21 Changi South Street Singapore 486777 Tel: +65 65420833 | Fax: +65 65426920 QUY TRÌNH THỬ NGHIỆM VẬT LIỆU MANG BioNOCTM II Nội dung Khử trùng vật liệu mang Phủ lớp gắn kết cho vật liệu mang (nếu yêu cầu) Cấy tế bào Nuôi tế bào Sinh trưởng tế bào vật liệu mang với hệ thống mô Mini Tide Motion sử dụng Rocking Motion (Không bắt buộc) Thu hoạch đếm tế bào Nhuộm quan sát tế bào Ví dụ minh họa nhuộm vật liệu mang 1|Page PROTOCOL FOR SEEDING BIONOC II CARRIERS | version 21 Changi South Street Singapore 486777 Tel: +65 65420833 | Fax: +65 65426920 Khử trùng vật liệu mang Khử trùng ướt vật liệu mang dung dịch PBS Hấp 121oC 20 phút Bảo quản vật liệu mang PBS sử dụng Phủ lớp gắn kết cho vật liệu mang (nếu yêu cầu) Chuyển vật liệu mang khử trùng sang đĩa petri dùng lần vô trùng 100mm Loại bỏ PBS Để vật liệu mang khô tự nhiên Phủ lớp gắn kết tế bào yêu cầu Toàn vật liệu mang phải đặt dung dịch gắn kết thời gian nhiệt độ cần thiết Loại bỏ dịch chứa chất gắn kết Để vật liệu mang khô tự nhiên Rửa PBS cần (phụ thuộc chất gắn kết) Bảo quản vật liệu mang BioNOC™II phủ gắn kết-XX (bảo quản nhiệt độ phù hợp sử dụng) Cấy tế bào Lấy 30 BioNOC™II vật liệu mang vào ống ly tâm 15ml vô trùng Ủ vật liệu mang với lượng tế bào môi trường đủ đảm bảo toàn vật liệu mang nằm dung dịch chứa tế bào Mật độ cấy phụ thuộc loại tế bào Thông tin tham khảo với số loại tế bào Lưu ý: Không nên cấy tế bào với nồng độ > 1x106 tế bào/ml để tránh vón cục tế bào Loại tế bào Tế bào gốc trung mô Tế bào noãn chuột hamster Trung Quốc Chinese hamster ovary cells (CHO) Mật độ cấy (Số tế bào/vật liệu mang) 20,000 – 60,000 100,000 – 300,000 100,000 – 300,000 100,000 – 300,000 100,000 – 300,000 60,000 – 120,000 HEK293T Vero Hybridoma OKT MDCK Nhẹ nhàng lắc ngược ống 2-3 lần để tế bào trộn trộn tế bào với vật liệu mang (Tham khảo hình bên dưới) ml Đặt thẳng ống ly tâm tủ ấm CO2 37°C, 5% CO2 3-4 2|Page PROTOCOL FOR SEEDING BIONOC II CARRIERS | version 21 Changi South Street Singapore 486777 Tel: +65 65420833 | Fax: +65 65426920 Cứ 15 phút đầu tiên, lặp lại bước để tế bào phân bố Trong 2-3 tiếp theo, lặp lại bước 30 phút lần Sau ủ, mang ống ly tâm đặt vào tủ an toàn sinh học, trộn mẫu lấy ~50µl để đếm tế bào Đếm tế bào cịn lại dịch ni cấy xác định % tế bào bám Nếu tỉ lệ bám tế bào đạt 90% (tức 10% tế bào cịn mơi trường) tiến hành bước tiếp theo, ủ thêm để kiểm tra lại tỉ lệ bám Thông thường, trình bám tế bào diễn 3-5 Nuôi tế bào Loại bỏ môi trường Dùng kẹp khử trùng chuyển vật liệu mang từ ống ly tâm sang chai nuôi cấy tế bào T75 chứa 15-20ml môi trường đặt tủ ấm CO2 Nuôi vật