Những vấn về kỹ thuật c n được quan tâm khi áp dụng PCR và real-time PCR trong phòng thí nghiệm chẩn đoán

Những vấn kỹ thuật c n quan tâm áp dụng PCR real-time PCR phịng thí nghiệm chẩn đốn Sự khác biệt phịng thí nghiệm chẩn đốn phịng thí nghiệm nghiên c u Phịng thí nghiệm nghiên cứu g thí nghiệm mà thử nghiệm thực để đáp ứng nhu cầu nghiên cứu nhằm giúp nhà nghiên cứu giải đáp vấn đề khoa học Kết phịng thí nghiệm nghiên cứu khơng liên quan trực tiếp tức thời đến định người gửi mẫu xét nghiệm, chăn nuôi hay thủy sản không liên quan đến định hủy hay cô lập quần thể gia súc hay tôm cá, hay y học không liên quan đến định điều trị bác sĩ bệnh nhân Do kết phịng thí nghiệm nghiên cứu không cần thiết phải kịp thời đến tay người gửi mẫu xét nghiệm Phịng thí nghiệm chẩn đốn phịng thí nghiệm có nhiệm vụ yếu làm xét nghiệm mẫu thử để phát tác nhân gây bệnh trả lời kết đến người gửi yêu cầu xét nghiệm để họ thể cho cách giải cụ thể vật chủ lấy mẫu gửi xét nghiệm Trong chăn nuôi hay thủy sản, kết phịng thí nghiệm chẩn đốn quan trọng có liên quan đến định giới hữu trách để tiêu hủy hay cô lập bầy đàn gia súc hay tôm cá Trong y học, phịng thí nghiệm chẩn đốn cịn gọi phịng thí nghiệm lâm sàng kết xét nghiệm nhà lâm sàng tham khảo để đưa phát đồ điều trị bệnh nhân Chính phịng thí nghiệm chẩn đốn phải phịng thí nghiệm khơng cho kết xác mà phải cho kết kịp thời đến tay người làm xét nghiệm Việc ứng dụng PCR real-time PCR chẩn đoán trở nên ngày dễ dàng cơng nghệ mở, phịng thí nghiệm tự pha chế thuốc thử để thực thử nghiệm Ngoài ra, nhu cầu sử dụng PCR real-time PCR chẩn đoán ngày nhiều có nhiều tác nhân gây bệnh chẩn đốn hay theo dõi cơng nghệ PCR real-time PCR Không vậy, giới, cơng nghệ PCR chẩn đốn hết quyền nên có bùng nổ sản phẩm chẩn đốn dựa cơng nghệ PCR real-time PCR nhiều hãng sản xuất cung cấp Do vậy, nói PCR khơng cịn bó hẹp cánh của phịng thí nghiệm nghiên cứu mà xâm nhập vào phịng thí nghiệm chẩn đốn 115 Tuy nhiên việc thí nghiệm dụng PCR real-time PCR chẩn đốn địi hỏi người làm ải biết quan tâm đến vấn đề kỹ thuật có liên quan để kết xét nghiệm đạt độ xác cao, đạt độ nhạy cảm tuyệt vời chất PCR real-time PCR, Các vấn ải kị thời đến tay người định xét nghiệm kỹ thuật c n quan tâm áp dụng PCR real-time PCR chẩn ốn Tiến trình xét nghiệm PCR real-time PCR Kể từ lấy mẫu thử gửi đến g thí nghiệm để làm xét nghiệm PCR hay real- time PCR chẩn đoán kết xét nghiệm đến tay người cho định xét nghiệm, tiến trình qua bước mà bước có vấn đề kỹ thuật cần quan tâm người làm xét nghiệm, người lấy mẫu xét nghiệm, người nhận để sử dụng kết xét nghiệm Sơ đồ trình bày bước Lấy chuyển mẫu thử làm xét nghiệm PCR/realtime PCR Các vấn đề kỹ thuật lấy gửi mẫu thử Chuẩn bị mẫu thử tách chiết nucleic acid từ mẫu thử Các vấn đề kỹ thuật tách chiết nucleic acid (NA) Thực ản ứng khuếch đại nucleic acid (PCR/real-time PCR) Các vấn đề kỹ thuật khuếch đại NA Làm thí nghiệm để đọc kết Phân tích kết Các vấn đề kỹ thuật thí nghiệm đọc KQ h n tích KQ Sử dụng kết xét nghiệm PCR/real-time PCR Các vấn đề kỹ thuật sử dụng kết Vấn đề ngăn ngừa nhiễm chéo loại trừ ngoại nhiễm sản ẩ khuếch đại tiến trình xét nghiệm Sơ đồ 3: Tiến trình xét nghiệm PCR/real-time PCR chẩn đoán vấn đề kỹ thuật cần quan tâm 116 Các v n kỹ thuật cần quan tâm a Các vấn đề kỹ thuật cần quan tâm lấy gửi mẫu thử Mẫu thử lấy làm xét nghiệm PCR/real-time PCR mẫu lấy từ vật chủ nơi mà người lấy mẫu cho có diện nucleic acid tác nhân đích, lao ải lấy mẫu thử chổ Ví dụ để ổi bệnh nhân mẫu thử M tuberculosis gây ải lấy đàm hay dịch hút từ rửa khí/phế quản, khơng thể lấy máu hay huyết Hay muốn phát Cytomegalovirus bệnh nhân mẫu thử tốt máu tòan phần để tách huyết tương hay tách bạch cầu, máu đông để tách huyết Vật liệu dùng để lấy giữ mẫu thử phải quan tâm khơng, nucleic acid tác nhân đích có mẫu bị phân hủy hay mẫu thử chứa chất ức chế phản ứng khuếch đại sau Do vật liệu tốt để lấy giữ mẫu thử vật liệu tinh mặt sinh học, nghĩa không nhiễm protein hay nuclease tiết từ vi sinh vật endonuclease, ribonuclease; sử dụng lần, khơng nên rửa xài lại Hình 59 mô tả