Luận văn thạc sĩ HUS xây dựng cơ sở dữ liệu địa lý phục vụ quản lý hoạt động của tàu tại cầu cảng cấm và cảng nam hải, hải phòng

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -* - Nguyễn Tuấn Anh BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT MỘT SỐ GEN CÓ TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG TRONG HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội – 2016 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN -* - Nguyễn Tuấn Anh BƯỚC ĐẦU KHẢO SÁT MỘT SỐ GEN CÓ TIỀM NĂNG ỨNG DỤNG TRONG HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG Chuyên ngành: Sinh học Thực nghiệm Mã số: 60420114 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Nguyễn Lai Thành TS Phạm Cẩm Phương Hà Nội – 2016 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Lai Thành, người thầy trực tiếp hướng dẫn thực luận văn cao học Thầy tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm làm việc giúp tơi hồn thành nghiên cứu Trong q trình nghiên cứu học tập, tơi ln nhận lời nhận xét, góp ý q báu từ thầy để thực tốt nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn TS Phạm Cẩm Phương, người hướng dẫn người quản lý trực tiếp trình nghiên cứu làm việc Đơn vị Gen trị liệu Chị hỗ trợ, truyền đạt kiến thức cho đóng góp đáng giá để tơi hồn thành tốt nghiên cứu Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo Trung tâm Y học hạt nhân Ung bướu, đặc biệt GS.TS Mai Trọng Khoa PGS.TS Trần Đình Hà, thầy tạo điều kiện hết mức cho tiến hành nghiên cứu Đơn vị Gen trị liệu - bệnh viện Bạch Mai Tôi xin cảm ơn tập thể cán Đơn vị Gen trị liệu, đặc biệt TS Nguyễn Thuận Lợi, ThS Nguyễn Tiến Lung, người dẫn, giúp đỡ tận tình suốt thời gian tơi thực nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới thầy cô công tác môn Sinh học Tế bào thầy cô Khoa Sinh học truyền đạt cho kiến thức q giá để thực luận văn vận dụng công việc Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè người thân quan tâm, động viên tinh thần suốt trình học tập thực luận văn tốt nghiệp Hà Nội, ngày 13 tháng 12 năm 2016 Nguyễn Tuấn Anh LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 Chương - TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỀ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 1.1.1 Giới thiệu chung 1.1.2 Chẩn đoán giai đoạn ung thư đại trực tràng .6 1.1.3 Chẩn đốn mơ bệnh học ung thư đại trực tràng 1.1.4 Các chất điểm khối u thường dùng .9 1.2 MỘT SỐ CƠ CHẾ PHÂN TỬ VÀ ỨNG DỤNG TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG .10 1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ MỘT SỐ CHỈ THỊ PHÂN TỬ TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 17 1.3.1 Đích VEGF - chống tăng sinh mạch bệnh nhân UTĐTT 18 1.3.2 Đích EGFR UTĐTT 20 1.3.3 Các tín hiệu hạ nguồn khác EGFR .24 1.3.4 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 25 Chương - ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27 2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 27 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn 27 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 27 2.1.3 Phương pháp chọn mẫu 27 2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.3 THIẾT BỊ, VẬT TƯ VÀ HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU 28 2.3.1 Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 28 2.3.2 Các vật tư tiêu hao sử dụng nghiên cứu 29 2.3.3 Các hóa chất sử dụng nghiên cứu 29 2.4 CÁC BƯỚC THỰC HIỆN 30 2.4.1 Sàng lọc bệnh nhân 30 2.4.2 Thu thập thông tin bệnh nhân 31 2.4.3 Xác định trạng thái đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA 31 2.4.4 Phân tích kết SPSS 23.0 35 i LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chương - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .36 3.1 ĐẶC ĐIỂM BỆNH HỌC CỦA NHÓM ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 39 3.2 BIẾN ĐỔI CỦA CÁC GEN KRAS, NRAS, BRAF VÀ PIK3CA TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG 41 3.2.1 Biến đổi gen KRAS .41 3.2.2 Biến đổi gen NRAS .43 3.2.3 Biến đổi gen BRAF 44 3.2.4 Biến đổi gen PIK3CA 45 3.2.5 Nhận xét chung 47 3.3 TƯƠNG QUAN GIỮA TRẠNG THÁI ĐỘT BIẾN GEN VÀ CÁC ĐẶC ĐIỂM CỦA BỆNH NHÂN 49 3.4 BÀN LUẬN .53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 KẾT LUẬN 60 KIẾN NGHỊ .60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 Tiếng Việt 61 Tiếng Anh 61 PHỤ LỤC - Phụ lục 1: Mẫu bệnh án nghiên cứu - Phụ lục 2: Qui trình tách DNA từ mô cố định formalin – vùi paraffin - Phụ lục 3: Qui trình định lượng DNA theo nguyên tắc huỳnh quang - Phụ lục 4: Quy