Bài viết Nghiên cứu tạo và nhân nuôi rễ bất định cây lạc làm nguồn nguyên liệu thu nhận hợp chất resveratrol được tiến hành nhằm cảm ứng tạo rễ bất định cây lạc và bước đầu khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng rễ bất định làm nguồn nguyên liệu thu nhận hợp chất resveratrol.
Vietnam J Agri Sci 2022, Vol 20, No 11: 1528-1538 Tạp chí Khoa học Nơng nghiệp Việt Nam 2022, 20(11): 1528-1538 www.vnua.edu.vn NGHIÊN CỨU TẠO VÀ NHÂN NUÔI RỄ BẤT ĐỊNH CÂY LẠC LÀM NGUỒN NGUYÊN LIỆU THU NHẬN HỢP CHẤT RESVERATROL Đinh Trường Sơn, Chử Thị Thu Huyền, Nguyễn Thị Hạnh, Ninh Thị Thảo* Khoa Công nghệ sinh học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam * Tác giả liên hệ: ntthao@vnua.edu.vn Ngày nhận bài: 22.08.2022 Ngày chấp nhận đăng: 22.11.2022 TĨM TẮT Resveratrol hợp chất có khả chống oxy hố cao tìm thấy số loại mọng rễ lạc Nghiên cứu tiến hành nhằm cảm ứng tạo rễ bất định lạc bước đầu khảo sát số yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng rễ bất định làm nguồn nguyên liệu thu nhận hợp chất resveratrol Mô lạc nuôi cấy môi trường MS chứa -NAA, IBA IAA (1-10 mg/l), đường sucrose (20-50 g/l) điều kiện chiếu sáng điều kiện tối hoàn toàn nhằm cảm ứng tạo rễ bất định Rễ bất định tái sinh trực tiếp từ mô tốt môi trường MS bổ sung mg/l -NAA, 30 g/l đường, ni cấy tối hồn toàn, với tỉ lệ mẫu tạo rễ đạt 87,5% số rễ/mẫu đạt 5,5 rễ sau tuần nuôi cấy Sự tăng trưởng đoạn rễ bất định lạc (có chiều dài 1,0cm) ni cấy mơi trường MS tốt so với môi trường 1/2 MS, B5 1/2 B5 Bổ sung -NAA, IBA IAA có tác dụng tích cực thúc đẩy sinh trưởng rễ bất định lạc Tỉ lệ đoạn rễ phân nhánh số nhánh/rễ đạt cao nhất, tương ứng đạt 100% 4,9 rễ, nuôi cấy môi trường MS + mg/l -NAA sau tuần nuôi cấy Từ khoá: Auxin, lạc, rễ bất định, resveratrol, sucrose Induction and Culture of Adventitious Peatnut Roots as a Source of Resveratrol ABSTRACT Resveratrol as a phytochemical with strong antioxidant properties was found in certain berries and in peatnut roots This study was conducted to induce adventitious roots of peatnut and investigate some factors affecting the growth of adventitious roots as a source of resveratrol Leaf explants were cultured on MS medium supplemented with α-NAA, IBA and IAA (1-10 mg/l), sucrose (20-50 g/l) under light and dark culture conditions to induce formation of adventitious roots The results showed that direct formation of adventitious roots from peanut leaves was best on MS medium containing mg/l α-NAA and 30 g/l sucrose cultured in full darkness with 87.5% rooting rate and 5.5 roots per explant after weeks of culture The growth of adventitious roots (1.0cm in length) when cultured on MS medium sustained better than ½ MS, B5 and ½ B5 media A positive effect of auxin including α-NAA, IBA and IAA on adventitious root growth was found The maxium percentage of adventitious root segment producing lateral roots and highest number of lateral roots/segment, (100% and 4.9 roots, respectively) were obtained on MS + mg/l α-NAA after weeks of culture Keywords: Adventitious roots, auxin, peanuts, resveratrol, sucrose ĐẶT VẤN ĐỀ Resveratrol l mt phytoalexin ỵc tng hp bi mt s loài thăc vêt để bâo vệ chúng chống läi iu kin bỗt li sinh hc v phi sinh hc (Gligorijević & cs., 2021) Các nghiên cĀu chỵ rỡng resveratrol cú rỗt nhiu dỵc tớnh tt nhỵ khỏng oxy hũa, khỏng viờm, tởng 1518 cỵng dch, ngởn nga ung thỵ, bõo v tim mọch, chng lóo húa, giâm mĈ máu, trð chĀng cao huyết áp (Salehi & cs., 2018; Khattar & cs., 2022) Do vờy, hoọt chỗt có mặt nhiều lội thuốc thăc phốm tởng cỵng, bõo v sc kho Nhu cổu s dýng v thỵng húa hoọt chỗt resveratrol ngy cng tởng, hm lỵng resveratrol cõy trng t nhiên Đinh Trường Sơn, Chử Thị Thu Huyền, Nguyễn Thị Hnh, Ninh Th Tho lọi rỗt thỗp Vỡ vờy, tởng nởng suỗt thu nhờn resveratrol t cỏc ngun cú sn giâi pháp hiệu quâ Trong tă nhiên, resveratrol ỵc tỡm thỗy nhiu vú quõ nho ú, quõ dõu tõy, r cõy lọc (ờu phng), quõ vit quỗt số loäi hoa quâ khác (Tian & cs., 2019) Mc dự hm lỵng resveratrol r cõy lọc khỏ thỗp, chợ 1,19g 1g chỗt tỵi, so vi 50,01 g/g q mâm xơi hay 24,06 g/g vó q nho (Khattar & cs., 2022), rễ läc läi nguồn nguyên liệu tiềm nëng để thu nhên resveratrol giỏ thnh thỗp v di 2.2 Phng phỏp nghiờn cu Nuụi cỗy r in vitro ỵc xem l mt giõi phỏp thay th ổy tim nởng, khớc phýc ỵc nhng họn ch cỷa phỵng phỏp nuụi trng truyn thng thu nhờn hoọt chỗt th cỗp t thc vờt, khõ nởng sõn xuỗt n nh ỵc mt lỵng lĆn sinh khối säch thąi gian ngín (Hussain & cs., 2022) Mt khỏc, nuụi cỗy r in vitro, vic b sung cỏc chỗt kớch hoọt (elicitor) giỳp tởng ỏng k khõ nởng tớch lỹy cỏc hp chỗt th cỗp quỏ trỡnh nhõn nhanh sinh r Bờn cọnh ũ, nuụi cỗy r in vitro cũn giỳp ti ỵu hũa quỏ trỡnh chit xuỗt hoọt chỗt mýc tiờu (Khanam & cs., 2022) ó cú rỗt nhiu nghiờn cu sā dýng vi khuèn Agrobacterium rhizogenes để câm Āng täo rễ tĄ läc, sau đị nhån ni tëng sinh r nhỡm thu nhờn hp chỗt resveratrol (Yang & cs., 2015; Kim & cs., 2008; Park & cs., 2021; Medina-Bolivar & cs., 2007) Tuy nhiờn, cho n nay, chỵa cị cơng bố liên quan đến täo nhân nuụi r bỗt nh cõy lọc iu kin in vitro Nghiờn cu ny ỵc tin hnh nhỡm cõm ng tọo r bỗt nh cõy lọc iu kin in vitro v bỵc ổu khõo sỏt mt s yu t n s sinh trỵng r bỗt nh lm tin cho vic thit lờp quy trỡnh sõn xuỗt cỏc hp chỗt th cỗp phýc vý cụng nghip dỵc liu Việt Nam Phương pháp tạo rễ bất định: Lá cûa họt lọc nõy mổm trờn mụi trỵng gieo họt ỵc gõy vt thỵng bỡng cỏch dựng dao cớt hai ổu lỏ, sau ũ t mt dỵi lỏ tip xỳc vi mụi trỵng MS b sung auxin -NAA/IBA/IAA (0; 1; 2,5; v 10 mg/l), ỵng sucrose (0, 20, 30, 40 v 50 g/l) v nuụi cỗy hai iu kin chiếu sáng (16h sáng/8h tối tối hoàn toàn) Đánh giá thí nghiệm tn Các chỵ tiêu theo dõi bao gồm tỵ lệ méu täo rễ (%), số rễ/méu (rễ) tỵ lệ méu täo callus (%) PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu Vêt liệu sā dýng nghiên cĀu hät läc giống L14 Trung tâm Nghiên cĀu Phát triển Đêu đỗ cung cỗp Phng phỏp kh trựng ht: Họt lọc sau sọch bỡng nỵc 3-5 phỳt ỵc kh trựng bìng cồn 70% phút HgCl2 0,1% 15 phỳt, ri sọch bỡng nỵc cỗt vụ trựng læn, læn phút Tiếp theo, ngâm hät nỵc vụ trựng 12 gi Họt lọc sau ũ ỵc gieo trờn mụi trỵng MS (Murashige & Skoog, 1962) b sung 30 g/l ỵng sucrose, t iu kiện 16h sáng/8h tối, nhiệt độ 25 2C tn để kích thích hät nây mỉm Phương pháp nhõn nuụi r bt nh: Sau tuổn nuụi cỗy, cỏc r bỗt nh hỡnh thnh t mụ lỏ cõy lọc ỵc cớt thnh