Research on neuroprotective effects of a fusion protein of omega conotoxin mviia and thioredoxin

TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(4): 515-520 NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG BẢO VỆ TẾ BÀO THẦN KINH CỦA -CONOTOXIN MVIIA TÁI TỔ HỢP Ở DẠNG PROTEIN DUNG HỢP VỚI THIOREDOXIN Bùi Thị Huyền, Đồn Việt Bình*, Nguyễn Thị Kim Dung, Lê Thị Bích Thảo, Nguyễn Bích Nhi, Phan Văn Chi Viện Cơng nghệ sinh học, *dvietbinh@yahoo.com TĨM TẮT: Omega-conotoxin MVIIA loại peptide có tác dụng khố chọn lọc kênh ion Ca2+ khớp tế bào thần kinh đó, có tác dụng hạn chế dòng Ca2+ tràn vào tế bào bảo vệ tế bào thần kinh Báo cáo trình bày kết thử nghiệm tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh Omegaconotoxin MVIIA tái tổ hợp dạng dung hợp với thioredoxin (Trx-CTX) Viện Công nghệ sinh học chế tạo mơ hình chuột nhắt thiếu máu tồn não phút 10 phút mô hình chuột nhắt thiếu máu cục não Trx-CTX tiêm tĩnh mạch lần với liều 10 mg/kg mơ hình thiếu máu tồn não tiêm hai lần liều mg/kg mơ hình thiếu máu cục não Kết cho thấy TrxCTX có tác dụng giảm số tế bào CA1 vùng đồi hải mã bị chết, giảm thể tích não bị tổn thương có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh mơ hình Trx-CTX sử dụng làm ngun liệu cho cơng trình nghiên cứu với mục đích làm thuốc chữa bệnh cho người Từ khóa: Bảo vệ thần kinh, conotoxin, đột quỵ, omega-conotoxin MVIIA, Trx-CTX MỞ ĐẦU Ca có vai trị quan trọng hoạt động tế bào thần kinh Ca2+ tham gia vào q trình dẫn truyền tín hiệu thần kinh, trực tiếp điều hòa hoạt động protein màng, enzym protein tham gia điều hịa q trình chép biểu gen Ở trạng thái hoạt động bình thường, hàm lượng Ca2+ tế bào thần kinh giữ trạng thái cân chế tinh vi [16] Các chế hoạt động phụ thuộc chặt chẽ vào trạng thái lượng vào hoạt động tế bào giúp cho lượng Ca2+ tế bào giữ ổn định giới hạn rộng Tuy nhiên, lượng Ca2+ tế bào vượt giới hạn Ca2+sẽ gây loạt phản ứng có hại cho tế bào làm tế bào bị chết [7] 2+ Đột quỵ bệnh hay xảy người cao tuổi bệnh nhân bị bệnh tim mạch thường để lại di chứng nguy hiểm Trong đột quỵ, mạch máu bị nghẽn lại, máu không đưa đến số vùng não làm cho vùng não không cung cấp đủ ô xy lượng Sự thiếu hụt lượng làm cho màng tế bào bị khử cực phá vỡ cân Ca2+ Hàm lượng Ca2+ tế bào tăng vượt giới hạn làm tế bào thần kinh bị tổn thương [7] Để chống lại tác hại gây Ca2+ tăng đột ngột đột quỵ, gần đây, người ta ý đến loại chất có khả chặn dịng Ca2+ từ bên vào tế bào qua kênh ion có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh Nhiều loại thuốc chứng tỏ có hiệu động vật thực nghiệm [11, 12, 14] Omega-conotoxin MVIIA loại peptide nhỏ tách chiết từ bầu độc loài ốc cối biển C magus, có tác dụng khố chọn lọc kênh ion Ca2+ khớp (synapse) tế bào thần kinh [2, 8] Cho đến nay, có nhiều cơng trình nghiên cứu chứng minh số loại -conotoxin MVIIA tổng hợp hóa học có khả bảo vệ tế bào thần kinh mơ hình gây thiếu máu não thực nghiệm [4, 13, 15] Omega-conotoxin MVIIA tách dòng, biểu trước tiên