liệu mang hệ thống MiniTide Motion (xem bên dưới) Thu vật liệu mang đếm tế bào để theo dõi sinh trưởng hàng ngày Nhuộm tế bào cần thực ngày *Lưu ý: Tối đa để 20ml mơi trường bình ni cấy T75 45ml mơi trường bình ni cấy T175, để tránh việc rị rỉ mơi trường ẩm màng lọc nắp chai trình khuấy trộn Sinh trưởng tế bào vật liệu mang với hệ thống mô chuyển động thủy triều Mini TideMotion sử dụng chuyển động bập bênh (không bắt buộc) Thiết bị nuôi tế bào Tide Motion bioreactor bơm liên tục môi trường vào khỏi vật liệu mang giúp vận chuyển chất dinh dưỡng khí đến vật liệu mang (Hình 1) Hình 1: CelCradle™ hoạt động thơng qua ngun tắc chuyển động thủy triều tế bào, gắn vào vật liệu mang BioNOC™II, luân phiên pha cấp khí pha cấp mơi trường dinh dưỡng thông qua đẩy môi trường lên xuống hệ thống Mô chuyển động thủy triều với quy mô nhỏ, vật liệu mang đặt chai nuôi cấy T75 lắc nhẹ nhàng thiết bị 2D rocker Chuyển động tạo luân phiên pha dinh dưỡng pha cấp khí (Hình 2) 3|Page PROTOCOL FOR SEEDING BIONOC II CARRIERS | version Protocol for testing BioNOC™ II carriers Hình 2: (Trái) Hình ảnh bình ni cấy đặt máy lắc bập bềnh (Phải) Sơ đồ thể chuyển động lắc lư bình ni cấy mơ nguyên tắc chuyển động thủy triều luân phiên pha quan sát CelCradel™ bioreactor Các bước thực cấy tế bào lên vật liệu mang chuyển vật liệu mang vào bình ni cấy T-75/T175: • • • • • Đặt máy lắc bập bềnh bên tủ ấm CO2 trì 37°C 5% CO2 (hoặc tùy theo yêu cầu người sử dụng) Điều chỉnh tốc độ chuyển động chu kỳ/phút (Mỗi chu kỳ gồm chuyển động từ trái ->phải-> trái) Đặt chai máy lắc bập bềnh 0,6ml mơi trường/vật liệu mang (có thể điều chỉnh tùy loại tế bào) * Để mô lượng môi trường vật liệu mang thực CelCradle (500ml môi trường 850 vật liệu mang chai) Có thể cung cấp lượng môi rường nhiều vật liệu mang chuyển sang dạng CelCradle tự cấp môi trường Thay môi trường 2-3 ngày lần tùy theo qui trình ni cấy thực phịng nghiên cứu tùy dòng tế bào Thu đếm tế bào Tách Enzyme Các loại Enzyme tách tế bào: Accumax, Trypsin 0.25%, TrypLe Express, Collagenase Chuyển ba vật liệu mang từ chai nuôi cấy vào ống ly tâm 1,5ml Rửa vật liệu mang với 1ml PBS Loại PBS Lặp lại bước thêm lần Tách tế bào enzyme: i Trypsin/TrypLE Express: (hầu hết loại tế bào) • Thêm 1ml 0,25% Trypsin-EDTA, ủ 37oC for 10-15 phút Trung hịa 1ml mơi trường ii Accumax/Accutase: (thích hợp cho tế bào gốc) • Thêm 1ml Accumax/Accutase, ủ nhiệt độ phòng 15-30 phút (Thời gian ủ phụ thuộc vào mật độ tế bào, đề xuất thí nghiệm 15 phút, 20 phút 30 phút) Accumax đề xuất cho tế bào sinh trưởng khơng gian 3D Tuy nhiên, sử dụng phương pháp hóa