Expression and purification of recombinant omega conotoxin mviia from e coli

32(2): 89 93 2010 T¹p chÝ ω !" ' ( #$ #$ ) %& * ViƯn C«ng nghƯ sinh học c cối (Conus) l đối tợng đợc tập trung nghiên cứu nọc chúng có chứa hợp chất (chủ yếu l neuropeptide v đợc gọi l conotoxin) có đích tác dụng kªnh vËn chun ion qua m ng tÕ b o [13, 8, 7] Một số peptide loại n y đ? đợc chúng minh có khả l m giảm đau hiệu nhiều trờng hợp, ®èi víi chøng ®au dai d¼ng ung th− v AIDS [12, 13, 10] Một số conotoxin có tác dụng chống đột quỵ/nhồi máu tim mô hình động vật thực nghiệm [14, 6, 5] Các nghiên cứu tập trung nghiên cứu tác dụng dợc lý nọc độc bắt nguồn từ phân tÝch vỊ tr×nh tù gen, cÊu tróc bËc nhÊt v cấu trúc không gian conotoxins Từ khoảng 700 lo i ốc cối đ? đợc phát [9], đ? có 1214 tr×nh tù nucleotide, 2258 tr×nh tù protein v 99 cấu trúc 3D đ? đợc công bố [11] Dự án CONCO nghiên cứu sản phẩm gen, tập trung phát v phát triển dợc phẩm sinh học sở nguồn hợp chất có nọc độc lo i ốc cối có khả chữa bƯnh (http://conco.eu/) Dù ¸n n y høa hĐn nhiỊu kÕt có ý nghĩa sức khỏe ngời chẩn đoán v điều trị bệnh Việc tách chiết trực tiếp peptide có hoạt tính dợc lý từ bầu độc ốc cối thờng có hiệu suất thấp, độ tinh không cao đa dạng th nh phần protein/peptide nọc v h m lợng loại lại nhỏ Do vậy, peptide độc hầu hết đợc tạo dạng tái tổ hợp tổng hợp hóa học [1, 3, 4] B i báo n y giới thiệu kết thiết kế biểu hiƯn v tinh chÕ protein ω CTX ë E.coli trªn sở trình tự gen m? hóa conotoxin MVIIA ( CTX) đ? đợc Bùi Thị Huyền v cs công bố gần [2] từ Phòng Hóa sinh protein, viện C«ng nghƯ sinh häc + ,- / VËt liƯu C¸c plasmid CTXpBT mang gen m? hãa conotoxin MVIIA l kết nghiên cứu Phòng Hãa sinh protein Vector biĨu hiƯn pET32c(+), chđng vi khn BL21(DE3) Novagen Các enzyme giới hạn BamHI, NcoI, enterokinase h?ng Fermentas cung cÊp Sepharose chelating mua cña Amersham Pharmacia Biotech v số hóa chất khác Phơng ph¸p a ThiÕt kÕ vector biĨu hiƯn gen m hãa cho CTX Gen CTX sau đ? đợc tách dòng sử dụng vector pBT (Phòng Công nghệ tế b o thùc vËt, ViƯn C«ng nghƯ sinh häc) v xác định trình tự thiết kế đợc chuyển v o vector pET32c (+) để biểu Vector tách dòng CTXpBT v vector pET32c (+) đồng thời đợc xử lý víi hai enzyme giíi h¹n l NcoI v EcoRI để tạo đầu dính tơng hợp đoạn gen cần chèn v vector Sau đợc l m từ gel agarose, gen CTX v vector pET32c đợc nối ghÐp víi nhê enzyme T4 DNA ligase ë 22oC qua đêm Sau đó, sản phẩm gắn kết đợc biến nạp v o chủng E coli DH5 để chọn dòng vector pET32c(+) có chứa gen CTX Vector tái tổ hợp n y đợc ký hiệu l CTXpET32c sau đợc biến nạp v o chủng E coli BL21(DE3) ®Ĩ biĨu hiƯn TÝnh to¸n lý thut cho thÊy, protein tái tổ hợp (Trx CTX) có kích thớc khoảng 21 kDa b BiĨu hiƯn ω CTX ë E coli Plasmid tái tổ hợp CTXpET32c mang gen m? hóa cho CTX đợc biến nạp v o E coli 89 BL21(DE3) v biểu cách cảm ứng với IPTG Khi chủng vi khuẩn mang plasmid tái tổ hợp đợc nuôi môi trờng LB nhiệt độ 37oC khoảng đạt giá trị OD600nm l 0,5 0,7 bỉ sung IPTG víi nång ®é ci cïng l mM Tế b o tiếp tục đợc nuôi khoảng 3h thu sinh khối tế b o cách ly tâm 5000 vòng/phút để loại môi trờng Protein từ sinh khối tế b o đợc chiết khỏi tế b o v kiểm tra SDS PAGE Đánh giá biểu protein đợc tính theo thời gian, kích thớc protein đợc so sánh theo thang protein chuẩn c Tinh chÕ protein Trx CTX v& ω CTX Gen m? hóa CTX đợc thiết kế nối với 109 acid amin thioredoxin giúp tăng khả hình th nh cấu trúc không gian protein đồng thời đợc nối với đoạn peptide gồm histidine thuận lợi cho việc tinh protein Protein dung hợp đợc tinh nhờ chất giá Sepharose Chelating Hỗn hợp protein đợc đa lên cột v rửa trôi protein không bám cột đệm Tris Cl Khi cột đ? protein tạp protein dung hợp Trx CTX đợc trùc tiÕp b»ng Imidazole nång ®é 500 mM Chän läc phân đoạn protein tinh v thực phản ứng cắt enzyme enterokinase để loại bỏ thioredoxin v đuôi histidine Quá trình cắt enzyme đợc thực 25oC 16 Sau CTX đợc tách khỏi protein dung hợp đ? đợc tinh ly t©m läc qua cét microcone kDa Cuèi cïng CTX đợc kiểm tra SDS PAGE để xác định mức độ tinh v l m khô SpeedVac ®Ĩ cÊt gi÷ 25oC +1 % % ! KÕt qu¶ thiÕt kÕ vector biĨu hiƯn CTXpET32c H×nh KiĨm tra thiÕt kÕ vector biĨu hiƯn gen m? hóa Conotoxin MVIIA Vector tái tổ hợp CTXpET32c mang gen m? hãa Trx CTX sau xö lý b»ng NcoI v EcoRI; M thang DNA chuÈn; Sản phẩm PCR, đoạn gen m? hóa Conotoxin MVIIA; Vector tách dòng mang CTXpBT mang gen m? hóa ω Conotoxin MVIIA sau xö lý b»ng NcoI v EcoRI 90 Hình Kết biểu Trx CTX E coli M thang protein chuẩn; đờng chạy v l protein tỉng sè cđa vi khn tr−íc cảm ứng; đờng chạy v l protein tỉng sè cđa vi khn sau c¶m øng v h Gen m? hãa cho ω CTX sau đ? đợc tạo dòng vector pBT với trình tự đợc thiết kế có chứa điểm cắt enzyme NcoI v EcoRI, đ? đợc chuyển v o vector pET32c (+) để biểu theo chiến lợc đ? mô tả phần phơng pháp nghiên cứu Vector tái tổ hợp n y đợc ký hiệu l CTXpET32c đợc biến nạp v o chủng E coli DH5 để kiểm tra, tiếp tục đợc biến nạp v o chđng E coli BL 21 (DE3) ®Ĩ biĨu hiƯn Để kiểm tra, vector tái tổ hợp CTXpBT v CTXpET32c đồng thời đợc xử lý với hai enzyme giới hạn l NcoI v EcoRI điểm cắt đợc thiết kế để tạo đầu dính tơng hợp đoạn gen cần chèn v vector Kết phân cắt đợc trình b y hình Có thể thÊy, tõ vector CTXpET32c v vector CTXpBT sau c¾t cho băng: băng vector a (cao hơn) tơng ứng v băng thấp có kích thớc khoảng 100 bp tơng đơng với sản phẩm PCR, đoạn gen m? hãa cho ph©n tư ω CTX th nh thục Nh vậy, thiết kế đ? đợc thực theo nh chiến lợc đ? mô tả Khung đọc đoạn gen thiết kế đ? đ? đợc kiểm tra qua kết đọc trình tự gen (không đây) Kết biểu protein dung hợp Trx+ CTX Sau vector tái tổ hợp CTXpET32c đợc biÕn n¹p v o chđng E coli BL21(DE3), mét