21 Changi South Street Singapore 486777 Tel: +65 65420833 | Fax: +65 65426920 Quy trình thử nghiệm vật liệu mang BioNOCTM II ứng dụng Tide Motion (mô vận động thủy triều) Nội dung Giới thiệu Sinh trưởng tế bào vật liệu mang BioNOC™ II với thiết bị CelXrockerTM Nuôi cấy tế bào CelXrockerTM Khử trùng vật liệu mang BioNOC™II Phủ lớp gắn kết tế bào (nếu yêu cầu) Cấy tế bào lên vật liệu mang Nuôi cấy tế bào Theo dõi sinh trưởng tế bào vật liệu mang BioNOC™ II Thu hoạch đếm tế bào Nhuộm quan sát tế bào Hình ảnh minh họa nhuộm vật liệu mang Proof of Concept - Protocol for BioNOC™ II Giới thiệu Sinh trưởng tế bào vật liệu mang BioNOC™II với thiết bị CelXrockerTM Bằng chế giãn nén tạo lực đẩy môi trường vào khỏi vật liệu mang, thiết bị nuôi cấy công nghệ Tide Motion giúp vận chuyển hiệu khí chất dinh dưỡng (Hình 1) Hình 1: CelCradle™ vận hành dựa nguyên lý thủy triều, tế bào bám vật liệu mang BioNOC™II luân phiên pha: pha cấp khí pha cấp chất dinh dưỡng nhờ chế giãn nén từ phía giúp môi trường đẩy vào CelXrockerTM thiết bị ứng dụng TideMotion quy mô nhỏ giúp thực q trình thử nghiệm với chi phí thấp Trong hệ thống này, tế bào giống cấy lên vật liệu mang BioNOC™II chuyển vào chai nuôi cấy trước đặt lên thiết bị rocker Chuyển động bập bênh mơ hệ thống Tide Motion tạo pha luân phiên cấp khí cấp chất dinh dưỡng đồng thời đảm bảo môi trường nuôi cấy làm nhẹ nhàng (Hình 2) Pha cấp khí Pha dinh dưỡng Hình 2: Giản đồ biểu diễn chuyển động bập bênh chai nuôi cấy mô nguyên lý thủy triều Tide Motion thiết bị CelCradle™ việc tạo pha luân phiên: pha khí pha dinh dưỡng sử dụng CelXrocker 2|Page Proof of Concept – Protocol for BioNOC™ II carriers | version 15 Proof of Concept - Protocol for BioNOC™ II Nuôi cấy tế bào CelXrockerTM Khử trùng vật liệu mang BioNOC™II Khử trùng BioNOC™II chai/bình vật liệu chịu nhiệt Khử trùng vật liệu mang dung dịch PBS Đảm bảo toàn vật liệu mang nằm dung dịch PBS Khử trùng 121oC 20 phút Bảo quản vật liệu mang PBS đến sử dụng Lưu ý: Tránh khử trùng khô vật liệu mang dẫn đến phá vỡ cấu trúc bề mặt vật liệu Phủ lớp gắn kết tế bào (nếu yêu cầu) Chuyển vật liệu mang khử trùng vào ống falcon Hút PBS Phủ lớp gắn kết lên vật liệu mang Toàn vật liệu mang nằm hoàn toàn dung dịch chất gắn kết với thời gian ủ thể tích thích hợp Loại bỏ dung dịch chất gắn kết sau ủ Rửa với PBS cần thiết Bảo quản vật liệu mang phủ gắn kết (XX-coated BioNOC™II) (bảo quản nhiệt độ phù hợp sử dụng) Cấy tế bào lên vật liệu mang Chuyển 30 vật liệu mang vào falcon 50ml Ủ vật liệu mang với lượng tế bào theo yêu cầu ống falcon Lượng tế bào giống tối ưu cấy vật liệu mang gợi ý bảng Thêm mơi trường vào ống falcon đảm bảo tồn vật liệu mang nằm hoàn toàn dung dịch Giá trị pH trì khoảng 7.0 – 7.4 (pH tối ưu 7.2) Loại tế bào Chick embryo fibroblasts (CEF) A-549 Chinese hamster ovary cells (CHO) HEK293T / PK-15 / IBRS-2 