(TIỂU LUẬN) VI SINH NÔNG NGHIỆP VI SINH vật cố ĐỊNH đạm tự DO

VI SINH NÔNG NGHIỆP VI SINH VẬT CỐ ĐỊNH ĐẠM TỰ DO GVHD: ThS Nguyễn Mỹ Phi Long NHÓM 9: Lê Anh Tuấn – 19150236 Nguyễn Hồ Phú Lộc – 19150376 Lê Nguyễn Thảo Ngân – 19150389 VÒNG TUẦN HOÀN NITO TRONG TỰ NHIÊN  Ngược lại với trình nitrat hố q trình phảả̉n nitrat hố, tức trình khử nitrat thành nitơ phân tử Sau trình phảả̉n nitrat hố, nitrat chuyển thành nitơ phân tử bay vào khơng khí  Những tổn thấấ́t nitơ q trình phảả̉n nitrat hố gây nên bù đắp lại nhờ mợộ̣t q trình sinh học đặc biệt gọi trình cố định nitơ, tức q trình chuyển hố nitơ phân tử thành hợp chấấ́t chứa nitơ Clostridium pausterianum Giống Clostridium vi khuẩn gram dương, hình que, kị khí, sinh bào tử phần lớn di đợộ̣ng, thuỷ giảả̉i sacchoride prơtêin Nhiều lồi thuỷ giảả̉i prơtêin chuyển hố khơng hồn tồn axit amin tạo thành mùi rấấ́t khó chịu sảả̉n phẩm Lồi có hoạt tính cố định nitơ cao nhấấ́t Clostridium pasteurianum Bào tử có kích thứơc 1,3x1,6 µm, thường có hình bầu dục hay hình kéo dài nằm mợộ̣t đầu tế bào Bào tử có kích thước lớn rợộ̣ng tế bào dinh dưỡng, mang bào tử tế bào có hình thoi Khuẩn lạc trắng, phẳng sang Clostridium pausterianum  Clostridium đờồ̀ng hố ng̀ồ̀n thức ăn nitơ vô hữu Về thức ăn cacbon, chúấ́ng sử dụng nhiều loại hợp chấấ́t khác So với Azotobacter chúấ́ng mẫn cảả̉m K, P, Ca có tính ổn định cao pH thấấ́p cao môi trường  Clostridium phát triển thích hợp đấấ́t có đợộ̣ ẩm vào khoảả̉ng 60-80% so với độộ̣ ẩm tuyệt đối Chúấ́ng phát triển tốt lớp đấấ́t cày có chấấ́t hữu phong phúấ́  Chỉ có loại Clostridium ưa ẩm có khảả̉ đồồ̀ng cố định nitơ phân tử, chúấ́ng tốt nhấấ́t nhiệt độộ̣ 25 – 30oC  Vi khuẩn thuộộ̣c lồi Clostridium pasteurianum thường có hoạt tính cố định cao lồi Clostridium khác Khi đờồ̀ng hố hết 1g thức ăn bon, chúấ́ng thường tích luỹ khoảả̉ng 5-10mg nitơ Khảả̉ cố định nitơ loài chi Clostridium cịn phụ tḥộ̣c rấấ́t nhiều vào điều kiện nuôi cấấ́y PHÂN LẬP Thu mẫu Tiến hành phân lập theo quy trình sau: Dung dao vô trung lấy kg đất độ sâu – 30cm thuộc chỗ khac theo phương phap dựng đương cheo rồi trộn lai vơi nhau, lấy giấy bong mơ đã khư trung đê đựng đất, loai bỏ rễ va vật la Ghi nhận, bảo quản va phân tich tai phong thi nghiêm Cân chinh xac cac phân cua môi trương Đun sôi, điêu chinh pH = Cho vao 1/3 erlen Cho vao petri Cấy dich đã pha lỏng cac nồng độ khac Dung trang thuy tinh trang đêu Nuôi tu ấm 30oC – (khi co khuân lac) Glucoza (saccaroza) K2HPO4 CaHPO4 MgSO4 K2SO4 NaCl FeC3 CaCO3 Hỗn hợp nguyên tô vi lượng Nước cất Glucoza K2HPO4 MgSO4 NaCl, FeSO4OMnSO4 Nước Hỗn hợp nguyên tố vi