sè dòng tế b o đợc lựa chọn để nghiên cứu biểu cách cảm ứng với IPTG nồng độ cuối dịch nuôi tế b o l 1mM Protein tổng số đợc biểu từ dòng tế b o có cảm ứng v đối chứng cảm ứng đợc kiểm tra điện di biến tính gel polyacrylamide 12,6% có SDS b Hình Kết tinh chế conotoxin tái tổ hợp a Điện di SDS PAGE kiểm tra các phân đoạn protein dung hỵp Trx CTX (M: thang protein chn; 1: protein tỉng sè tr−íc c¶m øng; 2: protein tỉng sè sau cảm ứng IPTG; v l phân đoạn thu đợc sau sắc ký); b Kết tinh chế CTX MVIIA sau cắt loại Trx v lọc qua microcone kDa Kết điện di hình cho thấy, đờng chạy v l protein tổng số thời điểm 0h (trớc cảm ứng) đờng chạy số v l protein tổng số thời điểm 1h v 3h sau cảm ứng IPTG, xuất băng protein Có thể thấy rõ l băng protein n y chØ míi xt hiƯn sau 1h, nh−ng ®? rÊt ®Ëm nÐt v dƠ d ng nhËn biÕt víi kÝch th−íc khoảng 21 kDa so với thang protein chuẩn Một điều đáng ý l , đo đặc tính vector biểu pET32c(+), protein Trx CTX đợc biểu chủ yếu dới dạng hòa tan Hơn nữa, đợc thiết kế có chứa đoạn 6xHis tag nh vị trÝ c¾t cđa enterkinase v tr−íc vïng c¾t gắn đa vị, protein/peptide dễ d ng đợc tinh cho nghiên cứu Kết tinh chế protein +CTX 91 Dựa tơng tác lực gốc histidine với ion Ni Sepharose chelating, protein dung hợp có chứa His tag đợc cố định lại cột sắc ký Sự cạnh tranh imidazole với gốc histidine protein giải phóng protein tái tổ hợp phân đoạn Vì CTX đợc dung hợp với gốc histidine nên protein lai đợc tinh dễ d ng víi chÊt gi¸ Sepharose chelating Sư dơng Imidazole nồng độ 500 mM trực tiếp protein dung hợp Trx CTX Kết thể hình 3a cho thấy, đờng chạy số (protein tổng số sau cảm ứng IPTG) xuất thêm băng protein so với đờng chạy số (protein tổng số tr−íc c¶m øng) cã kÝch th−íc kho¶ng 21 kDa Kích thớc n y phù hợp với tính toán lý thuyết trọng lợng phân tử Trx CTX Các phân đoạn protein đợc có nồng độ v mức độ tinh khác BL21(DE3) Protein Trx CTX v conotoxin MIIA đ? đợc tinh sắc ký lực v siêu lọc phân đoạn thứ v thứ (hình 3a) có băng protein chứng tỏ trình sắc ký đ? đạt đợc đợc độ tinh cần thiết để thực nghiên cứu Lựa chọn phân đoạn protein tinh n y tiến h nh phản ứng phân cắt enterokinase để thu nhận CTX, loại bỏ Trx CTX đợc thu nhận từ hỗn hợp peptide sau tinh siêu lọc (cut off) víi cét microcone kDa (chØ nh÷ng protein cã kÝch thớc nhỏ kDa qua cột) Kết điện di gel polyacrylamide cho thấy peptide CTX thu đợc sau qua cột microcone 5kDa đạt độ tinh cao (Hình 3b) Cấu trúc CTX tái tổ hợp đ? đợc xác nhận qua phân tích khối phổ Độ độc (LD50) v hoạt tính giảm đau CTX đ? đợc thủ nghiệm mô hình chuột nhắt trắng Các kết n y đợc trình b y b i báo tiÕp theo Can P., Weihua C et al., 2009: Acta Biochim Biophys Sin., 41: 858 864 Canhui P et al., 2007: Journal of Biotechnology, 128: 184 193 Lubbers N L et al., 2005: J Cardiovasc Pharmacol., 46: 141 146 +1 ! conotoxin MIIA đ? đợc