfide Riêng loài C striatus nhận diện nhiều Ngoài conotoxin nhận diện cịn nhiều protein khác có kích thước nhỏ tương tự kích thước chung conotoxin chưa nhận diện phức tạp thành phần nọc độc, thiếu hụt liệu DNA Cấu trúc độc tố peptide khó xác định kích thước q nhỏ (1080 amino acid), liên kết disulfide lên đến 265 Conotoxin từ nọc ốc cối biển (Conus) có cải biến sau phiên mã cao Ngoài ra, số trình tự protein/peptide thu có nhiều trình tự peptide giống với peptide nọc số loài khác rắn châu Phi, rắn hổ mang bành, bọ cạp Đây đa dạng phức tạp nọc độc ốc cối không số lượng mà thành phần độc tố Cho đến có khoảng 1.700 trình tự conotoxin hoàn chỉnh xác định gần 90 loài ốc cối nghiên cứu [7] Do đó, nọc conus nguồn dược liệu dồi cần tìm kiếm khai thác Hình minh hoạ kết xác định conotoxin nọc ốc cối b a Hình Kết nhận dạng conotoxin nọc ốc cối phân tích phổ khối a Phổ tổng số nanoLC-ESI-Q-TOF MS loài ốc cối C vexillium; b Phổ kết xác định T1conotoxin Vn-05 nọc ốc cối C.striatus Bảng Danh sách số lượng conotoxin nọc loài ốc cối Loài Conus betulinus Conus caracteristicus Conus litteratus Conus marmoreus Conus quercinus Conus striatus Conus textile Conus vexillum Các độc tố nhận dạng 17 11 21 52 31 44 Các độc tố chưa rõ ràng 89 71 56 87 85 97 111 77 Tạo conotoxin tái tổ hợp xác định hoạt tính giảm đau mơ hình chuột thiết kết vào vector pET 32c để biểu E.coli (hình 2a, dịng 3) Gen mã hóa cho -conotoxin MVIIA (CTX) thiết kế với hai cặp mồi CTX1, CTX2 CTX3, CTX4 dựa trình tự peptide có số đăng kí 1TT3_A Protein Database Tiến hành ghép nối CTX1 với CTX3 CTX2 với CTX4 cho bắt cặp bổ sung đoạn gen nối ghép sau khuếch đại PCR cho sản phẩm gen có kích thước 100 bp (hình 2a, đường số 2) Gen sau tách dịng (hình 2a, dịng 1) xác định trình tự (hình 2b) CTX tái tổ hợp biểu dạng dung hợp với thioredoxin (Trx) E.coli tinh có kích thước khoảng 20 kDa (Hình 3a, đường số 1) Protein dung hợp Trx-CTX có hoạt tính giảm đau (liều thử nghiệm µg/g chuột) so sánh với hoạt tính morphine (5 µg/g) thử nghiệm chuột nhắt mơ hình nóng (hình 3b) Peptide CTX tinh có kích thước nhỏ (khoảng kDa) (hình 3c đường số 2) CTX tái tổ hợp (liều thử nghiệm 3,5 g/chuột) có hoạt tính giảm đau tốt chất 266 Le Thi Bich Thao et al đối chứng lidocain (500-600 g/chuột) sử dụng tác nhân gây đau formalin cho chuột (hình 3d) Từ cho thấy peptide CTX protein dung hợp Trx-CTX tái tổ hợp có hoạt tính giảm đau có triển vọng phát triển thành thuốc Đặc biệt peptide chủ yếu a M tạo dạng dung hợp với Trx giúp cho q trình tạo cấu trúc khơng gian (cầu nối disulfide), thuận lợi cho trình tinh sạch, tăng hiệu suất tinh chế [33] Do CTX Trx-CTX cần tiếp tục nghiên cứu sâu đặc tính để làm nguyên liệu để sản xuất thuốc b CTX1 CTX3 Hình Tách dịng thiết kế vector biểu gen mã hoá cho -conotoxin MVIIA (CTX) a Kết tách dòng thiết kế vector biểu CTX; b Kết xác định trình tự gen mã hố cho CTX a b c d Hình Tạo protein/peptide tái tổ hợp thử nghiệm hoạt tính giảm đau a Tinh Trx-CTX; b Hoạt tính giảm đau Trx-CTX so sánh với morphine NaCl; c Tinh peptide CTX; d Hoạt tính giảm đau CTX so sánh với