trình phát đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF - Phụ lục 5: Quy trình tinh sản phẩm PCR - Phụ lục 6: Qui trình giải trình tự tự động máy 3500 Dx Genetic Analyzer (Applied Biosystems) sản phẩm BigDye® Terminator v3.1 Cycle - 10 Phụ lục 7: Trình tự gen PIK3CA (NM_006218.3) - 12 - ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 – Con đường tín hiệu MAPK chế tác động thuốc kháng EGFR .12 Hình 1.2 – Con đường tín hiệu PI3K-AKT .15 Hình 2.1 – Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 30 Hình 3.1 – Một số kết phát đột biến gen KRAS phương pháp PCR kết hợp lai đầu dò đặc hiệu (KRAS XL StrippAssay®) 42 Hình 3.2 – Một số kết phát đột biến gen NRAS phương pháp PCR kết hợp lai đầu dò đặc hiệu (NRAS XL StripAssay®) 43 Hình 3.3 – Một số kết phát đột biến gen BRAF phương pháp PCR kết hợp lai đầu dò đặc hiệu (BRAF 600/601 StripAssay®) 44 Hình 3.4 - Một số kết giải trình tự gen PIK3CA exon .45 Hình 3.5 – Một số kết trình tự gen PIK3CA exon 20 46 Hình 3.6 – Sơ đồ chi tiết tỷ lệ loại đột biến phát nhóm bệnh nhân nghiên cứu 48 Hình 3.7 – Các phác đồ điều trị ung thư đại trực tràng di 56 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 - Các thuốc cấp phép điều trị UTĐTT di Bảng 1.2 - Giai đoạn theo hệ thống phân loại TNM cho UTĐTT tỷ lệ sống bệnh nhân sau năm Bảng 1.3 - Tần suất xuất đột biến RAS UTĐTT .14 Bảng 1.4 - So sánh số phương pháp phát đột biến gen phổ biến .17 Bảng 2.1 - Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 28 Bảng 2.2 - Các vật tư tiêu hao sử dụng nghiên cứu 29 Bảng 2.3 - Các hóa chất sử dụng nghiên cứu 29 Bảng 2.4 - Các loại đột biến phát kit StripAssay® (ViennaLab) .33 Bảng 2.5 - Trình tự mồi dùng để khuếch đại exon exon 20 gen PIKCA3 34 Bảng 3.1 - Thông tin đối tượng tham gia nghiên cứu 38 Bảng 3.2 - Tổng hợp đặc điểm 44 bệnh nhân UTĐTT nghiên cứu 40 Bảng 3.3 - Tổng hợp loại đột biến theo vị trí phát nghiên cứu 47 Bảng 3.4 - Mối tương quan trình trạng đột biến gen đặc điểm bệnh nhân 50 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Viết đầy đủ AKT/PKB Protein Kinase B BSC Best Supportive Care (chăm sóc hỗ trợ tốt nhất) CA 19-9 Cancer Antigen 19-9 CEA Carcinoembryonic Antigen DNA Deoxyribonucleic Acid EGF Epidermal Growth Factor (yếu tố tăng trưởng biểu bì) EGFR Epidermal Growth Factor Receptor (thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì) FDA US Food And Drug Administration (Cục Quản lý Thực phẩm Dược phẩm Hoa Kỳ) FFPE Formalin-Fixed Paraffin-Embedded formalin vùi parafin) JAK Janus Kinase MAPK/ERK Mitogen-Activated Protein Kinase/Extracellular SignalRegulated Kinases (Mô cố định MEK/MAPKK/MAP2K Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase mTOR Mammalian Target of Rapamycin PDGF Platelet-Derived Growth Factor (yếu tố tăng trưởng nguồn gốc tiểu cầu) PDGFR Platelet-Derived Growth Factor Receptor Factor (thụ thể yếu tố tăng trưởng nguồn gốc tiểu cầu) PDK1 Phosphoinositide-Dependent Kinase-1 PI3K Phosphotidylinositol–3 Kinase v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PIP2 Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate PIP3 Phosphatidylinositol 3,4,5-Trisphosphate PTEN Phosphatase And Tensin Homolog STAT Signal Transducer and Activator of Transcription TNM Tumor - Nodule - Metastase (Khối u - Hạch vùng - Di xa) UTĐTT Ung thư đại trực tràng VEGF VEGFR Vascular Endothelial Growth Factor (yếu tố tăng trưởng mạch máu nội mô) Vascular Endothelial Growth Factor Receptor (thụ thể yếu tố tăng trưởng mạch máu nội mô) vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỞ ĐẦU Điều trị ung thư đại trực tràng (UTĐTT) có bước tiến lớn 10 năm qua, thời gian sống trung bình vượt qua số 30 tháng Đây kết đời thuốc điều trị bao gồm thuốc gây độc tế bào (irinotecan, oxaliplatin) thuốc điều trị đích (bevacizumab, aflibercept, cetuximab, panitunumab, regorafenib) tích hợp vào thành phác đồ điều trị tiêu chuẩn thực hành lâm sàng Chẩn đoán sớm bệnh điều trị phác đồ đóng vai trị quan trọng để kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân Tuy nhiên tất bệnh nhân đáp ứng tốt với thuốc điều trị đích, hiệu thuốc cịn phụ thuộc vào gen nằm đường tín hiệu phụ thuộc EGFR KRAS, NRAS, BRAF PIK3CA Việc xác định trạng thái đột biến gen cần thiết việc lựa chọn phác đồ điều trị phù hợp cho bệnh nhân, tiên lượng tiến triển bệnh hạn chế tác dụng phụ thuốc Điều góp phần giúp nâng cao hiệu điều trị, tăng thời gian sống thêm giúp cho bệnh nhân ung thư đại trực tràng có chất lượng sống tốt Xét khía cạnh kinh tế, vấn đề góp phần tránh lãng phí