lượng H3PO3 (NH4)MO7O24 KI NaBr ZnSO4 Al2(SO4)3 Nước Lấy một it đất (clost găp cả đất axit va đất mêm) pha loãng - lân lấy một it CaCO3 từ đay ông nghiêm cấy sang ông khac Nuôi -3 lân cấy chuyên vậy Khuân lac se xuất hiên bên lơp thach tron sau vai nuôi cấy Dung trang thuy tinh phân phôi đêu huyên phu vi sinh vật lên bê măt thach Sau đo đăt vao tu ấm nuôi 30 oC – Khuân lac xuất hiên, theo dõi thương xuyên Chon cac khuân lac co đăc điêm hinh thai khac đưng riêng re Dung que cấy lấy một it vi sinh vật khuân lac vi sinh vật đo cấy lên ông thach nghiêng, đem nuôi nhiêt độ 30 – 35oC THEO DÕI SINH TRƯỞNG Khi biết tốc đợộ̣ sinh trưởng ta tính số hệ dựộ̣ đoán số lượng tế bào sau mợộ̣t thời gian ni cấấ́y nhấấ́t định từồ̀ đưa vào ứng dụng sảả̉n xuấấ́t Nuôi đĩa petri, đo kich thươc (micromet) cua khuân lac băng thươc đo palmer thơi gian 24 giơ hoăc 48 giơ hoăc 72 giơ Từ đo tôc độ sinh trương theo Blachman (1981) P = (Wt-Wo)x100%/Wo Wo la sô đo lân đâu Wt la sô đo lân sau tai thơi điêm t Đương cong sinh trương cua quân thê vi khuân ni cấy khơng liên tuc XÁC ĐỊNH SỚ LƯỢNG VI SINH VẬT THEO PHƯƠNG PHÁP CFU (colony-forming unit) - Từ mâu ban đâu sau đo pha loãng theo dãy thập phân - Cấy vao môi trương thach vô trung - Nuôi 30oC – - Xac đinh sô lương khuân lac đĩa petri - Tinh sô lương theo công thưc N A (CFU/g hay CFU/ml) = ———————————– n1Vf1 +…+ n2Vf2 Trong đó: - A: Sô tê bao (đơn vi hinh khuân lac) vi khuân 1g hay 1ml mâu) - N: tông sô khuân lac đêm đươc cac đĩa đã chon (25-250 khuân lac theo FDA Food ang Drug Asministration) - ni: Sô đĩa cấy tai độ pha loãng thư i - V: thê tich dich mâu (ml) cấy vao mỗi đĩa - fi: độ pha loãng tương ưng Kếấ́t nghiên cứu Phân lậậ̣p vi khuẩn Azotobacter Từồ̀ 20 mẫu đấấ́t thu thậộ̣p, đãễ̃ phân lậộ̣p 14 chủng vi khuẩn có khảả̉ Azotobacter mọc tạo khuẩn lạc môi trường phân lậộ̣p đặc hiệu không chứa nguồồ̀n nitơ Trong số 14 chủng đãễ̃ phân lậộ̣p, có chủng sinh trưởng phát triển mạnh môi trường Ashby Kết quảả̉ nhậộ̣n dạng chủng vi khuẩn đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào vi khuẩn, xác định mộộ̣t số đặc điểm sinh hóa (theo khóa phân loại Bergey, 1989) cho phép khẳng định chủng vi khuẩn Azotobacter có khảả̉ cố định nitơ, gram âm, tạo bào nang với thành dày, có khảả̉ di đợộ̣ng, có hoạt tính catalase oxidase, có khảả̉ đờồ̀ng hóa mannitol, glucose, lactose, fructose, sucrose (bảả̉ng 1) Bảả̉ng Phân lậộ̣p nhậộ̣n dạng chủng Azotobacter sau 72 nuôi cấấ́y môi trường Ashby mannitol agar 300C Kếấ́t nghiên cứu Tuyển chọn chủng cóấ́ khả cốấ́ định nitơ Kết quảả̉ nhậộ̣n cho thấấ́y cảả̉ chủng Azotobacter