số vật liệu nên sử dụng để lấy giữ mẫu thử làm xét nghiệm PCR/qPCR Các vật liệu hiên có sẵn cơng ty Nam Khoa Hình 59: Các lọ tube nên sử dụng để lấy giữ mẫu thử làm xét nghiệm PCR/qPCR Để bảo quản chuyên chở mẫu vấn đề kỹ thuật cần quan tâm làm mẫu giữ nguyên trạng, nucleic acid tác nhân đích khơng bị phân hủy trình bảo quản Do mẫu mà nucleic acid đích cần phát DNA bảo quản ngắn ngày (trong vịng 48 giờ) tủ mát 2-8oC, bảo quản lâu dài cần giữ -18oC đến -30oC Đối với RNA, mẫu hay khơng bị tạp nhiễm máu, dịch thể bảo quản 48 2-8oC, mẫu 117 tạ nhiễm nhiều quệt họng, quệt mũi sau tìm virus, đàm hay cần bảo quản dài ngày ải giữ mẫu -70oC Để chuyên chở mẫu cần chuyên chở thùng lạnh với thời gian chuyên chở không 48 Nếu thời gian chuyên chở lâu cần ải giữ đá khơ Nói chung, vấn đề kỹ thuật nêu lên nhằm mục tiêu, lấy mẫu cho chổ nơi có diện nucleic acid đích muốn tìm, chun chở mẫu thử đến tìm khơng bị ải giữ g thí nghiệm điều kiện cho nucleic acid muốn hủy mẫu thử không bị nhiễm chất sinh học gây ức chế ản ứng khuếch đại mẫu thử không bi nhiễm chéo Các vấn đề kỹ thuật chuẩn bị mẫu thử tách chiết nucleic acid b Trong khâu này, mục tiêu ải tách chiết tối đa nucleic acid đích dù lượng nucleic acid tác nhân đích có nhỏ có bị lỗng q thấ ải tinh khiết, khơng lẫn otein hay chất gây ức mẫu thử Tách chiết thu chế ản ứng khuếch đại Tùy loại mẫu thử tùy loại tác nhân đích có mẫu thử mà có mẫu thử đưa vào tách chiết nucleic acid ngay, có mẫu thử cần ải chuẩn bị trước đưa vào tách chiết nueic acid (NA) Ví dụ mẫu thử huyết thanh, huyết tương, cấy tế bào với tác nhân đích virus hay vi khuẩn có cấu tạo tế bào khơng đặc biệt đưa vào tách chiết nuleic acid ngay, với mẫu thư mẫu mô, mẫu sinh thiết hay vi khuẩn có cấu tạo tế bào đặc biệt M tuberculosis, nấm men, nấm sợi, mô thực vật cây-lá-rễ-hoa cần ải đưa vào chuẩn bị trước để cấu trúc mô tan (vdụ ải sử lý proteinase K), để tế bào (vdụ dùng chất tẩy TRITON X100, hay tán siêu âm, hay nghiền nitrogen lỏng ), hay trường hợp lát cắt sinh thiết đúc sáp cần phải loại bỏ sáp khỏi mô, mẫu có chất nhầy đàm cần phải làm tan nhầy (bằng NALC ) trước đưa vào tách chiết nucleic acid Do vậy, người làm xét nghiệm cần phải biết không mẫu thử cần phải qua giai đọan xử lý mẫu trước tách chiết NA mà phải biết phải sử dụng phương pháp với qui trình kỹ thuật 118 Tùy loại mẫu thử; tùy loại tác nhân đích vi khuẩn, virus, vi nấm, hay tế bào có nhân; tùy NA chiết cho ải tách chiết DNA hay RNA mà hợ , khơng nên lẫn lộn Ví dụ ương ải lựa chọn ương tách Boom tốt để tách chiết dịch sinh học hay mẫu thử lẫn DNA vật chủ ngun tắc dựa vào hấ ụ DNA hạt silica, nên mẫu có nhiều DNA vật chủ mơ sinh thiết DNA tác nhân đích bị cạnh tranh không bám vào hạt silica Do vậy, để tách chiết DNA cho mẫu thử mơ sinh thiết nên chọn ương p phenol/chloroform phương pháp BOOM Cũng sử dụng phương pháp tách chiết cho RNA vào để tách chiết DNA, mà thấy phương pháp BOOM tốt cho tách chiết DNA lại cho tách chiết RNA Khi lựa chọn phương pháp hay thuốc thử tách chiết cho tác nhân virus hay vi khuẩn đích, phải xem kỹ tách chiết hay phương pháp tách chiết NA mà lựa chọn có áp dụng cho vi khuẩn hay virus khơng? Vì có thất bại xét nghiệm PCR vô ý Tách chiết NA khâu quan trọng; tách chiết NA phải đảm bảo độ nhạy xét nghiệm PCR đạt độ nhạy mong muốn Do tự pha thuốc thử tách chiết NA hay sản xuất thuốc thử tách NA, trước đưa vào sử dụng xét nghiệm PCR/real-time PCR, phịng thí nghiệm hay nhà sản xuất phải kiểm tra chất lượng để xem tách chiết có đảm bảo độ nhạy hay khơng Phương pháp kiểm tra phải thử độ pha lõang tác nhân đích (là đối tượng mà phịng thí nghiệm hay người dùng phải sử dụng tách chiết NA để thực xét nghiệm) hay tác nhân khác tương đương Đạt độ nhạy tách chiết NA thử nghiệm độ pha lỗng tác nhân đích phải đạt giới hạn phát (limit of detection, LOD), tức đạt số lượng vi khuẩn đích thấp có đơn vị thể tích mẫu thử mà phương pháp hay thử nghiệm tách chiết phát Minh họa (hình 60) kết kiểm tra chất lượng kit tách chiết DNA tên NK DNAPREP-BOOM công ty Nam Khoa sản xuất kiểm tra chất lượng Phương pháp kiểm tra