dạng protein dung hợp với thioredoxin (Trx-CTX), sau tinh chế thành cơng (ω-CTX) Phịng Hóa sinh protein, Viện Cơng nghệ sinh học Omegaconotoxin MVIIA dạng protein dung hợp sản xuất với khối lượng lớn tinh chế theo quy trình khơng phức tạp [6], thuận lợi dùng làm thuốc Bài báo trình bày kết nghiên cứu khả sử dụng Trx-CTX Viện Công nghệ sinh học tạo để bảo vệ tế bào thần kinh 515 Bui Thi Huyen et al mơ hình gây đột quỵ thực nghiệm chuột nhắt VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Trx-CTX chế tạo Phòng Hố sinh protein, Viện Cơng nghệ sinh học Ketamin hãng Rhône Méreux, 2,3,5Triphenyltetrazolium chloride (TTC) Merck, khâu Surelon® Suremed ( USP size 6/0), hematoxylin - eosin hãng Thermo Shandon, kính hiển vi BX51 hãng Olympus Chuột thí nghiệm chuột nhắt trắng dịng Swiss, giống đực, tháng tuổi, trọng lượng trung bình 40g/con, ni thức ăn viên có thành phần protein 23%, mỡ 5%, carbonhydrate 45-55%, xơ 5% Phương pháp Mô hình thiếu máu tồn não Thiếu máu phút Mơ hình thiếu máu tồn não thực theo phương pháp Valentino et al (1993) [15] Chuột gây mê ketamin với liều 60µg/g, sau cố định nằm ngửa bàn mổ Dùng dao mổ rạch đường cổ dài khoảng 1-2 cm qua da cổ chuột bóc tách nhìn thấy động mạch cảnh hai bên Dùng kim luồn sợi khâu tách động mạch cảnh hai bên thắt lại Sau phút nới lỏng, tháo hẳn sợi Sau khâu lớp da ngồi lại Chuột lơ thí nghiệm liền sau tháo thắt động mạch cảnh 45 phút, tiêm vào tĩnh mạch Trx-CTX với liều mg/kg Sau 24 giết chuột, mổ lấy não, cố định não dung dịch mơn trung tính, đúc parafin, cắt lát nhuộm tiêu hematoxylin-eosin đọc chụp mẫu tiêu kính hiển vi Thiếu máu 10 phút Chuột gây mê, mổ trên, thắt động mạch cảnh hai bên Sau 10 phút nới lỏng, tháo hẳn sợi Sau khâu lớp da ngồi lại Chuột lơ thí nghiệm liền sau tháo thắt động mạch cảnh 45 phút, tiêm vào tĩnh mạch Trx-CTX với liều 10 mg/kg Sau 120 giết chuột, mổ lấy não, cắt lát nhuộm tiêu hematoxylin-eosin 516 đọc chụp mẫu tiêu kính hiển vi Mơ hình thiếu máu cục não Hai mươi chuột chia thành lô, lơ 10 Mơ hình thiếu máu cục não tiến hành theo phương pháp Pinte et al (2011) [10] có cải tiến sau: chuột gây mê ketamin với liều 60µg/g, sau dược cố định nằm ngửa bàn mổ Dùng dao mổ rạch đường cổ, khoảng 12cm qua da cổ chuột bóc tách nhìn thấy động mạch cảnh bên trái chỗ chạc ba chia thành hai nhánh Dùng kim luồn sợi phẫu thuật (6/0) tách động mạch cảnh bên trái (left internal carotid artery) thắt lại Cứ để nút thắt khâu lớp da ngồi lại Chuột lơ thí nghiệm liền sau tháo thắt động mạch cảnh 30 phút, tiêm vào tĩnh mạch Trx-CTX với liều mg/kg sau 60 phút tiêm nhắc lại với liều Sau 24 quan sát, đánh giá trạng thái thần kinh điểm theo thang điểm Berdeson et al (1986) [1] Sau 48 giết chuột, mổ lấy não, nhuộm TTC để xác định thể tích phần não bị tổn thương cố định não dung dịch formol trung tính, đúc parafin, cắt lát nhuộm tiêu hematoxylin-eosin đọc chụp mẫu tiêu kính hiển vi Đánh giá mức độ tổn thương thần kinh Mức độ tổn thương thần kinh chuột sau mổ tiến hành