định điều trị thuốc điều trị đích (trong trường hợp thuốc không đem lại hiệu quả) Trong tương lai gần, việc xét nghiệm gen điều kiện cần thiết làm tiền đề triển khai việc điều trị cá thể hóa bệnh nhân ung thư đại trực tràng Trên giới, việc xác định trạng thái đột biến gen KRAS, NRAS, BRAF PIK3CA xét nghiệm cần thiết thực thường qui nước phát triển Ở Việt Nam, gen KRAS BRAF triển khai thực thường qui số bệnh viện lớn, NRAS bước đầu triển khai chưa có số liệu báo cáo, PIK3CA chưa có báo cáo bệnh nhân ung thư đại trực tràng Qua tìm hiểu phân tích tình hình nghiên cứu giới Việt Nam, xét thấy gen KRAS, NRAS, BRAF PIK3CA dấu ấn sinh LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com nội bào protein VEGFR-2, VEGFR-3, RET, KIT, PDGFR RAF, ngăn không cho yếu tố truyền tín hiệu tiếp[79] Nghiên cứu CORRECT phân ngẫu nhiên 760 bệnh nhân UTĐTT di kháng hóa trị thành nhóm: regorafenib kết hợp BSC (chăm sóc hỗ trợ tốt nhất) giả dược kết hợp BSC [25] Kết bệnh nhân nhóm sử dụng regorafenib có thời gian sống thêm tồn nhiều so với nhóm dùng giả dược (6,4 tháng so với tháng) Nghiên cứu quan sát thấy khoảng 50% số bệnh nhân không đáp ứng với regorafenib Tuy nhiên, chưa phát dấu ấn sinh học dự đốn tính đáp ứng regorafenib 1.3.2 Đích EGFR UTĐTT EGFR (cịn gọi ErB1 HER1) thành viên họ thụ thể tyrosine kinase xuyên màng ERbB Các phối tử gắn với EGFR bao gồm: yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGF), yếu tố tăng trưởng chuyển dạng alpha (TGF-α), amphiregulin, betacellulin, epiregulin Khi phối tử gắn vào EGFR hoạt hóa domain tyrosine kinase hoạt hóa số đường tín hiệu, bao gồm MAPK, PI3K JAK-STAT Kích hoạt đường dẫn đến ức chế apoptosis, biệt hóa tăng sinh tế bào Hai loại kháng thể đơn dòng kháng EGFR bao gồm: cetuximab (kháng thể IgG1 khảm) panitumumab (kháng thể IgG2 người) hai loại thuốc dùng đơn độc điều trị UTĐTT giai đoạn muộn Năm 2004, cetuximab phê duyệt lựa chọn điều trị cho bệnh nhân UTĐTT điều trị phác đồ sử dụng irinotecan[14] Trong nghiên cứu pha III, đa trung tâm phân ngẫu nhiên 463 bệnh nhân UTĐTT cho thấy sử dụng panitumumab đơn độc cải thiện đáng kể thời gian sống thêm bệnh không tiến triển so với BSC[76] Dựa liệu này, panitumumab FDA Hoa Kỳ phê duyệt để dùng đơn độc điều trị cứu vớt UTĐTT di vào năm 2006 Trong thử nghiệm tương tự so sánh cetuximab với BSC cho thấy kết gần giống hệt với panitumumab so với BSC tỷ lệ đáp ứng 20 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com thời gian sống thêm bệnh không tiến triển [35] Nghiên cứu pha III so sánh đối đầu hai loại kháng thể điều trị cứu vớt 999 bệnh nhân cho thấy hiệu giống hệt hai loại thuốc Cả hai kháng thể nghiên cứu thử nghiệm điều trị bước kết hợp với phác đồ hóa trị liệu FOLFOX FOLFIRI [11, 19, 75] Trong thực tế lâm sàng ngày nay, cetuximab panitumumab sử dụng kết hợp với phác đồ hóa trị liệu chuẩn, kết hợp với irinotecan hay sử dụng đơn độc Dấu ấn sinh học cho liệu pháp kháng EGFR: Tại thời điểm tại, việc tìm kiếm dấu ấn sinh học cho thuốc kháng EGFR liên quan đến UTĐTT hướng nghiên cứu đầy hứa hẹn thú vị Ban đầu, mức độ biểu lộ protein EGFR coi dấu ấn sinh học đầy tiềm năng, nhiên nghiên cứu cho thấy khơng có liên quan mức độ biểu lộ protein EGFR với tính đáp ứng thuốc kháng EGFR [26] Đánh giá biểu EGFR thông qua số lượng gen EGFR khơng đem lại kết việc dự đốn tính đáp ứng với thuốc kháng EGFR [34] Quá trình tìm kiếm thị liên quan đến tính đáp ứng thuốc sau tập trung sang phân tử khác đường tín hiệu phụ thuộc EGFR KRAS, NRAS, BRAF PI3K (gen mã hóa PIK3CA) Năm 2006, Lievre cộng tiến hành nghiên cứu hồi cứu 39 bệnh nhân UTĐTT di điều trị cetuximab (đơn trị liệu kết hợp) cho thấy số gợi ý việc cetuximab khơng hiệu có liên quan với diện đột biến gen KRAS[40] Đến năm 2008, chứng nghiên cứu pha III cho thấy điều trị đơn độc panitumumab không hiệu bệnh nhân có đột biến gen KRAS [7] Rất nhiều thử nghiệm sau xác nhận lại việc này, cetuximab panitumumab sử dụng đơn độc hay kết hợp với hóa trị liệu khơng đem lại hiệu trường hợp gen KRAS đột biến [43] Các nghiên cứu cho thấy tình trạng gen KRAS bình thường điều kiện cần chưa đủ để đánh giá đáp ứng thuốc kháng EGFR Theo hướng dẫn FDA, xét nghiệm xác định trạng thái đột biến gen KRAS cần thực trước sử dụng thuốc kháng EGFR, 21 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com cetuximab panitumumab định cho trường hợp UTĐTT di có kiểu gen KRAS bình thường Các đột biến thường xảy exon (codon 12 13), chiếm tỷ lệ 90% số loại đột biến gen KRAS Tuy nhiên loại đột biến KRAS khác hay gen RAS khác