sử dụng độ pha loãng vi khuẩn M tuberculosis, cho vào tách chiết DNA với thuốc thử sản xuất đồng thời so sánh với thuốc thử NK DNAPREP-BOOM sản xuất trước Kết kiểm tra cho 119 thấy thuốc thử NK DNAPREP-BOOM sản xuất thuốc thử NK DNAPREP- BOOM sản xuất trước đạt khả tách chiết vi khuẩn đích đến độ a lõang 10-4, chứa vi khuẩn thể tích 100ml dịch vi khuẩn đưa vào tách chiết Trong ương huyền dịch vi khuẩn có bị giảm chất lượng kết kiểm tra đọc nhờ có so sánh NK DNAPREP-BOOM sản xuất với NK DNAPREP-BOOM sản xuất lơ trước lơ đạt chất lượng Hình 60: Kết kiểm tra chất lượng thuốc thử NKDNAPREP-BOOM công ty Nam Khoa sản xuất Đối tượng dùng để kiểm tra thuốc thử huyền dịch vi khuẩn M tuberculosis TB1 chứa 10.000 tế bào vi khuẩn/ml pha lỗng theo hệ số 10 để có 1,000 tế bào vi khuẩn/ml (T2), 100/ml (T3), 10/ml (T4), NK 1/ml (T5) Phương pháp kiểm tra sử dụng thuốc thử DNAPREP-BOOM cần kiểm tra NK DNAPREP-BOOM sản xuất trước để thực tách chiết huyền dịch vi khuẩn pha loãng này, thể tích huyền dịch để tách chiết 100ml, lấy 10ml dịch tách chiết để chạy PCR phát M tuberculosis Phát DNA M tuberculosis có dịch tach chiết qua điện di phát sản NK phẩm khuếch đại 249bps Kết cho thấy hai thuốc thử DNAPREP-BOOM củ đạt LOD tế bào vi khuẩn M tuberculosis thể tích tách chiết Không kiểm tra chất lượng thuốc thử tách chiết NA chế trước sử dụng, mà lần sử dụng để làm xét nghiệm, thuốc thử tách chiết ải kiểm soát độ nhạy cách cho nucleic acid chứng nội nồng độ LOD vào mẫu chứng [-] muốn, cho vào mẫu thử để thực tách chiết lúc với mẫu thử (xem c ần chứng nội tại) Các vấn đề kỹ thuật khuếch đại nucleic acid đích Về nguyên tắc PCR/real-time PCR đạt độ nhạy cao, nhiên thực tế độ nhạy cịn tùy thuộc nhiều vào thiết kế hay chọn lựa mồi; vào thiết bị luân nhiệt; vào hóa chất, đặc biệt enzyme Taq 120 merase sử dụng Khâu khuếch đại khó đạt độ nhạy trì độ nhạy trình lưu trữ erase để sử dụng nhà sản xuất hay người làm thí nghiệm khơng chọn lọc Taq Ngồi yếu tố kỹ thuật cần khâu khuếch đại, tự biết trước số lượng nhạy đạt giới hạn ản ứng khuếch đại, người hay sản xuất PCR mix cho làm thí nghiệm hay nhà sản xuất vào sử dụng Phương ải quan tâm trên, để đảm bảo độ nhạy ải kiểm tra độ nhạy PCR mix trước đưa kiểm tra thử nghiệm độ lõang DNA đích đơn vị thể tích PCR mix gọi đạt độ DNA đích cho vào PCR mix, (LOD) DNA đích cho nghĩa thể tích mẫu cho vào PCR mix cần có kết khuếch đại thành nhiều tích kết (xem mục kiểm tra độ nhạy PCR mix pha PCR-các vấn đề bản) 10 100 1,000 10,000 Biểu đồ 16: Kết kiểm tra chất lượng real-time PCR mix sử dụng mồi Taqman probe định lượng HBVDNA Kết kiểm tra cho thấy độ nhạy PCR mix đạt LOD copy HBV-DNA thể tích mẫu cho vào PCR mix Các đường biểu diễn màu xanh sáng đường biểu diễn khuếch đại chứng nội cho vào PCR mix nồng độ LOD với mẫu kiểm tra Biểu đồ 16 minh họa kết kiểm tra chất lượng real-time PCR mix dùng mồi Taqman probe để phát định lượng HBV-DNA công ty Nam Khoa sản xuất Kết kiểm tra cho thấy độ nhạy PCR mix đạt LOD copy cho thể tích mẫu cho vào PCR mix, độ nhạy địi hỏi PCR/real-time PCR chẩn đốn 121 Ngồi việc kiểm tra chất lượng PCR mix trước đưa vào sử dụng, người làm xét nghiệm thực xét nghiệm PCR ải kiểm soát cho độ nhạy PCR mix sử dụng lần làm xét nghiệm Thực vấn đề kiểm soát điều kiện bắt buộc dù PCR mix có kiểm tra đạt chất lượng sau chế hay sản xuất, giảm chất lượng trình lưu trử hay bảo quản, đặc biệt chế nguồn Taq không đảm bảo chất lượng Có nhiều cách để kiểm sốt chất lượng PCR mix làm xét nghiệm PCR/real-time PCR chẩn đoán Có thể sử dụng chứng [+] DNA đích sẵn hay nhà sản xuất cung cấp nồng độ LOD cho vào PCR mix lần làm xét nghiệm PCR/real-time PCR chẩn đốn, hay sử dụng DNA chứng nội sử dụng chung mồi pha nồng độ LOD cho vào PCR chung với tách chiết DNA từ mẫu để kiểm soát ức chế PCR đồng thời kiểm soát độ nhạy PCR mix (xin xem thêm mục chứng nội tại, chứng dương, chứng âm phần chuẩn mực kiểm soát chất lượng cho xét nghiệm PCR/real-time PCR dành cho chẩn đoán) d Ngừa nhiễm chéo loại trừ ngoại nhiễm sản phẩm khuếch đại Muốn sử dụng PCR/real-time PCR chẩn đoán, người làm