đánh giá sau mổ 24 cho điểm theo phương pháp Berdeson et al (1986) [1] Điểm O: chuột vận động bình thường, khơng có biểu tổn thương thần kinh; điểm 1: chuột bị cong gập chân trước; điểm 2: chuột bị đẩy trôi phía tay bị liệt; điểm 3: Chuột có biểu chạy vịng trịn Đo thể tích phần não bị tổn thương Phần não chuột bị tổn thương xác định theo phương pháp Pateliya et al (2008) [9] có cải tiến sau: não chuột cắt thành lát cắt có chiều dầy 1mm nhuộm lát cắt dung dịch TTC 1% 30 phút Lát cắt có vùng bắt mầu đỏ khơng nhau: đỏ sẫm hồng tái nhạt Vùng bắt mầu vùng não bị tổn thương Sau đặt lát cắt phiến kính Trên bề mặt lát cắt đặt nylon mỏng suốt có kể vng nhỏ có diện tích mm2 Đếm TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(4): 515-520 vng nhỏ để tính thể tích phần não bị tổn thương thể tích lát cắt Cuối cộng số liệu tất lát cắt lại để tính tổng số Nghiên cứu tổ chức học mô não Não chuột phần lưng vùng hải mã (dorsal hippocampus ) cắt thành lát dày µm để nhuộm HE quan sát hình thái tế bào thần kinh CA1 (hình 1) não chuột cho thấy, não chuột bị thiếu máu phút có nhiều tế bào CA1 đồi hải mã có biểu bị màng tế bào, nguyên sinh chất tăng bắt màu đỏ bị vón lại, cịn mảnh vụn (hình 2A), chúng tỏ tế bào bị thương tổn, chí bị chết Trong đó, chuột bị thiếu máu não tiêm Trx-CTX có đa số tế bào thần kinh có hình ảnh tế bào bình thường, có tế bào có biểu bị tổn thương (hình 2B) Thiếu máu 10 phút Não chuột bị thiếu máu 10 phút có biểu bị tổn thương nặng chuột bị thiếu máu phút Tuy nhiên, não chuột tiêm Trx-CTX (hình 3D) có tế bào bị tổn thương não chuột khơng tiêm (hình 3C) Tác dụng Trx-CTX trường hợp thiếu máu cục não Hình Hình ảnh nhuộm HE lát cắt vùng lưng đồi hải mã với tế bào CA1 (hình chữ nhật) Độ phóng đại 40 lần KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tác dụng Trx-CTX trường hợp thiếu máu toàn não Thiếu máu phút Kết nghiên cứu tổ chức học mẫu Đánh giá mức độ tổn thương thần kinh Kết xác định mức độ tổn thương não theo thang điểm Berdeson et al (1986) [1] cho thấy chuột lô đối chứng không tiêm Trx-CTX có mức độ não bị tổn thương nặng (nhiều bị cong gập cổ chân trước, bị liệt nhẹ chân trước phải có xu hướng chạy vịng trịn) có số điểm cao so với chuột lơ thí nghiệm tiêm Trx-CTX (đa số chuột bị cong nhẹ cổ chân trước phải, chạy hai bên) (bảng 1) Bảng Kết xác định mức độ tổn thương não đo thể tích phần não bị tổn thương Chỉ tiêu Mức độ tổn thương não (điểm) Thể tích não bị tổn thương (mm3) Lô đối chứng 2,38 ± 0,32 22,00 ± 2,70 Đo thể tích não bị tổn thương Thể tích não bị tổn thương chuột lơ đối chứng đo 22,00 mm3, nhiều hẳn so với lơ thí nghiệm 11,44 mm3 Tổ chức học mô não Não chuột lô đối chứng không tiêm Trx-CTX bị tổn thương nhiều lơ thí nghiệm tiêm Trx-CTX thể rõ hình ảnh tổ chức học mơ não (hình 4) Não chuột lơ đối chúng có nhiều tế bào Lơ thí nghiệm 0,93 ± 0,13 11,44 ± 1,17 CA1 bị chết (hình 4E), đa số tế bào não chuột lơ thí nghiệm có hình ảnh bình thường, khơng bị thương tổn (hình 4F) THẢO LUẬN Đột quỵ bệnh nguy hiểm, thường xảy động mạch cảnh hay nhánh lên não bị thắt lại hay bị tắc hoàn toàn Trong trường hợp này, lượng máu lên não bị giảm mạnh, làm cho não bị thiếu xy Khi xảy loạt phản ứng tăng cường đường phân khí 517 Bui Thi Huyen et al dẫn đến cạn kiệt ATP làm cho màng tế bào bị phân cực Tế bào tăng cường tích lũy glutamate tích lũy chất làm tăng đột ngột lượng Ca2+ vào tế bào Ca2+ hoạt hóa enzym protease, phospholipase enzym kết hợp với nhiều chất khác phá hủy màng tế bào, vi sợi, ty thể tế bào thần kinh cuối làm chết tế bào [16] Hình Ảnh nhuộm HE tế bào CA1 não chuột thiếu máu toàn não phút A Chuột đối chứng ( mũi tên tế bào bị chết ); B Chuột tiêm Trx-CTX Độ phóng đại 400 lần Hình Ảnh nhuộm HE tế bào CA1 não chuột thiếu máu toàn não 10 phút C Chuột đối chứng ( mũi tên tế bào bị tổn thương); D Chuột tiêm Trx-CTX Độ phóng đại 400 lần Hình Ảnh nhuộm HE tế bào CA1 não chuột thắt động mạch cảnh trái vĩnh viễn E Chuột đối chứng ( mũi tên tế bào bị tổn thương); F Chuột tiêm Trx-CTX Độ phóng đại 400 lần Vùng não thường hay bị tổn thương nhiều thiếu máu não vùng đồi hải mã, đặc biệt tế bào CA1 Đây vùng có vai trị quan trọng trí nhớ người Chính vậy, cơng trình nghiên cứu tổn thương não đột quỵ thường tập trung nghiên cứu vùng Trong thí nghiệm, chúng tơi sử dụng mơ hình gây thiếu máu não khác nhau: mơ hình 518 gây thiếu máu não tồn mơ hình thiếu máu não cục Trong mơ hình thiếu máu não tồn bộ, thời gian thiếu máu não ngắn, phút 10 phút Sau thời gian ni chuột khác nhau, tương ứng 24 120 Kết mơ hình cho thấy não bị tổn thương với mức độ khác nhau: chuột thiếu máu 10 phút giết mổ sau 120 có số lượng tế bào não chết nhiều TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(4): 515-520 chuột thiếu máu não phút giết mổ sau 24 Điều cho thấy, mức độ tổn thương não phụ thuộc vào thời gian não bị thiếu máu mà vào thời gian xẩy sau Kết phù hợp với kết thí nghiệm Colbourne et al (1999) [5] Tuy nhiên, mơ hình thí nghiệm cho thấy, chuột tiêm Trx-CTX có não bị tổn thương chuột không tiêm, chứng tỏ Trx-CTX chặn phần dòng Ca2+ tràn vào mức tế bào thần kinh não bị thiếu máu có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh Tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh TrxCTX lần khẳng định thể rõ mơ hình thiếu máu não cục Các kết đo thể tích não bị phá hủy, xác định mức độ tổn thương não kết nghiên cứu tổ chức học cho thấy não chuột tiêm Trx-CTX bị tổn thương Như vậy, TrxCTX khơng có tác dụng trường hợp não bị thiếu máu thống qua mà cịn có tác dụng phần não bị thiếu máu thời gian dài Những kết có ý nghĩa việc tìm loại thuốc điều trị cho bệnh đột quỵ người Trong cơng trình nghiên cứu khác [6], chúng tơi xác định Trx-CTX có hoạt tính giảm đau tốt Trx-CTX sản xuất với khối lượng lớn tinh chế theo quy trình khơng phức tạp Vì vậy, sử dụng Trx-CTX làm ngun liệu cho cơng trình nghiên cứu với mục đích làm thuốc chữa bệnh cho người KẾT LUẬN Omega-conotoxin MVIIA dạng protein dung hợp Viện Cơng nghệ sinh học tạo có tác