bị bỏ sót Việc bỏ sót bệnh nhân có đột biến RAS định cho họ điều trị thuốc kháng EGFR nghiên cứu CAIRO2 [58] Đây nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng pha III, 755 bệnh nhân UTĐTT di chưa hóa trị điều trị với capecitabine, oxaliplatin, bevacizumab phân ngẫu nhiên để bổ sung cetuximab hay dùng kết hợp ba loại thuốc Trong số bệnh nhân điều trị với cetuximab, thời gian sống thêm bệnh không tiến triển ngắn bệnh nhân mang gen KRAS đột biến so với người mang gen KRAS bình thường Kết tương tự thấy nghiên cứu panitumumab điều trị kết hợp với hóa trị cho UTĐTT di căn, bệnh nhân phân ngẫu nhiên để nhận FOLFOX FOLFOX + panitumumab [19] Kết cho thấy bệnh nhân có kiểu gen KRAS bình thường sử dụng panitumumab có thời gian sống dài so với người không dùng panitumumab (thời gian sống thêm bệnh không tiến triển 10 tháng so với 8,6 tháng, p = 0,02) Một điều đáng lưu ý bệnh nhân có đột biến gen KRAS sử dụng panitumumab kết hợp với FOLFOX4 giảm thời gian sống thêm bệnh không tiến triển so với người dùng FOLFOX4 (7,4 tháng vs 9,2 tháng, p = 0,02) Điều cho thấy việc sử dụng thuốc kháng EGFR không khơng hiệu bệnh nhân UTĐT có kiểu gen KRAS đột biến, mà cịn có khả làm bệnh tiến triển xấu Douillard cộng thơng qua nghiên cứu PRIME mở rộng phân tích dấu ấn sinh học hiệu điều trị hai nhóm: dùng FOLFOX4 + panitumumab với nhóm dùng FOLFOX4[18] Trong phân tích này, đột biến KRAS exon (codon 61) exon (codon 117 146); NRAS exon (codon 12 13), exon (codon 61), exon (codon 117 codon 146); BRAF exon 15 (codon 600) đánh giá Trong số 1.183 bệnh nhân nghiên cứu này, 93% 22 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com thực xét nghiệm tìm đột biến KRAS exon phát thấy 40% bệnh nhân có đột biến , 48% xác định có gen RAS bình thường (khơng có đột biến gen KRAS NRAS exon 2, 3, 4) Khi chưa có liệu gen mở rộng, phân tích ban đầu nhận thấy bệnh nhân khơng có đột biến KRAS exon có thời gian sống thêm bệnh khơng tiến triển tăng lên họ điều trị phác đồ có chứa panitumumab kết hợp với FOLFOX4 so với với dùng FOLFOX4 (9,6 tháng vs 8,0 tháng, p = 0,02) Sau làm thêm xét nghiệm mở rộng, xác định số 620 bệnh nhân ban đầu xác định khơng có đột biến KRAS exon 2, 17% số có đột biến RAS khác Trong nhóm bệnh nhân này, thời gian sống thêm bệnh không tiến triển thời gian sống thêm tồn giảm nhóm sử dụng panitumamab + FOLFOX4 so với nhóm dùng FOLFOX4 Những phát nghiên cứu chứng minh đột biến gen RAS khác làm giảm tính đáp ứng với thuốc kháng EGFR bệnh nhân UTĐTT Điều nhấn mạnh cần thiết xét nghiệm phải bao phủ đầy đủ xét nghiệm KRAS codon 12 13 cịn lượng bệnh nhân tương đối lớn không nhận lợi ích từ việc điều trị thuốc kháng EGFR Nghiên cứu FIRE-3 nghiên cứu đối đầu so sánh thuốc kháng EGFR bevacizumab báo cáo năm 2013, phân ngẫu nhiên 592 bệnh nhân UTĐTT di có kiểu gen KRAS exon bình thường sử dụng phác đồ FOLFIRI + cetuximab phác đồ FOLFIRI + bevacizumab Kết cho thấy khác biệt thời gian sống thêm bệnh khơng tiến triển hai nhóm (10,0 tháng cetuximab 10,3 tháng bevacizumab) Tuy nhiên, có cải thiện đáng kể thời gian sống thêm tồn phát nhóm dùng phác đồ FOLFIRI + cetuximab (28,7 tháng so với 25,0 tháng; HR, 0,77; P = 0,017) Phân tích thêm đột biến RAS khác bao gồm KRAS exon 2-3 NRAS, cho thấy có khác biệt rõ rệt trung vị thời gian sống thêm toàn loại trừ tiếp bệnh nhân có đột biến RAS khác (33,1 tháng cho FOLFIRI + cetuximab so với 25,6 tháng cho FOLFIRI + bevacizumab; HR, 0.70; p = 0,011) [27] 23 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 1.3.3 Các tín hiệu hạ nguồn khác EGFR Gen BRAF mã hóa protein hạ nguồn protein RAS đường tín hiệu MAPK Đột biến gen BRAF xuất khoảng 5% - 10% bệnh nhân UTĐTT xuất đồng thời với đột biến gen KRAS [60] Đột biến gen BRAF cho có liên quan với tiên lượng xấu Theo nghiên cứu Foltran cộng sự, bệnh nhân có mang đột biến BRAF có trung vị thời gian sống thấp (7,6 tháng), so với bệnh nhân không mang đột biến gen (27.7 tháng) [21] Tuy nhiên, số liệu gần cho thấy cách điều trị công với phác đồ FOLFOXIRI kết hợp với bevacizumab cho kết khả quan bệnh nhân UTĐTT mang gen BRAF đột biến [21, 46] Những liệu thu gần cho thấy cetuximab panitumumab có tác dụng hạn chế bệnh nhân UTĐTT có gen BRAF đột biến [75] Theo logic thơng thường, cách điều trị tốt cho bệnh nhân UTĐTT di có đột biến gen BRAF điều trị với thuốc ức chế BRAF vemurafenib sử dụng điều trị ung thư hắc tố Tuy nhiên, kết sử dụng đơn độc thuốc ức chế BRAF UTĐTT không đem lại kết khả quan Yang cộng cho đột biến gen BRAF điều kiện cần chưa đủ để vemurafenib