thiết kế biểu dới dạng protein dung hợp Trx CTX, có chứa đoạn His tag v điểm cắt cđa enterokinase, víi kÝch th−íc kho¶ng 21kDa b»ng hƯ vector pET32c ë tÕ b o E coli chñng 92 Lêi cám ơn: Công trình đợc hỗ trợ kinh phí đề t i Khảo sát, xác định số peptide có hoạt tính sinh dợc quý từ sinh vật biển đặc hữu (ốc cối, hải miên) kỹ thuật proteomics” cÊp ViƯn Khoa häc v C«ng nghƯ ViƯt Nam, 2008 2009 T I LIƯU THAM KH¶O Becker S and Terlau H., 2008: Journal Applied Microbiology and Biotechnology, 79: Bïi ThÞ Hun, Ngun BÝch Nhi, Phan Văn Chi, 2008: Tạp chí Công nghệ sinh học, 6(4A): 663 669 Miljanich G P., 2004: Curr Med Chem., 11: 3029 3040 Olivera B M., 2002: Ann Rev Ecol Syst., 33: 25 47 Olivera B M., 2006: J Biol Chem., 281: 31173 31177 Olivera B M and Teicher R W., 2007: Molecular Interventions, 7(5): 251 260 10 Philippe F., Reto S., 2009: Current Opinion in Pharmacology, 9(5): 594 601 11 Quentin K et al., 2008: Bioinformatics Applications Note, 24(3): 445 446 12 Staats P S et al., 2004: Jama, 291: 63 70 13 Terlau H and Olivera B M., 2004: Physiol Rev., 84(1): 41 68 14 Zhang S J et al., 2003: J Cardiovasc Pharmacol., 42: 764 771 4 5466 ω 58 54 85 ' 9 $ !9 $ ) )& ) SUMMARY Following the strategy of cloning ω conotoxin MVIIA (ω CTX) from Conus magus (C magus), in this article, the expression and purification of the peptide is reported For that, recombinant plasmid CTXpET32c was designed containing fusion gene encoding thioredoxin (as original) and ω CTX (Trx CTX) that is linked by enterokinase restriction site, was transformed into the E coli BL21 strain The fusion protein, Trx CTX combined to 6xHis tag, is about 21 kDa in size, was expressed by induction with mM IPTG and analyzed by SDS PAGE The recombinant protein was isolated and purified by Sepharose chelating affinity chromagraphy SDS PAGE results were an evidence to confirm the successful construction and expression of ω CTX in the fusion form with Trx in E coli with vector CTXpET 32c When it was treated by enterokinase to remove thioredoxin, ω CTX peptide was purified and obtained by using kDa cutoff centrifugal filters : ω conotoxin MVIIA, Conus magus, E coli, vector CTXpET32c(+) Ng&y nhËn b&i: 12 2009 93 ... construction and expression of ω CTX in the fusion form with Trx in E coli with vector CTXpET 32c When it was treated by enterokinase to remove thioredoxin, ω CTX peptide was purified and obtained by... this article, the expression and purification of the peptide is reported For that, recombinant plasmid CTXpET32c was designed containing fusion gene encoding thioredoxin (as original) and ω CTX... with mM IPTG and analyzed by SDS PAGE The recombinant protein was isolated and purified by Sepharose chelating affinity chromagraphy SDS PAGE results were an evidence to confirm the successful construction