cỏc oọn mộu cú kớch thỵc khoõng 1,0cm v nuụi cỗy trờn mụi trỵng MS hoc mụi trỵng Gamborg B5 (Gamborg & cs., 1968) vi hm lỵng mui khoỏng ổy ỷ hoc giõm 1/2, b sung 30 g/l ỵng sucrose, cú hoc khụng cú b sung chỗt iu tit sinh trỵng thuc nhúm auxin (-NAA/IBA/IAA) nồng độ khác (0,1-1 mg/l) để khâo sát khõ nởng tởng trỵng cỷa r cõy lọc ỏnh giỏ thí nghiệm tn Các chỵ tiêu theo dõi bao gồm tỵ lệ rễ phân nhánh (%) số rễ nhánh/méu (rễ) Môi trường điều kiện nuôi cấy: Mụi trỵng nuụi cỗy ỵc iu chợnh pH = 5,8 trỵc hỗp kh trựng nhit 121C 20 phỳt, 1,1atm iu kin nuụi cỗy in vitro l 16h sỏng/8h ti, cỵng ỏnh sỏng 2.000-2.500lux, nhit 25 2C Bố trí thí nghiệm: Các thí nghiệm ỵc b trớ hon ton ngộu nhiờn, nhớc lọi lỉn, lỉn 30 méu vĆi thí nghiệm täo rễ bỗt nh v 40 mộu i vi thớ nghim nhõn nuôi rễ 1519 Nghiên cứu tạo nhân nuôi rễ bất định lạc làm nguồn nguyên liệu thu nhận hp cht resveratrol X lý thng kờ: S liu ỵc xā lý bìng phỉn mềm thống kê InfoStat Phân tích phỵng sai (ANOVA) v so sỏnh cỏc giỏ tr trung bỡnh bỡng phỵng phỏp kiờm nh LSD mc ý nghïa 5% KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khâ tạo rễ bất định từ mô lạc 3.1.1 Ảnh hưởng -NAA/IBA/IAA đến khả tạo rễ bất định từ mơ lạc Să hình thành r bỗt nh in vitro l quỏ trỡnh ỵc iu khin bi mụi trỵng nuụi cỗy v cỏc yu t ni sinh nhỵ nhit , ỏnh sỏng, chỗt kớch thớch sinh trỵng, ỵng, chỗt khoỏng v cỏc phõn t khỏc Chỗt kớch thớch sinh trỵng auxin va cú õnh hỵng trăc tiếp (tham gia vào trình phån chia tởng trỵng t bo), va cú õnh hỵng giỏn tip (tỵng tỏc vi cỏc chỗt kớch thớch v cỏc phõn t khỏc) n s hỡnh thnh r bỗt nh (Pop & cs., 2011) B sung auxin vo mụi trỵng nuụi cỗy ỵc chng minh l cú hiu quõ tớch cc cõm ng tọo r bỗt nh nhiu loi thc vờt nhỵ cõy ba kớch (Ninh Th Thõo & cs., 2016), cõy nhu (Nguyn Th Ngc Hỵng & Vừ Thð Bäch Mai, 2009) Kết quâ ć bâng cho thỗy ba auxin gm -NAA/IBA/IAA cú tỏc dýng kớch thớch s hỡnh thnh r bỗt nh cõy lọc vi tỵ lệ méu täo rễ số rễ/méu biến động tuĊ thuộc vào loäi auxin nồng độ sā dýng (Bõng 1) Cý th, cụng thc mụi trỵng khụng bổ sung auxin, mơ läc hồn tồn khơng tọo r (Bõng 1) Trờn mụi trỵng b sung -NAA, tợ l mụ lỏ cõy tọo r bỗt nh dao động 20-76,7% Tỵ lệ méu täo rễ tëng dỉn ọt cao nhỗt cụng thc mụi trỵng b sung mg/l v 10 mg/l -NAA, tỵng ng ọt 70% v 76,7% ng thi, s lỵng r/mộu cao nhỗt cỹng ghi nhờn ỵc trờn mụi trỵng cha mg/l v 10 mg/l -NAA, tỵng ng ọt 4,1 v 3,6 r (Bõng 1) Quan sỏt hỡnh thỏi mộu cho thỗy, sau 5-7 ngy nuụi cỗy, cỏc mộu lỏ cú xu hỵng cong lờn trờn b mt mụi trỵng v sau 7-10 ngy, callus bớt ổu xuỗt hin tọi v trớ vt cít vĆi tỵ lệ méu täo callus tëng tỵ lệ thuên vĆi nồng độ -NAA sā dýng đät cao nhỗt (90%) b sung 5-10mg/-NAA vo mụi trỵng nuụi cỗy (Bõng 1, Hỡnh 1) Sau 15-20 ngy, r bớt đỉu hình thành, rễ có màu tríng vàng nồu, ởn sồu xung mụi trỵng v khụng phõn nhỏnh (Hỡnh 1) Tỵng t nhỵ -NAA, IAA v IBA cỹng cị tác dýng kích thích méu läc täo r bỗt nh vi tợ l dao ng t 3,3-66,7% số rễ/méu đät dao động 0,2-2,6 rễ (Bâng 1) Tỵ lệ méu täo rễ tëng tỵ lệ thn vĆi nng IAA/IBA v ọt cao nhỗt cụng thc bổ sung 10 mg/l IAA (66,7%) 5-10 mg/l IBA (16,7-26,7%) S r/mộu trờn cỏc cụng thc mụi trỵng b sung IAA/IBA ć nồng độ 2,5 mg/l să sai khác ć mĀc ċ nghïa P