xét nghiệm phải nhận diện để có biện pháp kỹ thuật ngăn ngừa hay loại trừ nguy ngoại nhiễm làm cho mẫu thử khơng có tác nhân đích lại bị có kết dương tính làm xét nghiệm, nghĩa bị nguy dương tính giả Ngoại nhiễm xét nghiệm PCR/realtime PCR chẩn đốn xãy hai nguyên Nguyên thứ nhiễm chéo làm cho mẫu âm hay thuốc thử làm xét nghiệm bị nhiễm nucleic acid đích từ mẫu dương Với ngun người làm thí nghiệm hịan tịan phịng ngừa trí phịng thí nghiệm cách hợp lý với phương tiện thiết bị phù hợp, ví dụ thiết kế để khu vực pha thuốc thử cách xa khu làm mẫu; không để lẫn lộn thuốc thử pha dùng với nguyên liệu dung dịch dùng để pha thuốc thử; dụng cụ tài liệu dùng khu vực làm mẫu không đem qua khu vực pha thuốc thử; khơng để phịng thí nghiệm vi sinh ni cấy tác nhân đích phịng thí nghiệm PCR/real-time PCR chẩn đốn phát tác nhân Ngồi cách bố trí phịng thí nghiệm làm việc cho hợp lý, người làm xét nghiệm PCR/real-time PCR phải 122 huấn luyện để nhuần nhuyễn thao tác vô trùng đặc biệt đóng mở tube, chai lọ, g, bố trí vật liệu dụng cụ thao tác thao tác Đối với nguyên thứ hai ngoại nhiễm sản ẩ khuếch đại với giải kỹ thuật nêu khó tránh nguy này, lý ng xét nghiệm PCR/real-time PCR chẩn đoán, sản nhiều chắn khơng sớm muộn sản ẩ ẩ PCR tích tụ ngày PCR nhiễm vào dụng cụ, thuốc thử, thiết bị đến lúc người làm xét nghiệm nhận dạng thảm họa mẫu xét nghiệm PCR cho kết dương tính Đến lúc đổ bỏ tòan thuốc thử, khử nhiễm tòan có giải ng thí nghiệm, đóng vài tháng Rồi lại mở cửa làm lại, thảm họa tái xuất Mô tả để thấy khơng thể có biện nhiễm sản ẩ hiệu để ngừa ngoại khuếch đại, mà có cách Để làm điều cách từ đầu ải sử dụng PCR mix có ngoại nhiễm sản ẩ ẩ ẩ thêm dUTP UNG Cơ chế loại trừ khuếch đại PCR-các vấn đề tích trên, thấy muốn làm xét nghiệm PCR chẩn đoán, khơng thể khơng sử dụng biện Nếu khơng g thí nghiệm PCR chẩn đoán khuếch đại dUTP UNG nói chi tiết mục loại trừ ngoại nhiễm sản Qua ải loại trừ nguy dụng biện dùng PCR mix có dUTP UNG này, khơng sớm muộn, thảm họa ngoại nhiễm sản khuếch đại xãy Tuy nhiên có vấn đề kỹ thuật dùng dUTP UNG khơng chọn enzyme UNG hiệu hợ độ nhạy PCR/real-time PCR giảm và/hay khơng thể có hiệu loại trừ ngoại nhiễm sản ẩ khuếch đại Chính người sử dụng loại trừ ngoại nhiễm sản ẩ ải kiểm tra độ nhạy kiểm tra khả khuếch đại PCR mix công bố có dUTP UNG Hiện tất hãng nước sản xuất PCR mix dùng cho PCR/real-time PCR chẩn đoán sử dụng dUTP UNG Tại Việt Nam, công ty Nam Khoa công ty tiên ng hàng đầu dụng giải Tất thuốc thử PCR/real-time PCR dùng chẩn đoán công ty Nam Khoa sản xuất sử dụng PCR mix có dUTP UNG nguồn hóa chất chọn lọc để đảm bảo không giảm độ nhạy mà hiệu loại trừ ngoại nhiễm sản ẩ với chứng kiểm tra chất lượng độ nhạy kèm với sản 123 khuếch đại cao ẩ Các vấn đề kỹ thuật thử nghiệm điện di thạch để đọc kết e Đối với ương PCR cổ điển muốn đọc kết quả, người làm thí ải làm tiế thí nghiệm để xác định ống nghiệm khuếch đại đặc hiệu hay không Phương ản ứng có sản thường ẩm dụng g thí nghiệm PCR chẩn đốn dùng kỹ thuật điện di để xác định kích thước sản ẩ khuếch đại có kích thước mong muốn hay khơng Chính ương thường sử dụng nhất, nên xin đưa số vấn đề kỹ thuật cần người làm thí nghiệm quan tâm § Chọn tỷ lệ % agarose để điện di cho hợ với kích thước sản đại Trung bình dùng tỷ lệ 2% Đối với sản ẩ ẩ khuếch khuếch đại lớn 500bps nên dùng agarose 1.5%, sản phẩm khuếch đại kích thước 100bps nên dùng agarose 2.5% § Khi pha gel agarose, lưu ý phải làm tan hòan tòan agarose đệm điện di, để làm điều phải cho agarose vào bình có sẵn dung dịch đệm diện di, nhờ tránh agarose bị bám vào đáy bình không tan sau đun Trước cho vào lị vi sóng phải lắc trộn để agarose hịa dung dịch đệm Khi đun, phải hai lần lấy bình khỏi lị vi sóng để lắc trộn cho vào đun tiếp Phải đảm bảo agarose tan dung dịch đệm, không cịn thấy lợn cợn dù nhỏ Có có kết điện di tốt § Trước đổ agarose vào khuôn, phải đảm bảo khuôn nằm mặt ph ng nằm ngang kiểm tra bóng khí để bề dày agarose thật dày kết điện di xác § Trong PCR chẩn đốn, khơng nên trộn đệm tải với sản phẩm PCR giấy paraffin làm gây nguy ngoại nhiễm Nên cho đệm