Vero Hybridoma (OKT3) MDCK Leghorn male hepatoma (LMH) MARC-145 Human mesenchymal stem cells (hMSCs) Human diploid cells (WI-38 / MRC-5) Mật độ tế bào giống (số tế bào/vật liệu mang) 300,000 – 500,000 200,000 – 300,000 100,000 – 300,000 100,000 – 300,000 100,000 – 300,000 100,000 – 300,000 60,000 – 120,000 50,000 – 200,000 50,000 20,000 – 60,000 15,000 – 20,000 Bảng 1: Mật độ cấy tối ưu loại tế bào khác Lưu ý: Vật liệu mang phù hợp với nhiều loại tế bào khác Vui lịng liên hệ với chúng tơi loại tế bào bạn sử dụng không đề cập 3|Page Proof of Concept – Protocol for BioNOC™ II carriers | version 15 Proof of Concept - Protocol for BioNOC™ II Nhẹ nhàng nghiêng ống xoay 2-3 lần để dung dịch tế bào trộn với vật liệu mang (Mơ tả hình bên dưới) ml Lưu ý: Tránh nghiêng ống 90° hạn chế làm hao hụt tế bào giống Ủ tế bào với vật liệu mang 3-5 tiếng tủ ấm (37°C, 5%CO2), nới lỏng nắp ống falcon đảm bảo cân CO2 Trong ủ đầu tiến 15 phút, vặn chặt nắp, nhẹ nhàng nghiêng ống xoay (như mô tả bước 4) làm lượng tế bào chưa bám dung dịch Vặn lỏng nắp đặt lại vào tủ ấm Trong 2-3 ủ tiếp theo, 30 phút thực lặp lại bước Sau ủ tế bào, mang falcon vào tủ an toàn sinh học cấp II, nghiêng ống xoay từ từ, thu ~50 µl dung dịch đếm tế bào Đếm lượng tế bào dung dịch để xác định hiệu suất gắn tế bào Nếu hiệu suất gắn đạt ≥ 90% (i.e 10% lượng tế bào giống dung dịch), tiến hành bước Nếu hiệu suất chưa đạt mong muốn, tiếp tục ủ theo dõi Tuy nhiên, trình gắn thường kết thúc 3-5 Lưu ý: Để đảm bảo hiệu suất gắn tế bào, tối thiểu vật liệu mang ống falcon 15ml 10 vật liệu mang với falcon 50ml Thêm lượng môi trường đảm bảo vật liệu mang nằm dung dịch Nếu không sử dụng ống falcon, hiệu suất gắn tối ưu khơng đạt Ni cấy tế bào Đặt thiết bị rocker vào tủ ấm CO2 37°C, 5%CO2 Điều chỉnh tốc độ chu kỳ 1(mỗi chu kỳ tính chuyển động rocker từ trái → phải → trái) Sau hoàn thành bước cấy tế bào giống, sử dụng kẹp dài từ từ chuyển vật liệu mang từ ống ly tâm sang chai nuôi cấy T-75 chứa 18 ml (0.6 ml môi trường/vật liệu mang) môi trường Ly tâm đếm tế bào số tế bào lại dung dịch, xác định hiệu suất gắn kết cuối Đặt chai nuôi cấy lên rocker tủ ấm CO2 37°C, 5% CO2 (hoặc điều kiện nuôi cấy tùy thuộc loại tế bào) Thay mơi trường 2-3 ngày theo quy trình nuôi cấy loại tế bào sử dụng Lưu ý: Sau cấy, tế bào bám chưa chắn vào vật liệu mang, cần thao tác nhẹ nhàng để tránh tế bào tách khỏi vật liệu mang Lưu ý: Sử dụng thiết bị Esco CelXrockerTM 2D rocker với tốc độ chậm nhẹ nhàng 4-6 chu kỳ phút Nếu tốc độ nhanh, tế bào bị tách khỏi vật liệu mang sinh trưởng tế bào giảm Trong trường hợp này, cân nhắc nuôi tế bào điều kiện tĩnh, nhiên, tế bào khơng đạt sinh trưởng cực đại môi trường dinh dưỡng thiếu Trong trường hợp không sử dụng rocker, thêm đủ lượng môi trường nuôi tĩnh tế bào Sử dụng 2D rocker tạo điều kiện tối ưu cho thử nghiệm, thiết bị tạo