tác động, nghiên cứu cho thấy việc ức chế BRAF vemurafenib nhanh chóng gây phản ứng kích hoạt ngược lại lên EGFR, làm cho khối u tăng trưởng bất chấp có mặt thuốc ức chế BRAF [81] Ngoài KRAS, NRAS, BRAF, protein hạ nguồn EGFR PI3K, tiểu đơn vị xúc tác mã hóa gen PIK3CA Khi dạng đột biến, PI3K phosphoryl hóa AKT, dẫn đến tăng sinh tế bào ức chế apoptosis UTĐTT Một số nghiên cứu cho thấy bệnh nhân mang gen PIK3CA đột biến có cải thiện thời gian sống thêm rõ rệt điều trị bổ trợ aspirin nhiều loại bệnh ung thư, lợi ích rõ ràng bệnh nhân UTĐTT [39, 53] Theo số nghiên cứu, đột biến gen PIK3CA yếu tố tiềm để dự đốn tính đáp ứng với liệu pháp điều trị thuốc kháng EGFR, đặc biệt đột biến exon 20 [17, 45, 64] Tuy nhiên theo số nghiên cứu khác, 24 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com đột biến gen PIK3CA khơng có giá trị dự đốn tính đáp ứng với thuốc EGFR [40, 57] Cho đến nay, vai trị dự đốn đáp ứng với thuốc kháng EGFR đột biến gen PIK3CA chưa thật rõ ràng Đột biến gen PIK3CA xuất đồng thời với đột biến gen KRAS, BRAF NRAS Tuy nhiên, đột biến gen KRAS, BRAF hay NRAS có xu hướng loại trừ không xảy đồng thời (thông thường ba gen xuất đột biến khối u) Bên cạnh đó, PTEN chất kiềm chế khối u đường tín hiệu PI3K Một số tác giả cho kết hợp trạng thái đột biến gen KRAS biểu lộ protein PTEN UTĐTT di dấu hiệu dự đốn lợi ích sử dụng cetuximab tốt có gen KRAS đột biến Tuy nhiên có hai điểm hạn chế sử dụng PTEN làm dấu hiệu dự đoán: biểu lộ protein PTEN xác định phương pháp hóa mơ miễn dịch khác tùy vào phương pháp phát có biểu lộ protein PTEN tổ chức di (khơng phải khối u ngun phát) có liên quan với kết điều trị thuốc kháng EGFR [41] 1.3.4 Tình hình nghiên cứu Việt Nam Hiện nay, xét nghiệm gen KRAS, BRAF xét nghiệm thường qui triển khai thực phịng thí nghiệm sinh học phân tử bệnh viện lớn nước Bệnh viện Bạch Mai, Bệnh viện K, Bệnh viện Đại Học Y Hà Nội, Bệnh viện Chợ rẫy Năm 2016, Mai Trọng Khoa cộng tiến hành nghiên cứu 92 bệnh nhân UTĐTT, kết phát 34 bệnh nhân (37%) có đột biến gen KRAS, vị trí đột biến tập trung chủ yếu codon 12 (65,7%) [3] Một số nghiên cứu khác với cỡ mẫu cho thấy tỷ lệ đột biến gen KRAS khoảng 33% [1, 6] Các nghiên cứu đánh giá đáp ứng với thuốc hạn chế nhiên kết ban đầu cho thấy thuốc kháng EGFR có góp phần vào hiệu điều trị bệnh nhân UTĐTT giai đoạn muộn Gen NRAS PIK3CA nghiên 25 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com cứu nhiều giới, nhiên Việt Nam chưa có báo cáo liên quan Hiện có nhiều phương pháp phát đột biến gen sử dụng giải trình tự gen, real-time PCR, PCR đặc hiệu allele Các phương pháp khác độ nhạy, độ đặc hiệu, số lượng đột biến phát hiện… Từ năm 2014, Đơn vị Gen trị liệu (thuộc Trung tâm Y học hạt nhân Ung bướu, Bệnh viện Bạch Mai) áp dụng xét nghiệm đột biến gen KRAS kỹ thuật PCR đặc hiệu allele kết hợp lai đầu dò phân tử theo kit KRAS StripAssay® (hãng ViennaLab, Áo) Đây phương pháp có độ nhạy cao, phát đột biến số lượng tế bào mang đột biến 1%, cấp chứng tiêu chuẩn xét nghiệm châu Âu áp dụng cho chẩn đoán bệnh (CE-IVD) Kỹ thuật triển khai để thực xét nghiệm gen BRAF đến đầu năm 2016 gen NRAS triển khai xét nghiệm bệnh nhân UTĐTT để phục vụ chẩn đoán điều trị 26 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer: a retrospective consortium analysis”, Lancet Oncol, 11 (8), pp 753-762 18 Douillard J.Y., Oliner K.S., et al (2013), “Panitumumab-FOLFOX4 treatment and RAS mutations in colorectal cancer”, N Engl J Med, 369 (11), pp 1023-1034 19 Douillard J.Y., Siena S., et al (2010), “Randomized, phase III trial of panitumumab with infusional fluorouracil, leucovorin, and oxaliplatin (FOLFOX4) versus FOLFOX4 alone as first-line treatment in patients with previously untreated metastatic colorectal cancer: the PRIME study”, J Clin Oncol, 28 (31), pp 4697-4705 20 Edge S.B and American Joint Committee on Cancer (2010), AJCC cancer staging manual, edition.th edition, Springer, New York, pp.xiv, 648 s 21 Foltran L., De Maglio G., et al (2015), “Prognostic role of KRAS, NRAS, BRAF and PIK3CA mutations in advanced colorectal cancer”, Future Oncol, 11 (4), pp 629-640 22 Gao P., Song Y.X., et al (2013), “Is the prediction of prognosis not improved by the seventh edition of the TNM classification for colorectal cancer? Analysis of the surveillance, epidemiology, and end results (SEER) database”, BMC Cancer, 13, pp 123 23 Gonsalves W.I., Mahoney M.R., et al (2014), “Patient and tumor characteristics and BRAF and KRAS mutations in colon cancer, NCCTG/Alliance N0147”, J Natl