tải với thể tích ¼ thể tích dung dịch phản ứng có tube PCR trộn tube § Thể tích mẫu cho vào giếng khơng nên q mà phải từ 15ml trở lên có phát kết [+] yếu § Ln điện di kèm với thang DNA chuẩn khơng dùng để xác định kích thước vạch điện di mẫu mà chuẩn để kiểm 124 ứ [-] cho PCR mix Định nghĩa: Chứng [-] cho PCR mix mẫu nước tinh hay TE 1X cho vào PCR mix lần làm xét nghiệm PCR/real-time PCR chẩn đốn Vai trị: Chứng [-] cho PCR mix nên cho vào PCR mix cho lần chạy PCR, cho vào cuối sau cho mẫu chứng [+] vào PCR mix tương ứng mục đích sau: § Chứng minh thao tác cho mẫu chứng [+] vào PCR mix không bị nhiễm chéo hay không bị nhiễm sản ẩ có kết [+] sản ngoại nhiễm sản § ẩ ẩ khuếch đại chứng [-] cho PCR mix lại khuếch đại thao tác bị nhiễm chéo hay khuếch đại Chứng minh PCR mix sử dụng hoàn toàn tinh khơng bị nhiễm ẩ DNA ngoại lai chứng [-] lại có kết sản khuếch đại khơng đặc hiệu [+] chứng tỏ PCR mix bị nhiễm DNA ngoại lai § Tuy nhiên chứng [-] cho PCR mix khơng kiểm tra tồn qui trình thực thử nghiệm PCR có bị ngoại nhiễm sản ẩ khuếch đại hay nhiễm chéo không Muốn kiểm tra tồn qui trình thực thử nghiệm PCR người thực thử nghiệm ải thực qui trình PCR mẫu thử biết trước [-] tính thực song song với mẫu bệnh ẩ Vì mục đích nên thực thử nghiệm PCR, người thực thử nghiệm nên để dành PCR mix chứng [-] Chứng nội (Internal control, IC) Định nghĩa: Là DNA khuếch đại song song với DNA đích cho sản ẩ khuếch đại có: (1) kích thước khác (trong PCR kinh điển) sản DNA đích nhờ tồn hay khác ẩ khuếch đại biệt điện di; và/hay (2) trình tự khác hoàn ần (trong PCR-ELISA hay real-time PCR) nhờ biệt sử dụng dị đặc hiệu (specific probe) Các loại chứng nội tại: Có loại chứng nội sau đây, tùy nguồn gốc thiết kế: § Chứng nội DNA gen vật chủ (hình 63-A), ví dụ b globin gene bệnh phẩm mô lấy từ người, hay myoglobin gene tôm bệnh phẩm 131 mẫu tôm sú Để khuếch đại DNA chứng nội tại, ải cho thêm vào PCR mix cặ mồi đặc hiệu với DNA chứng nội nên thiết kế mồi cho nhiệt độ bắt cặ tương tự nhiệt độ bắt cặ mồi dành cho với mồi DNA đích Do sử dụng DNA đích, khơng tạo dimer DNA gene vật chủ nên chứng nội kiểm soát mẫu thử có đủ khơng, kiểm sốt hệ thống tách chiết nucleic acid mẫu thử có tốt khơng, kiểm sốt ức chế có hay khơng Tuy nhiên loại chứng nội khơng kiểm sốt hệ thống khuếch đại DNA đích dùng mồi khác biệt dùng cho số bệnh ẩ có chứa đủ lượng tế bào mô vật chủ B A D C Hình 63: Các lọai chứng nội (A) gene vật chủ; (B) DNA tổng hợp có nguồn gốc từ DNA đích; (c) DNA tổng hợp có nguồn khác DNA đích sử dụng mồi DNA đích; (D) DNA khác biệt hịan tịan với DNA đích § Chứng nội DNA tổng hợ có nguồn gốc DNA đích (hình 63-B), DNA tổng hợ cách dùng sản ẩ khuếch đại DNA đích cắt ngắn hay chèn đoạn DNA nhỏ để làm cho dài Chứng nội loại sử dụng mồi với DNA đích nên khơng cần thiết kế mồi thêm vào PCR mix § Chứng nội DNA tổng hợ có nguồn gốc khác DNA đích sử dụng mồi với DNA đích (hình 63-C), DNA tổng hợ cách dùng 132 ẩ sản khuếch đại DNA khác biệt với DNA đích chèn hai đầu trình tự giống hệt trình tự mồi DNA đích Do sử dụng mồi với DNA đích nên khơng cần thiết kế mồi thêm vào PCR mix ứ § nội hệ th ng mồi DNA khác biệt với DNA đích (hình 63- D), Được khuếch đại song song với DNA đích dùng mồi khác biệt DNA đích DNA chứng nội có nguồn gốc khác biệt hồn tồn với DNA đích Để khuếch đại DNA chứng nội tại, ải cho thêm vào PCR mix cặ mồi đặc hiệu với DNA chứng nội nên thiết kế mồi cho nhiệt độ bắt cặ tương tự nhiệt độ bắt cặ mồi dành cho DNA đích, khơng tạo dimer i với mồi DNA đích Vai trị chứng nội tại: Tuỳ cho vào giai đoạn mà chứng nội dùng cho vai trị sau: § Kiểm sốt tách chiết mẫu bệnh vào bệnh § ẩ tốt hay khơng cho ẩm lượng tối thiểu vừa đủ (LOD) hay có sẵn bệnh ẩ Kiểm sốt ức chế để xác định kết âm tính thật hay âm tính giả có ức chế diện mẫu tách chiết cho vào PCR mix nồng độ LOD trước hay sau cho tách chiết DNA từ bệnh § ẩm Kiểm sốt hệ thống khuếch đại DNA đích có đạt độ nhạy hay không chứng nội dùng chung mồi với DNA đích diện mẫu thử hay cho vào PCR mix nồng độ LOD § Kiểm sốt hệ thống tách chiết dùng có tốt hay khơng thao tác