chuyển động luân phiên qua trái qua phải Lựa chọn orbital rocker, 3D rocker ni cấy tĩnh thu kết không tối ưu Lưu ý: Các giá trị đưa nuôi cấy 30 BioNOC™II Lượng mơi trường kích thước chai ni vấy thay đổi theo số lượng BioNOC™II thử nghiệm Ví dụ, Nếu nuôi cấy 50 vật liệu mang BioNOC™II, 4|Page Proof of Concept – Protocol for BioNOC™ II carriers | version 15 Proof of Concept - Protocol for BioNOC™ II cần sử dụng chai nuôi T-175 với 30ml môi trường Không vượt 5ml môi trường (10 vật liệu mang) chai T-25 18ml môi trường (30 vật liệu mang) chai T-75 30ml môi trường (50 vật liệu mang) chai T-175 để tránh làm ướt màng lọc nắp chai q trình ni, tránh nhiễm chéo tồn bước thực Lưu ý: 0.6ml môi trường/vật liệu mang khuyến nghị cho thử nghiệm ban đầu, điều chỉnh loại tế bào khác Thể tích 0.6 ml/vật liệu mang mơ thể tích tương đương nuôi cấy CelCradle (500ml môi trường cho 850 vật liệu mang chai nuôi cấy) Tuy nhiên, lượng mơi trường sử dụng thay đổi nuôi cấy hệ thống perfusion CelCradle, hiểu môi trường tự động trao đổi tuần hồn với chai ni cấy Lưu ý: Trong thử nghiệm đầu tiên, khuyến nghị theo dõi tăng trưởng tế bào suốt q trình ni cấy Thực cách ngày việc thu đếm số tế bào từ mẫu vật liệu mang Thu 1- vật liệu mang nhuộm ngày quan sát sinh trưởng tế bào trực tiếp vật liệu mang (chi tiết mơ tả quy trình bên dưới) Theo dõi sinh trưởng tế bào vật liệu mang BioNOC™II Thu hoạch đếm tế bào Dùng enzyme tách Sử dụng Enzyme tách: Accumax, Trypsin 0.25%, TrypLe Express, Collagenase Chuyển vật liệu mang từ chai nuôi cấy vào tube ly tâm 1.5ml Nhẹ nhàng rửa với 1ml PBS không chứa Ca2+ Mg2+, thực lần (nhẹ nhàng đảo tube lên xuống lần lần rửa) Thực tách Ezyme: i Trypsin/ TrypLE Express: (hầu hết loại tế bào) • Thêm 1ml 0.05 – 0.25% Trypsin-EDTA, ủ 37oC 10-15 phút ii Accumax/ Accutase: (phù hợp với tế bào gốc) • Thêm 1ml Accumax/ Accutase, ủ nhiệt độ phòng 15-30 phút (Thời gian ủ phụ thuộc mật độ tế bào, nên thực thí nghiệm tối ưu thời gian ủ 15 phút, 20 phút 30 phút) Accumax cho thích hợp ni cấy 3D Tuy nhiên, người sử dụng hồn tồn dùng enzyme phương pháp tách tế bào iii Collagenase: (phù hợp với tế bào gốc) • Pha lỗng Collagenase II (Thermo Scientific, Cat 17101) để đạt nồng độ thích hợp chứa 100 unit/ml HBSS • Thêm 1ml collagenase ủ 15-30 phút (có thể tối ưu thời gian ủ enzyme cần thiết) Sau ủ với enzyme, chuyển dung dịch enzyme sang ống ly tâm 15ml Thêm hóa chất trung hịa enzyme PBS (tùy theo loại enzyme sử dụng) vào tube ly tâm 1.5 ml chứa vật liệu mang, sử dụng đầu kẹp gảy vào đáy tube liên 40-60 lần Chuyển dung dịch vào ống ly tâm 15 ml Lặp lại - lần, tối thiểu thêm lần rửa với 1ml PBS môi trường Đếm tế bào trực tiếp ly tâm, thu tế bào, trộn tế bào thể tích phù hợp đếm Tính số tế bào trung bình vật liệu mang 10 Cấy tế bào thu chai nuôi cấy phiến nhiều giếng, kiểm tra hình thái tỉ lệ sống sót sau thu hoạch