Cancer Inst, 106 (7) 24 Grothey A and Marshall J.L (2007), “Optimizing palliative treatment of metastatic colorectal cancer in the era of biologic therapy”, Oncology (Williston Park), 21 (5), pp 553-564, 566; discussion 566-558, 577558 25 Grothey A., Van Cutsem E., et al (2013), “Regorafenib monotherapy for previously treated metastatic colorectal cancer (CORRECT): an 63 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com international, multicentre, randomised, placebo-controlled, phase trial”, Lancet, 381 (9863), pp 303-312 26 Hecht J.R., Patnaik A., et al (2007), “Panitumumab monotherapy in patients with previously treated metastatic colorectal cancer”, Cancer, 110 (5), pp 980-988 27 Heinemann V., Von Weikersthal L.F., et al (2014), “FOLFIRI plus cetuximab versus FOLFIRI plus bevacizumab as first-line treatment for patients with metastatic colorectal cancer (FIRE-3): a randomised, open-label, phase trial”, Lancet Oncol, 15 (10), pp 1065-1075 28 Hicklin D.J and Ellis L.M (2005), “Role of the vascular endothelial growth factor pathway in tumor growth and angiogenesis”, J Clin Oncol, 23 (5), pp 1011-1027 29 Hundt S., Haug U., and Brenner H (2007), “Blood markers for early detection of colorectal cancer: a systematic review”, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 16 (10), pp 1935-1953 30 Improta G., Zupa A., et al (2013), “Coexistence of two different mutations in codon 12 of the Kras gene in colorectal cancer: Report of a case supporting the concept of tumoral heterogeneity”, Oncol Lett, (5), pp 1741-1743 31 Ince W.L., Jubb A.M., et al (2005), “Association of k-ras, b-raf, and p53 status with the treatment effect of bevacizumab”, J Natl Cancer Inst, 97 (13), pp 981-989 32 Irahara N., Baba Y., et al (2010), “NRAS mutations are rare in colorectal cancer”, Diagn Mol Pathol, 19 (3), pp 157-163 33 Jancik S., Drabek J., et al (2012), “A comparison of Direct sequencing, Pyrosequencing, High resolution melting analysis, TheraScreen DxS, and the K-ras StripAssay for detecting KRAS mutations in non small cell lung carcinomas”, J Exp Clin Cancer Res, 31, pp 79 64 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 34 Jiang Z., Li C., Li F., and Wang X (2013), “EGFR gene copy number as a prognostic marker in colorectal cancer patients treated with cetuximab or panitumumab: a systematic review and meta analysis”, PLoS One, (2), pp e56205 35 Jonker D.J., O'callaghan C.J., et al (2007), “Cetuximab for the treatment of colorectal cancer”, N Engl J Med, 357 (20), pp 2040-2048 36 Kislitsin D., Lerner A., Rennert G., and Lev Z (2002), “K-ras mutations in sporadic colorectal tumors in Israel: unusual high frequency of codon 13 mutations and evidence for nonhomogeneous representation of mutation subtypes”, Dig Dis Sci, 47 (5), pp 1073-1079 37 Kuczynski E.A., Sargent D.J., Grothey A., and Kerbel R.S (2013), “Drug rechallenge and treatment beyond progression implications for drug resistance”, Nat Rev Clin Oncol, 10 (10), pp 571-587 38 Kwon M.J., Lee S.E., Kang S.Y., and Choi Y.L (2011), “Frequency of KRAS, BRAF, and PIK3CA mutations in advanced colorectal cancers: Comparison of peptide nucleic acid-mediated PCR clamping and direct sequencing in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue”, Pathol Res Pract, 207 (12), pp 762-768 39 Liao X., Lochhead P., et al (2012), “Aspirin use, tumor PIK3CA mutation, and colorectal-cancer survival”, N Engl J Med, 367 (17), pp 1596-1606 40 Lievre A., Bachet J.B., et al (2006), “KRAS mutation status is predictive of response to cetuximab therapy in colorectal cancer”, Cancer Res, 66 (8), pp 3992-3995 41 Loupakis F., Pollina L., et al (2009), “PTEN expression and KRAS mutations on primary tumors and metastases in the prediction of benefit from cetuximab plus irinotecan for patients with metastatic colorectal cancer”, J Clin Oncol, 27 (16), pp 2622-2629 65 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 42 Lurkin I., Stoehr R., et al (2010), “Two multiplex assays that simultaneously identify 22 possible mutation sites in the KRAS, BRAF, NRAS and PIK3CA genes”, PLoS One, (1), pp e8802 43 Malumbres M and Barbacid M (2003), “RAS oncogenes: the first 30 years”, Nat Rev Cancer, (6), pp 459-465 44 Mao C., Wu X.Y., et al (2015), “Concordant analysis of KRAS, BRAF, PIK3CA mutations, and PTEN expression between primary colorectal cancer and matched metastases”, Sci Rep, 5, pp 8065 45 Mao C., Yang Z.Y., Hu X.F., Chen Q., and Tang J.L (2012), “PIK3CA exon 20 mutations as