có khảả̉ cố định nitơ (vì chủng sinh trưởng mơi trường Ashby agar khơng chứa nitơ → chúấ́ng có khảả̉ cố định N2 thành NH4+) Bảả̉ng Khảả̉ cố định nitơ chủng Azotobacter sau 72 giờ, ni lắc 125 vịng/phúấ́t, 300C Kếấ́t nghiên cứu Tuyển chọn chủng cóấ́ khả sinh tổng hợậ̣p IAA Kết quảả̉ khảả̉ sinh tổng hợp IAA chủng Azotobacter cho thấấ́y cảả̉ chủng vi khuẩn sinh tổng hợp IAA Trong số chủng vi khuẩn đãễ̃ phân lậộ̣p, có chủng AZT1 AZT7 vừồ̀a có khảả̉ cố định nitơ, vừồ̀a sinh IAA với hàm lượng cao Bảả̉ng Khảả̉ sinh tổng hợp IAA chủng Azotobacter sau 72 ni lắc 125 vịng/phúấ́t 300C Kếấ́t nghiên cứu Ảnh hưởng điều kiện nuôi cấấ́y Bảả̉ng Ảnh hưởng pH môi trường nguồồ̀n carbon đến khảả̉ sinh trưởng, cố định nitơ sinh tổng hợp IAA chủng AZT1 AZT7 Beijerinckia indica Beijerinckia vi khuẩn dị dưỡng, hiếu khí, gram âm, khơng sinh bào tử, tế bào chúấ́ng có hình dạng thay đổi (hình que, hình cầu hình bầu dục), già tạo nên hình thái rấấ́t khác thường Chúấ́ng tiết nhiều enzyme nitrogenase có khảả̉ khử nitơ Vi khuẩn Beijerinckia chịu chua cao nhiều so với Azotobacter, phát triển cảả̉ mơi trường có pH = 3, phát triển mơi trường trung tính kiềm yếu Beijerinckia indica có tốc đợộ̣ cố định nito phân tử nhanh nhấấ́t nhóm Beijerinckia Tế bào có kích thước 0.5 – 1,5 x 1,7 – 3,0 µm, di đợộ̣ng khơng di đợộ̣ng, có khảả̉ sinh sắc tố già, sắc tố có màu từồ̀ đỏả̉ đến nâu, sắc tố không khuếch tán vào môi trường Khuẩn lạc có dạng lờồ̀i, mép phẳng, nhầy Beijerinckia indica • Vi khuẩn thuộc giống Beijerinckia thường cố định 16 – 20 mg nito phân tử đồng hóa hết 1g chất lượng Beijerinckia thuộc loại vi khuẩn hiếu khí bắt buộc, chúng đồng hóa tốt loại monosaccharide, disaccharide tinh bột, đồng hóa acid hữu • pH thích hợp Beijerinckia 4,5 – 6,0 ; pH = 3,0 phát triển Và chúng phát triển nhiệt độ 16 – 37oC Ngoài chúng có khả giữ sức sống lâu 0oC thấp PHÂN LẬP: 1) Lấy mẫu: Lấy mẫu đất xung quanh vùng rễ cây: lúa, ngơ, khoai nước,… nơi có độ ẩm cao đất có tính axit trung tính Độ sâu thu mẫu đất – 20 cm Dùng tay tách nhẹ phần đất bám quanh rễ lúa cho vào túi nylon vơ trùng đưa phịng thí nghiệm để phân lập Nếu mẫu xa phải trữ lạnh đưa phịng thí nghiệm nhanh chóng 2) Tiên hanh phân lâp theo quy trinh sau: Cân chinh xac cac phân cua môi trương Đun sôi, điêu chỉnh pH = 6,5 Cho 10 g mẫu đất, thêm 90 ml nước cất vô trùng vào erlen Pha loảng mẫu cac nông đô khac từ 10-1, 10-2, 10-3, 10-4,…,10-10 Hút 50 µl mẫu (ở nồng độ) nhỏ lên đĩa thạch Dùng que thủy tinh vô trùng trải mẫu Ủ tu âm 30oC – (khi co khuân lac) Hợậ̣p chấấ́t Đường Glucose K2HPO4 KH2PO4 MgSO4 x H2O FeSO4 x H2O MnSO4 