chất mà người sử dụng thường dùng iii Collagenase: (thích hợp cho tế bào gốc) • Pha loãng collagenase loại II (Thermo Scientific, mã số 17.101) để đạt nồng độ cuối collagenase chứa 100 đơn vị/ml CaCl2 5mM hòa tan PBS • Thêm 1ml collagenase ủ 15-30 phút (Người sử dụng cần tối ưu hóa thời gian ủ với collagenase) Gảy nhẹ vào đáy ống 10-20 lần Chuyển sang ống ly tâm 15ml Thêm 1ml PBS hút nhả lên, xuống để lấy tế bào từ vật liệu mang Lặp lại bước 4|Page PROTOCOL FOR SEEDING BIONOC II CARRIERS | version Protocol for testing BioNOC™ II carriers Lặp lại bước lần (tổng lần rửa với PBS) Ly tâm, loại bỏ dịch trộn tế bào 0,1-0,5 ml môi trường để đếm tế bào buồng đếm tế bào Tính số tế bào trung bình vật liệu mang Nhuộm CVD (Crystal Violet Dye) Chuyển vật liệu mang từ chai nuôi cấy vào ống 1,5ml Thêm 0,5ml thuốc nhuộm CVD vào ống ly tâm Vortex ống 60 giây Đặt ống vào tủ ấm 37oC Vortex nhiều lần q trình ủ Đếm nhân tính số lượng tế bào vật liệu mang Lưu ý: Thuốc nhuộm CVD cung cấp ESCO, catalogue no.1400014 Khơng thích hợp cho tế bào gốc tiết nhiều chất ngoại bào ECM Nhuộm quan sát tế bào Nhuộm với thuốc nhuộm Lấy 1-2 vật liệu mang BioNOC™II từ chai nuôi cấy Loại nước cố định tế bào ethanol 70% phút, sau ethanol 99,5% phút Rửa etanol hai lần nước khử ion PBS Nhuộm tế bào với hematoxylin, H&E 5-10 phút Rửa thuốc nhuộm với nước khử ion Quan sát vật liệu mang với kính hiển vi Lưu ý: Các loại thuốc nhuộm khác sử dụng VD: Trypan blue Nhuộm huỳnh quang để phát tế bào lại vật liệu mang sau thu hoạch tốt Không sử dụng thuốc nhuộm màu Nhuộm tế bào sống với thuốc nhuộm huỳnh quang Chuyển 1-2 vật liệu mang BioNOC™II từ chai nuôi cấy T sang đĩa 24 giếng, Thêm 500µl mơi trường ni cấy vào giếng Thêm thuốc nhuộm nồng độ cuối cùng: µg/µl Hoescht 33342 (Thermo Fisher, H3570), µM calcein green (Thermo Fisher, C34852 µg/ml PI (propidium iodide, Sigma Aldrich P4170) vào môi trường giếng Ủ vật liệu mang 30 phút 37oC, 5% CO2 trước chụp ảnh lọc tương ứng (xanh nước biển cho Hoechst 33342, màu xanh cho calcein xanh đỏ cho PI) Lưu ý: Các loại thuốc nhuộm huỳnh quang sử dụng để phát tế bào Ví dụ fluorescein diacetate, cell tracker, etc 5|Page PROTOCOL FOR SEEDING BIONOC II CARRIERS | version Protocol for testing BioNOC™ II carriers Hình ảnh nhuộm vật liệu mang Nhuộm Hematoxylin Tế bào gốc trung mô cố định Ngày Ngày Nhuộm huỳnh quang tế bào sống: Tế bào gốc trung mơ 100 µm 100 µm Xanh cây: Calcein green phát tế bào chất, Xanh cây: Hoechst 33342 phát nhân, đỏ: propidium iodide phát tế bào chết (khơng có ít) 6|Page PROTOCOL FOR SEEDING BIONOC II CARRIERS | version