a potential biomarker for resistance to anti-EGFR monoclonal antibodies in KRAS wild-type metastatic colorectal cancer: a systematic review and meta-analysis”, Ann Oncol, 23 (6), pp 1518-1525 46 Masi G., Loupakis F., et al (2010), “Bevacizumab with FOLFOXIRI (irinotecan, oxaliplatin, fluorouracil, and folinate) as first-line treatment for metastatic colorectal cancer: a phase trial”, Lancet Oncol, 11 (9), pp 845-852 47 Masi G., Salvatore L., et al (2015), “Continuation or reintroduction of bevacizumab beyond progression to first-line therapy in metastatic colorectal cancer: final results of the randomized BEBYP trial”, Ann Oncol, 26 (4), pp 724-730 48 Murugan A.K., Hong N.T., Fukui Y., Munirajan A.K., and Tsuchida N (2008), “Oncogenic mutations of the PIK3CA gene in head and neck squamous cell carcinomas”, Int J Oncol, 32 (1), pp 101-111 49 Negru S., Papadopoulou E., et al (2014), “KRAS, NRAS and BRAF mutations in Greek and Romanian patients with colorectal cancer: a cohort study”, BMJ Open, (5), pp e004652 50 Neumann J., Zeindl-Eberhart E., Kirchner T., and Jung A (2009), “Frequency and type of KRAS mutations in routine diagnostic analysis of 66 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com metastatic colorectal cancer”, Pathol Res Pract, 205 (12), pp 858862 51 Niraula S., Seruga B., et al (2012), “The price we pay for progress: a metaanalysis of harms of newly approved anticancer drugs”, J Clin Oncol, 30 (24), pp 3012-3019 52 Normanno N., Rachiglio A.M., et al (2015), “Heterogeneity of KRAS, NRAS, BRAF and PIK3CA mutations in metastatic colorectal cancer and potential effects on therapy in the CAPRI GOIM trial”, Ann Oncol, 26 (8), pp 1710-1714 53 Paleari L., Puntoni M., Clavarezza M., Decensi M., Cuzick J., and Decensi A (2015), “PIK3CA Mutation, Aspirin Use after Diagnosis and Survival of Colorectal Cancer A Systematic Review and Meta-analysis of Epidemiological Studies”, Clin Oncol (R Coll Radiol) 54 Palomba G., Colombino M., et al (2012), “Prevalence of KRAS, BRAF, and PIK3CA somatic mutations in patients with colorectal carcinoma may vary in the same population: clues from Sardinia”, J Transl Med, 10, pp 178 55 Palomba G., Doneddu V., et al (2016), “Prognostic impact of KRAS, NRAS, BRAF, and PIK3CA mutations in primary colorectal carcinomas: a population-based study”, J Transl Med, 14 (1), pp 292 56 Perkins G.L., Slater E.D., Sanders G.K., and Prichard J.G (2003), “Serum tumor markers”, Am Fam Physician, 68 (6), pp 1075-1082 57 Prenen H., De Schutter J., et al (2009), “PIK3CA mutations are not a major determinant of resistance to the epidermal growth factor receptor inhibitor cetuximab in metastatic colorectal cancer”, Clin Cancer Res, 15 (9), pp 3184-3188 58 Punt C.J., Tol J., et al (2008), “Randomized phase III study of capecitabine, oxaliplatin, and bevacizumab with or without cetuximab in advanced 67 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com colorectal cancer (ACC), the CAIRO2 study of the Dutch Colorectal Cancer Group (DCCG)”, J Clin Oncol, 26 (15_suppl), pp LBA4011 59 Phin S., Moore M.W., and Cotter P.D (2013), “Genomic Rearrangements of PTEN in Prostate Cancer”, Front Oncol, 3, pp 240 60 Rajagopalan H., Bardelli A., Lengauer C., Kinzler K.W., Vogelstein B., and Velculescu V.E (2002), “Tumorigenesis: RAF/RAS oncogenes and mismatch-repair status”, Nature, 418 (6901), pp 934 61 Roth A.D., Tejpar S., et al (2010), “Prognostic role of KRAS and BRAF in stage II and III resected colon cancer: results of the translational study on the PETACC-3, EORTC 40993, SAKK 60-00 trial”, J Clin Oncol, 28 (3), pp 466-474 62 Saltz L.B., Clarke S., et al (2008), “Bevacizumab in combination with oxaliplatin-based chemotherapy as first-line therapy in metastatic colorectal cancer: a randomized phase III study”, J Clin Oncol, 26 (12), pp 2013-2019 63 Samuels Y., Diaz L.A., Jr., et al (2005), “Mutant PIK3CA promotes cell growth and invasion of human cancer cells”, Cancer Cell, (6), pp 561-573 64 Sartore-Bianchi A., Martini M., et al (2009), “PIK3CA mutations in colorectal cancer are associated with clinical resistance to EGFR-targeted monoclonal antibodies”, Cancer Res, 69 (5), pp 1851-1857 65 Selcukbiricik F., Bilici A., et al (2013), “Are high initial CEA and CA 19-9 levels associated with the presence of K-ras mutation in patients with metastatic colorectal cancer?”, Tumour Biol, 34 (4), pp 2233-2239 66 Seshagiri S., Stawiski E.W., et al (2012), “Recurrent R-spondin fusions in colon cancer”, Nature, 