có ngoại nhiễm khơng có sẵn mẫu thật làm chứng âm hay cho vào mẫu thật làm chứng âm để tham gia tách chiết với mẫu bệnh h Các vấn đề kỹ thuật cần biết đọc ẩm n tích kết real-time PCR định lượng sử dụng mồi taqman probe Sau hịan tất chương trình chạy real-time PCR máy, phân tích để có kết định lượng xác vấn đề quan trọng đòi hỏi người phân tích phải hiểu rõ vấn đề lý thuyết kỹ thuật real-time PCR chúng tơi xin trình bày bước phân tích kết real-time PCR với mồi đặc hiệu Taqman probe gắn màu FAM phát hùynh quang dành phát hiện/định lượng DNA đích, cịn 133 Taqman robe gắn màu Hex phát hùynh quang dành phát sản phẩm khuếch đại từ chứng nội sử dụng chung mồi DNA đích Phân tích kết nên theo bước sau ướ h t chọn giếng chứng [-]: Chỉ chọn giếng để phân tích giếng chứng [-] Chọn kênh hùynh quang “Fam”, thấy giếng chứng [-] có đường biểu diễn khuếch đại không vượt qua khỏi đường hùynh quang (baseline) tức âm tính Nếu kênh “Fam” mà chứng [-] có đường biểu diễn khuếch đại vượt qua khỏi baseline (dương tính) có nguy ngoại nhiễm q trình cho mẫu vào PCR mix Bỏ kênh hùynh quang “Fam”, chọn kênh hùynh quang “Hex”, lúc chứng [-] có đường biểu diễn khuếch đại vượt qua khỏi baseline (dương tính) Nếu kênh “Hex” mà chứng [-] cho đường biểu diễn khuếch đại không vượt qua khỏi baseline (âm tính) có nguy PCR mix không đủ nhạy cảm cho khuếch đại/phát DNA chứng nội hay chứng nội cho vào bị hư (khi tất giếng khác, đường biểu diễn khuếch đại kênh Hex âm tính, tình phải yêu cầu nhà sản xuất cung cấp lại chứng nội tại) Định đường chu n: Chỉ chọn kênh hùynh quang “Fam” kênh hùynh quang cho taqman probe DNA đích, “Hex” khơng Chọn chọn kênh giếng chuẩn giếng chứng [-], đồng thời loại trừ giếng có mẫu thử giếng khác Sau cho giá trị số (copies) DNA đích chuẩn ban đầu Biểu đồ 17: M t bi u đồ chuẩn đánh giá đạt có E khỏang 90-105%, cịn R2 0.99 Phải có biểu đồ chuẩn đạt tiếp tục phân tích kết vào giếng chứa độ pha loãng DNA chuẩn Sau cho giá trị số copies vào giếng chuẩn, để máy chọn đường baseline theo chế độ tự động để có biểu đồ chuẩn (gọi standard graph) Nếu đường baseline mà máy chọn theo chế độ tự động cắt phải đường biểu diễn chứng [-] người sử dụng trước hết chỉnh baseline cycle (các chu kỳ nền) giếng chứng [-] để xem đường biểu diễn chứng [-] có hạ 134 xuống khơng, khơng ải nâng đường baseline lên để đường baseline không cắt đường biểu diễn chứng âm Đánh giá biểu đồ chuẩn lý tưởng (biểu đồ 17) biểu đồ cho hệ số tương quan (R) ³0.990; đồng thời hiệu PCR (PCR efficiency = E) từ 90% đến 105%, độ dốc (slope) đường biểu diễn khỏang -3.4 đến -3.6 Nếu đường biểu diễn không đạt chúng ta, trước hết xem lại giếng chuẩn để điều chỉnh baseline cycle giếng kết hợp với việc nâng lên hay hạ xuống đường baseline để đưa giá trị R E trị số lý tưởng Nếu chưa đưa R E giá trị lý tưởng thay đổi giá trị trị số copies khỏang cho phép không độ pha lõang (ví dụ giá trị ghi 10 copies, thay giá trị từ 10 đến 99; hay giá trị ghi 100 thay giá trị từ 100 đến 999) để có đường biểu diễn chuẩn đạt lý tưởng (tuy nhiên làm cách cách bất khả kháng thật phải thay đổi giá trị số copies chuẩn có nghĩa phải chấp nhận sai số thao tác pipetting rồi, mà chấp nhận phải chấp nhận có sai số kết định lượng) Chuyển biểu đồ khuếch đại sang dạng log để cố định đường sau chuyển lại dạng graph bình thường Ghi nhận trị số baseline đường chuẩn Lưu ý: Việc thực PCR mẫu chuẩn có hai ý ngh a: (1) Cho đường chuẩn để làm sở tính tốn số copies ban đầu mẫu thử; (2) Kiểm soát thao tác pipetting người làm thí nghiệm có tốt khơng, qua trị số R E có đạt khơng Do mà người làm thí nghiệm bắt buộc phải cho mẫu chuẩn chạy PCR Một số công ty nước không hiểu ý nghĩa việc nên họ cung cấp chuẩn cho sẵn vào PCRmix, làm kết định lượng chắn khơng đảm bảo xác khơng thể kiểm soát thao tác pipetting người làm xét nghiệm có tốt khơng Định s lượng copies ban đầu có giếng chứa mẫu thử: Sau có đường chuẩn, xác định số lượng copies ban đầu (SQ = starting quantity) DNA đích giếng mẫu thử cách chọn giếng vào phân tích với giếng chuẩn Đối với mẫu có đường biểu diễn khuếch đại cắt đường