dụng bảo vệ tế bào thần kinh mơ hình chuột nhắt bị thiếu máu não tồn mơ hình thiếu máu não cục Lời cảm ơn: Cơng trình tài trợ kinh phí đề tài cấp Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam (2011-2012, mã số: VAST03.02/11-12 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bederson J B., L H Pitts, M Tsuji, M C Nishimura, R L Davis, Bartkowski H., 1986 Rat middle cerebral artery occlusion: evaluation of the model and development of a neurologic examination Stroke, 17: 472-476 Bingham J P., Mitsunaga E., Bergeron Z L., 2010 Drugs fromslugs-Past, present and future perspectives of -conotoxin research Chemico-Biological Interactions, 183: 1-18 Đồn Việt Bình, Bùi Thị Huyền, Nguyễn Thị Kim Dung, Lê Thị Bích Thảo, Nguyễn Bích Nhi, Phan văn Chi, 2012 Nghiên cứu độc tính cấp tác dụng giảm đau ω-conotoxin MVIIA dạng dung hợp với thioredoxin Tạp chí Sinh học, 34(2): 241-245 Buchan A M., Gertler S Z., Li H., Xue D., Huang Z G., Chaundy K E., Barnes K., Lesiuk H J., 1994 A Selective N-Type Ca2+ -Channel Blocker Prevents CAl Injury 24 h Following Severe Forebrain Ischemia and Reduces Infarction Following Focal Ischemia J Cereb Blood Flow Metab., 14(6): 903-910 Colbourne F., Li H., Buchan A M., Clemens J A., 1999 Continuing Postischemic Neuronal Death in CA1 : Influence of Ischemia Duration and Cytoprotective Doses of NBQX and SNX111 in Rats Stroke, 30: 662-668 Bùi Thị Huyền, Lê Thị Bích Thảo, Nguyễn Bích Nhi, Phan Văn Chi, 2010 Biểu tinh chế ω-conotoxin MVIIA (CTX MVIIA) E coli Tạp chí Sinh học, 32(2): 89-93 Lazarewicz J W., 1996 Calcium transients in brain ischemia: role in neuronal injury Acta Neurobiol Exp., 56: 299-311 Olivera B M., 2000 Omega-Conotoxin MVIIA: From Marine Snail Venom to Analgesic Drug Drugs from the Sea: 74-85 Pateliya B B., Singh N., Jaggi A S., 2008 Possible Role of Opioids and KAT P Channels in Neuroprotective Effect of Postconditioning in Mice, Biol Pharm Bull., 31(9): 1755-1760 10 Pinte I L., Role E., A T Bălseanu, Pirici I., O T Pop, L Mogoantă., 2011 Study of cellular changes induced by moderate 519 Bui Thi Huyen et al cerebral ischemia achieved through internal carotid artery ligation Rom J Morphol Embryol., 52(4): 1347-1353 11 Pitkänen A., Longhi L., Marklund N., Morales D M., McIntosh T K., 2005 Neurodegeneration and neuroprotective strategies after traumatic brain injury Drug Discovery Today: Disease Mechanisms, 2(4): 409-418 12 Takahara A., Konda T., Enomoto A., Kondo N., 2004 Neuroprotective Effects of a Dual L/N-type Ca2+ channel Blocker Cilnidipine in the Rat Focal Brain Ischemia Model, Biol Pharm Bull., 27(9): 1388-1391 13 Takizawa S., Matsushima K., Fujita H., Nanri K., Ogawa S., Shinohara Y., 1995 A Selective N-Type Calcium Channel Antagonist Reduces Extracellular Glutamate Release and Infarct Volume in Focal Cerebral Ischemia, J Cereb Blood Flow Metab., 15: 611-618 14 Twede V D., Miljanich G., Olivera B M., Bulaj G., 2009 Neuroprotective and cardioprotective conopeptides: An emerging class of drug leads Curr Opin Drug Discov Devel., 12(2): 231-239 15 Valentino K., Newcomb R., Gadbois T., T Singh, S Bowersox, S Bitner, A Justice, D.Yamashiro, B B Hoffman, R Ciaranello, G Miljanich, J Ramachandran, 1993 A selective N-type calcium channel antagonist protects againstneuronal loss after global cerebral ischemia Proc Natl Acad Sci USA, 90: 7894-7897 16 Zuendorf G and Reiser G., 2011 Calcium Dysregulation and Homeostasis of Neural Calcium in the Molecular Mechanisms of Neurodegenerative Diseases Provide Multiple Targets for Neuroprotection Antioxidants & Redox signaling, 14(7): 1275-1288 RESEARCH ON NEUROPROTECTIVE EFFECTS OF A FUSION PROTEIN OF -CONOTOXIN MVIIA AND THIOREDOXIN Bui Thi Huyen, Doan Viet Binh, Nguyen Thi Kim Dung, Le Thi Bich Thao, Nguyen Bich Nhi, Phan Van Chi Institute of Biotechnology, VAST SUMMARY Ischemic stroke is one of the most dangerous human diseases Blood supply to the brain is decreased initiating the ischemic cascade with the consequence of a Ca2+ influx into nerve-cells This Ca2+ influx can than cause neuronal injury or death of cells Omega-conotoxin MVIIA (-CTX) is a neurotoxin isolated from the venom of Cone snail Conus magus It is a potent selective blocker of the N-type voltage-sensitive calcium channel in neurons and therefore has the potential to promote neuroprotection through inhibition of Ca2+ influx into nerve-cells -CTX has been cloned, expressed in the fusion form with thioredoxin (Trx-CTX ) in E coli in the institute of biotechnology, Hanoi In this paper we present our study on neuroprotectiv activity of Trx-CTX in mouse model of global cerebral ischemia and focal brain ischemia The experiments were carried out in male mice of Swiss race weighing 40 g Trx-CTX were injected i.v in the model of global cerebral ischemia, one time with a dose of or 10 mg/kg and in the other model two times, each with a dose of mg/kg The results showed that in global cerebral ischemia Trx-CTX has decreased neuronal injury and death of CA1 cells of dorsal hippogampus In other model Trx-CTX also decreased infarction size of the ischemic brain Trx-CTX proof to possess neuroprotective effect and could be used in further researchs for medicinal purpose Keywords: conotoxin, ischemia, neuroprotectiv, omega-conotoxin MVIIA, Trx-CTX Ngày nhận bài: 16-4-2012 520 ... Neurodegeneration and neuroprotective strategies after traumatic brain injury Drug Discovery Today: Disease Mechanisms, 2(4): 409-418 12 Takahara A. , Konda T., Enomoto A. , Kondo N., 2004 Neuroprotective. .. againstneuronal loss after global cerebral ischemia Proc Natl Acad Sci USA, 90: 7894-7897 16 Zuendorf G and Reiser G., 2011 Calcium Dysregulation and Homeostasis of Neural Calcium in the Molecular Mechanisms... R., Gadbois T., T Singh, S Bowersox, S Bitner, A Justice, D.Yamashiro, B B Hoffman, R Ciaranello, G Miljanich, J Ramachandran, 1993 A selective N-type calcium channel antagonist protects againstneuronal