488 (7413), pp 660-664 67 Shen Y., Wang J., et al (2013), “Effectors of epidermal growth factor receptor pathway: the genetic profiling ofKRAS, BRAF, PIK3CA, NRAS mutations in colorectal cancer characteristics and personalized medicine”, PLoS One, (12), pp e81628 68 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 68 Simkens L.H., Van Tinteren H., et al (2015), “Maintenance treatment with capecitabine and bevacizumab in metastatic colorectal cancer (CAIRO3): a phase randomised controlled trial of the Dutch Colorectal Cancer Group”, Lancet, 385 (9980), pp 1843-1852 69 Sridharan M., Hubbard J.M., and Grothey A (2014), “Colorectal cancer: how emerging molecular understanding affects treatment decisions”, Oncology (Williston Park), 28 (2), pp 110-118 70 Stec R., Semeniuk-Wojtas A., et al (2015), “Mutation of the gene as a prognostic factor in patients with colorectal cancer”, Oncol Lett, 10 (3), pp 1423-1429 71 Tabernero J., Van Cutsem E., et al (2014), “Aflibercept versus placebo in combination with fluorouracil, leucovorin and irinotecan in the treatment of previously treated metastatic colorectal cancer: prespecified subgroup analyses from the VELOUR trial”, Eur J Cancer, 50 (2), pp 320-331 72 Tournigand C., Andre T., et al (2004), “FOLFIRI followed by FOLFOX6 or the reverse sequence in advanced colorectal cancer: a randomized GERCOR study”, J Clin Oncol, 22 (2), pp 229-237 73 Therkildsen C., Bergmann T.K., Henrichsen-Schnack T., Ladelund S., and Nilbert M (2014), “The predictive value of KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA and PTEN for anti-EGFR treatment in metastatic colorectal cancer: A systematic review and meta-analysis”, Acta Oncol, 53 (7), pp 852-864 74 Tran B., Kopetz S., et al (2011), “Impact of BRAF mutation and microsatellite instability on the pattern of metastatic spread and prognosis in metastatic colorectal cancer”, Cancer, 117 (20), pp 4623-4632 75 Van Cutsem E., Kohne C.H., et al (2011), “Cetuximab plus irinotecan, fluorouracil, and leucovorin as first-line treatment for metastatic colorectal cancer: updated analysis of overall survival according to 69 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com tumor KRAS and BRAF mutation status”, J Clin Oncol, 29 (15), pp 2011-2019 76 Van Cutsem E., Peeters M., et al (2007), “Open-label phase III trial of panitumumab plus best supportive care compared with best supportive care alone in patients with chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer”, J Clin Oncol, 25 (13), pp 1658-1664 77 Van Cutsem E., Tabernero J., et al (2012), “Addition of aflibercept to fluorouracil, leucovorin, and irinotecan improves survival in a phase III randomized trial in patients with metastatic colorectal cancer previously treated with an oxaliplatin-based regimen”, J Clin Oncol, 30 (28), pp 3499-3506 78 Vogelaar F., Van Erning F., et al (2015), “The prognostic value of Microsatellite Instability, KRAS, BRAF and PIK3CA mutations in stage II colon cancer patients”, Mol Med, pp 1-26 79 Wilhelm S.M., Dumas J., et al (2011), “Regorafenib (BAY 73-4506): a new oral multikinase inhibitor of angiogenic, stromal and oncogenic receptor tyrosine kinases with potent preclinical antitumor activity”, Int J Cancer, 129 (1), pp 245-255 80 Wood L.D., Parsons D.W., et al (2007), “The genomic landscapes of human breast and colorectal cancers”, Science, 318 (5853), pp 1108-1113 81 Yang H., Higgins B., et al (2012), “Antitumor activity of BRAF inhibitor vemurafenib in preclinical models of BRAF-mutant colorectal cancer”, Cancer Res, 72 (3), pp 779-789 82 Zhang J., Zheng J., et al (2015), “Molecular spectrum of KRAS, NRAS, BRAF and PIK3CA mutations in Chinese colorectal cancer patients: analysis of 1,110 cases”, Sci Rep, 5, pp 18678 70 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... THÁI ĐỘT BIẾN GEN VÀ CÁC ĐẶC ĐIỂM CỦA BỆNH NHÂN 49 3.4 BÀN LUẬN .53 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 KẾT LUẬN 60 KIẾN NGHỊ .60 TÀI LIỆU THAM KHẢO ... luanvanchat@agmail.com Chương - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .36 3.1 ĐẶC ĐIỂM BỆNH HỌC CỦA NHÓM ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 39 3.2 BIẾN ĐỔI CỦA CÁC GEN KRAS, NRAS, BRAF VÀ PIK3CA TRÊN BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI... kiến thức q giá để thực luận văn vận dụng công việc Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè người thân quan tâm, động viên tinh thần suốt trình học tập thực luận văn tốt nghiệp Hà Nội, ngày