baseline số lượng định lượng SQ có thể tích mẫu đưa vào phản ứng (biểu đồ 18) Để tính số copies 1ml huyết thanh, nhân SQ với hệ số K (là 135 hệ số có liên quan đến độ thu hồi sau tách chiết mẫu chuẩn biết rõ số copy có chèn DNA) Biểu đồ M u có đường biểu diễn khuếch đại ngóc lên cắt baseline mẫu định lượng dương tính Trị số định lượng SQ xác định số copies có thể tích mẫu thử cho vào ống phản ứng Số lượng copiesDNA có ml máu bệnh nhân tính cách nhân SQ với 50 Biểu đồ 19: Mẫu kết luận âm tính (đường biểu diễn khuếch đại đọc kêng FAM khơng ngóc lên) hay ngưỡng phát (đường biểu diễn khuếch đại đọc kêng FAM ngóc lên khơng cắt đường baseline) có tín hiệu khuếch đại chứng nội đọc kênh hùynh quang HEX Đối với mẫu mà đường biểu diễn khuếch đại khơng ngóc lên hay ngóc lên khơng cắt baseline chọn thêm kênh màu “Hex” để xem có đường biểu diễn khuếch đại DNA chứng nội hay không? Nếu có kết luận “mẫu âm tính” mẫu có đường biểu diễn khuếch đại khơng ngóc lên (biểu đồ 19) trả lời “mẫu ngưỡng phát hiện” mẫu có đường biểu diễn khuếch đại ngóc lên khơng cắt đường baseline Nếu khơng có đường biểu diễn khuếch đại chứng nội có khả mẫu chất ức chế, nên thực lại tách chiết, mẫu bị ức chế (khơng có tín hiệu 136 khuếch đại DNA chứng nội tại) kết luận “mẫu bị ức chế, xin mẫu khác để làm lại” Đối với mẫu có đường biểu diễn khuếch đại cắt đường baseline sớm ngóc lên sớm cắt đường baseline lại khơng ngóc lên thêm nữa, chọn giếng này, chỉnh lại baseline cycle có máy tự động chọn khỏang baseline cycle ngắn nên làm mẫu có tín hiệu khuếch đại ngóc lên q sớm Nếu sau chọn lại mẫu có đường biểu diễn khuếch đại giống mẫu âm tính tích mẫu âm tính Nếu có đường biểu diễn khuếch đại giống mẫu dương tính i tích giống mẫu dương tính Trả lời kết PCR/real-time PCR chuẩn mực PCR/real-time PCR xét nghiệm nhạy cảm đặc hiệu Tuy nhiên chất lượng xét nghiệm tuỳ thuộc vào ương trình độ thực xét nghiệm, ưu điểm đạt người làm xét nghiệm có đủ tri thức để kiểm sốt sơ sót q trình thực xét nghiệm thơng qua chuẩn mực bắt buộc ải có làm xét nghiệm Chứng [+] phải cho kết [+] để chứng minh khâu khu ch i t nhạy Chứng [-] phải cho kết [-]với đích phải cho kết [+] với chứng nội để chứng minh khâu tách chi t khu ch i t nhạy trình làm xét nghiệm không b ngoại nhi m Mẫu muốn kết luận [-] phải cho kết [+] với chứng nội kết [-] với đích để chứng minh m u khơng bị ức chế Hình 64: M t kết PCR định tính chuẩn mực phải thể tất điểm kiểm sốt q trình làm xét nghiệm giải thích Ngồi địi hỏi quan real-time PCR định lượng, ải có kết định lượng xác Trong y sinh học, xét nghiệm định lượng đòi hỏi PCR định lượng ải chạy mẫu thử lúc với mẫu chuẩn Mẫu chuẩn ải cho kết đạt tuyến tính cao với hiệu PCR tuyệt đối để chứng minh người làm xét nghiệm thao tác ipetting chuẩn, khơng có sơ sót Không 137 ải biết sử dụng chuẩn mực để kiểm soát chất lượng khâu làm xét nghiệm, mà khâu trả lòi kết xét nghiệm, người làm thí nghiệm ải thể kiểm soát Một kết ế trả lời xét nghiệm PCR định tính đến Khuếch đại nộng độ chuẩn trình tự đích Khuếch đại chứng nội phát nhờ taqman probe đặc hiệu giúp người sử dụng kiểm sóat đ✭ c ✰c ch✲ mẫu có hay khơng tay người định xét nghiệm khơng Khuếch đại trình tự chứng nội Khơng có khuếch đại đích xem chuẩn mực ế trả lời kết chứng minh kiểm sốt có Các chuẩn giúp kiểm sóat ✦✁ xác pipetting biểu đồ chuẩn đạt R≥0.99 and E=90-105% giúp định lượng xác số copies đích có mẫu thử thực trình làm xét nghiệm Hình 64 minh họa cắt nghĩa ải thể chuẩn mực kết xét nghiệm PCR định tính Một kết xét Biểu đồ 20: Minh họa trình bày kết PCR định lượng chuẩn mực với biểu đồ chuẩn chứng minh mẫu chạy chung với chuẩn thao tác pipetting kiểm soát chuẩn mực (B), nhờ mà kết định lượng xác (A) nghiệm PCR định lượng đến tay người định xét nghiệm không xem chuẩn mực ếu trả lời kết chứng minh (i) mẫu thử chạy chung với mẫu chuẩn qua đường biểu diễn chuẩn có vị trí mẫu thử, (ii) thao tác định lượng chuẩn mực qua hiệu PCR hệ số tương quan biểu đồ chuẩn đạt thông số lý tưởng, (iii) mẫu kết luận âm tính hay ngưỡng ải có dường biểu diễn khuếch đại chứng nội Các biểu đồ 20-A 20-B