Lidocain NaCl KẾT LUẬN Đã nhận dạng phát số conotoxin đặc trưng nọc loài ốc cối thuộc giống Conus, có cấu trúc từ 2-3 cầu disulfide nhiều peptide chưa khẳng định rõ ràng Conotoxin tái tổ hợp từ CTX tạo dạng dung hợp ngun có hoạt tính giảm đau có tiềm làm nguyên liệu sản xuất thuốc Lời cảm ơn: Cơng trình tài trợ Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam thực Viện Công nghệ Sinh học, Phịng thí nghiệm trọng điểm Cơng nghệ gen TÀI LIỆU THAM KHẢO Cruz L J., Corpuz G., Olivera B M., 1976 A preliminary study of Conus venom protein Veliger, 18: 302-308 267 Conotoxin từ nọc ốc cối biển (Conus) Essack M., Bajic V B., Archer J A C., 2012 Conotoxins that confer therapeutic possibilities Mar Drugs, 10: 1244-1265 Gao B., Zhangsun D., Wu Y., Lin B., Zhu X., Luo S 2013 Expression, renaturation and biological activity of recombinant conotoxin GeX- IVAWT Appl Microbiol Biotechnol., 97(3): 1223-1230 Joseph B., Bajan S S., Jeevitha A M V., Ajisha S U., Jini D., 2011 Conotoxins: a potential natural therapeutic for pain relief Int J of Pharm Sci., 3(2): 1-5 Lewis R J., Dutertre S., Vetter I., Christie M J., 2012 Conus venom peptide pharmacology Pharmacological Reviews, 64(2): 259-298 Yamamoto T., Takahara A., 2009 Recent updates of N-type calcium channel blockers with therapeutic potential for neuropathic pain and stroke Curr Top Med Chem., 9(4): 377-95 http://www.Conoserve.org http://web.expasy.org/tagident/ CONOTOXINS FROM VENOME OF CONE SNAILS (Conus) AND IT’S APPLICATION FOR PHARMACEUTICAL MEDICINE Le Thi Bich Thao1, Bui Thi Huyen1, Doan Viet Binh1, Nguyen Thi Kim Dung1, Nguyen Thi Minh Phuong1, Do Huu Chi1, Bui Quang Nghi2, Nguyen Bich Nhi1, Phan Van Chi1 Institute of Biotechnology, VAST Institute of Oceanography, VAST SUMMARY Conotoxins in venoms of marine cone snails are structural diversity, rich disulfide-bridges that selective block of ion channel voltages or receptors, therefore it is used for development of analgesic drugs In this paper, we investigated conotoxins from venoms of eight cone snails of the genus Conus in Vietnam by using a nano-liquid chromatography linked mass spectrometry For medical application, the recombinant ωconotoxin MVIIA was expressed in E coli and determined analgesic activity by testing on the mice As the results, the conotoxins were identified in venoms of eight conus mainly belong to O, M, A super families In addition, many small peptides were determinated, however these databases are not clear due to reference of DNA and protein databases is deficient Recombinant MVIIA (CTX) was expressed in the fusion with thioredoxin in molecular weight of 20.5 kDa (Trx-CTX) and the original CTX peptide was purified in size of below kDa after removing thioredoxin and his tag Both of CTX peptide and Trx-CTX fusion protein showed an analgesic activity when compared to lidocaine and morphine Hence, these recombinant proteins could be potential drugs for effective analgesic treatment Keywords: Conus, conotoxin, protein/peptide, recombinant protein, ω-conotoxin Ngày nhận bài: 21-9-2015 268