x H2O ZnSO4 x H2O CuSO4 x H2O Na2MoO4 x H2O Thạch Nước cấấ́t Lưu ý: Điều chỉnh pH đến 6,5 Khử trùng riêng glucose (10g chế phẩm 50 ml H2O) trộộ̣n sau để nguộộ̣i Môi trường Beijerinckia Medium (DSMZ Medium 111) Xác định hàà̀m lượậ̣ng NH4 + vi khuẩn tạo phương pháp so màà̀u (thuốấ́c thử phenol - nitroprusside) Húấ́t cẩn thậộ̣n 0,5 ml phần dịch sau ly tâm dịch nuôi vi khuẩn cho vào ống nghiệm đãễ̃ chứa sẵn ml nước cấấ́t khử trùng cộộ̣ng với 0,5 ml EDTA Thêm ml dung dịch Phenol nitroprusside ml dung dịch Sodium hypocloride vào mỗễ̃i ống, trộộ̣n dung dịch máy Vortex Để ổn định nhiệt độộ̣ phịng khoảả̉ng 30 phúấ́t Sau tiến hành đo OD bước sóng 636 nm (OD636nm) Kết quảả̉ đo OD dịng vi khuẩn thay vào phương trình đờồ̀ thị đường chuẩn, từồ̀ suy hàm lượng ammonium sinh dung dịch Xác định hàà̀m lượậ̣ng nitrogenase đượậ̣c tạo phương pháp khử acetylene: _ Tiến hành bơm acetylene vào ống nghiệm có chứa vi khuẩn, lấấ́y ml chạy sắc ký để xác định lượng khí ethylene sinh acetylene lại quy hàm lượng nitrogenase (Tilak et al., 2006) Phương pháp nhậậ̣n diện vi khuẩn Định danh vi khuẩn phương pháp giảả̉i trình tựộ̣ gen 16S Tách chiết DNA tổng số vi khuẩn nhân đoạn gen mãễ̃ hóa 16S rRNA kỹ thuậộ̣t PCR (Polymerase Chain Reaction) Xác định trình tựộ̣ đoạn gen mãễ̃ hóa 16S rRNA theo phương pháp Sanger, sử dụng máy đọc trình tựộ̣ tựộ̣ đợộ̣ng ABI PRISM 3100 Avant Data Collection v1.0 Sequence Analysis Trình tựộ̣ đoạn gen mãễ̃ hóa 16S rRNA mẫu so sánh với đoạn gen mãễ̃ hóa 16S rRNA đãễ̃ công bố Blast Search Sử dụng phần mềm Clustal X, Bioedit để phân loại chủng vi khuẩn Xử lý số liệu: Số liệu xử lý theo phương pháp thống kê sinh học phần mềm Excel 2010 Statistix 10.0 ỨNG DỤNG • Một số nghiên cứu cho biết lực cố định nito B indica B fluminensis tăng lên nhiều có mặt lồi nấm men Lipomyces starkey (Y Dommergues, 1965) • Ngồi Beijerinckia cịn ứng dụng q trình ngâm chiết sinh học tuyển khống Lipomyces starkey Bảng Hiệu sử dụng số phân vi sinh cố định đạm trồng CAM ƠN THẦY VÀ CÁC BẠN ĐÃ THEO DÕI ... Chủng vi sinh cố định đạm (Nitơ) Azotobacter - Trong đấấ́t, Azotobacter tậộ̣p trung vùng đấấ́t xung quanh rễễ̃ phân bố Vi khuẩn Azotobacter vinelandii - Các chủng vừồ̀a có khảả̉ cố định. .. có khảả̉ cố định nitơ, sinh tổng hợp IAA cao đãễ̃ tuyển chọn môi trường Ashby lỏả̉ng, có pH 4, 5, 6, 7, 8, Xác định đặc điểm sinh trưởng, khảả̉ cố định nitơ sinh tổng hợp IAA chủng vi khuẩn... Dung que cấy lấy một it vi sinh vật khuân lac vi sinh vật đo cấy lên ông thach nghiêng, đem nuôi nhiêt độ 30 – 35oC THEO DO? ?I SINH TRƯỞNG Khi biết tốc độộ̣ sinh trưởng ta tính số hệ