Lưu ý: Thu tồn vật liệu mang chai ni cấy, điều chỉnh lượng enzyme đảm bảo toàn vật liệu mang nằm enzyme (khoảng 1,5 – 2ml cho 10 vật liệu mang) Nghiêng chai nuôi cấy để vật liệu mang nằm dung dịch enzyme Dùng CVD (Crystal Violet Dye) 5|Page Proof of Concept – Protocol for BioNOC™ II carriers | version 15 Proof of Concept - Protocol for BioNOC™ II Lưu ý: CVD cung cấp ESCO, catalog no.1400014 Tế bào gốc tiết lượng lớn ECM, CVD không phù hợp sử dụng cho tế bào gốc Chuyển vật liệu mang BioNOC™II từ chai nuôi cấy sang tube ly tâm 1.5ml Thêm 0.5 ml CVD vào tube Vortex tube 60 giây Ủ trong tủ ấm 37oC Thực vortex vài lần q trình ủ Đếm nhân tính trung bình số tế bào vật liệu mang Nhuộm quan sát tế bào Nhuộm tế bào Chuyển 1-2 BioNOC™II từ chai nuôi cấy vào phiến 24 giếng Hút dịch môi trường cố định tế bào ethanol 70% - 100% 15 phút Rửa sach ethanol nước khử ion PBS Nhuộm tế bào hematoxylin, H&E 5-10 phút Rửa thuốc nhuộm nước khử ion Quan sát tế bào kính hiển vi Lưu ý: Có thể sử dụng loại thuốc nhuộm khác nhau, ví dụ Trypan blue Sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang để quan sát tế bào tốt lại vật liệu mang sau thu hoạch Không dùng thuốc nhuộm màu trường hợp sau thu hoạch Nhuộm tế bào sống với thuốc nhuộm huỳnh quang Chuyển 1-2 BioNOC™II từ chai nuôi cấy sang phiến 24 giếng Thêm 500 µl mơi trường vào giếng Thêm thuốc nhuộm nồng độ: µg/ml Hoescht 33342 (Thermo Fisher, H3570), uM calcein green (Thermo Fisher, C34852 µg/ml PI (propidium iodide, Sigma Aldrich P4170) mơi trường Ủ 30 phút 37oC, 5% CO2 trước chụp ảnh lọc khác (Xanh dương Hoechst 33342, xanh - calcein green đỏ - PI) Lưu ý: Các thuốc nhuộm huỳnh quang sử dụng để quan sát tế bào Ví dụ fluorescein diacetate, Cell tracker etc 6|Page Proof of Concept – Protocol for BioNOC™ II carriers | version 15 Proof of Concept - Protocol for BioNOC™ II Hình ảnh minh họa nhuộm vật liệu mang Tế bào gốc trung mô MSC cố định nhuộm với hematoxylin Ngày Ngày Tế bào gốc trung mô MSC nhuộm huỳnh quang 100 µm 100 µm Xanh lá: Calcein green nhuộm tế bào chất, xanh dương: Hoechst 33342 nhuộm nhân, đỏ: propidium iodide nhuộm tế bào chết (khơng thấy quan sát) 7|Page Proof of Concept – Protocol for BioNOC™ II carriers | version 15 ... 30 BioNOC? ? ?II Lượng mơi trường kích thước chai ni vấy thay đổi theo số lượng BioNOC? ? ?II thử nghiệm Ví dụ, Nếu ni cấy 50 vật liệu mang BioNOC? ? ?II, 4|Page Proof of Concept – Protocol for BioNOC? ?? II. .. 15 Proof of Concept - Protocol for BioNOC? ?? II cần sử dụng chai nuôi T-175 với 30ml môi trường Không vượt 5ml môi trường (10 vật liệu mang) chai T-25 18ml môi trường (30 vật liệu mang) chai T-75... Protocol for BioNOC? ?? II Nuôi cấy tế bào CelXrockerTM Khử trùng vật liệu mang BioNOC? ? ?II Khử trùng BioNOC? ? ?II chai/bình vật liệu chịu nhiệt Khử trùng vật liệu mang dung dịch PBS Đảm bảo toàn vật liệu mang