minh họa cắt nghĩa chuẩn mực ải thể kết xét nghiệm real-time PCR định lượng Thao tác thí nghiệm chuẩn mực thể kết chuẩn mực, PCR/real-time PCR chẩn đốn 138 j Các vấn đề kỹ thuật cần biết sử dụng kết PCR/real-time PCR chẩn đoán PCR/real-time PCR cơng cụ tuyệt vời dùng chẩn đốn độ nhạy cảm khó có xét nghiệm sánh kị , đồng thời độ đặc hiệu PCR/realtime PCR chẩn đoán ương tác nhân vi sinh gây bệnh khơng khác vi sinh nuôi cấy Tuy nhiên việc sử dụng kết PCR/real-time PCR có hiệu hay khơng tùy thuộc vào hiểu biết người sử dụng kết cho định làm xét nghiệm Chúng xin đưa số minh họa sử dụng kết PCR/real-time PCR để tác nhân vi sinh gây bệnh cho người Kết PCR/real-time PCR [+] có xác định người bị thử nhiễm tác nhân vi sinh gây bệnh?: Đúng PCR/real-time PCR sinh gây bệnh thông qua bệnh ẩ trực tiế tác nhân vi nucleic acid đích đặc hiệu vi sinh vật có mặt lấy từ bệnh nhân Tuy xác định người bị thử thử nhiễm tác nhân vi sinh gây bệnh có xác định người bị bệnh hay khơng để điều trị vấn đề khác Lấy ví dụ người thử đàm vi khuẩn lao thử nghiệm PCR, kết [+], bác sĩ chưa nên cho định điều trị lao mà xem thử X quang ổn có thâm nhiễm rõ đỉnh khơng điều trị Nếu X quang ải ổi tiêu biểu cho nhiễm lao hay ổi bình thường nên theo dõi tiế quan xét nghiệm PCR qua X quang ổi để xem có diễn tiến đến lao hay khơng tong vịng 1-3 tháng, khơng diễn tiến đến lao khơng cần thiết để điều trị cho bệnh nhân Kết PCR/real-time PCR [-] có xác định người bị thử không mang tác nhân gây bệnh khơng? Khơng PCR/real-time PCR khơng thể cho giá trị tiên đoán âm (negative i e value, NPV) đạt 100% cho dù lấy mẫu xác thử nghiệm xác, kết cịn tùy thuộc nhiều vào diễn tiến tác nhân gây bệnh thể người thử Ví dụ người HbsAg [+], thử HBV-DNA cho kết [-], nói người khơng nhiễm HBV hay khơng? Chắc chắn khơng, người cịn mang HBV gan giai đọan mà miễn dịch không đặc hiệu thể át chế virus nên HBV gan tạo virus khơng hịan chỉnh kháng ngun bề mặt khơng có lõi DNA mà thơi Đây trường hợ người lành mang HBV, người bị nhiễm HBV có 139 nguy lây nhiễm cho người khác Do thường gặ nhiều kết HBV-DNA [-] bệnh nhân HBsAg [+] Sử dụng kết real-time PCR định lượng cho đúng? Đây vấn đề cần bàn Chúng ta biết real-time PCR dùng định lượng tác nhân vi sinh đích, gọi qPCR, có giá trị để đánh giá theo dõi hiệu điều trị bệnh nhiễm virus HBV, HCV, HIV Tuy nhiên làm để biết khác biệt kết định lượng có ý nghĩa? Có nhiều người nhầm lẫn vấn đề nên cho đánh giá hay nhận xét sai lầm hiệu điều trị Kết định lượng coi khác biệt khác biệt hai lần thử hay 100 lần, gọi log10 Lý ải log10 định lượng người ta xây dựng đường chuẩn dựa vào độ pha loãng theo hệ số 10 nồng độ DNA chuẩn, sai số chấp nhận vịng độ pha lõang nên kết xem khác biệt cách độ pha lõang, tức log10 Chính vậy, để tránh cho nhà lâm sàng đánh giá sai, giới nhà bệnh học chấp nhận trả lòi kết log10 số lượng copy xác Ví dụ kết 425,379,000 copy trả lời 4.25 log 8, hay đơn giản log Như kết lần 117,318,000 copy trả lời 1.17 log 8, hay đơn giản log Với cách trả lời bác sĩ điều trị thấy lượng virus chưa giảm sau thời gian điều trị Ngoài ra, nhà điều trị hiểu vấn đề này, họ không định cho bệnh nhân làm xét nghiệm định lượng thời gian ngắn vài tuần sau xét nghiệm định lượng, chắn thời gian ngắn khó để đánh giá so sánh kết định lượng với d ng m t phịng thí nghiệm time PCR chẩn ốn Một phịng thí nghiệm PCR chẩn đốn bao gồm phịng khu vực làm việc sau: Phòng tách chiết nucleic acid Đây phòng làm nhiệm vụ tách chiết nucleic acid cho mẫu tách chiết vào PCR/real-time PCR mix để chuẩn bị cho vào máy chạy PCR Phòng cần trang bị thiết bị dụng cụ sau: 140 Một buồng thao tác PCR tủ thao tác khí tỉnh có trang bị đèn chiếu sáng đèn cực tím, buồng đặt từ hãng sản xuất nước hay tự đóng (hình 65) Kích thước tối thiểu cho người làm việc Trong buồng thao tác ải trang bị dụng cụ thiết bị sau: vortex x 2, máy ủ nhiệt khô x 2, máy hút chân không x 1, m 1000ul x 2, micropipette 20-200ul x 2, micropipette 1-20ul x 1, lọ để vật liệu dơ, nhiễm x Các thiết bị khác phải có: máy ly tâm 13,000 x 2, máy ly tâm lạnh 13,000 x 1, máy ly tâm bàn 4000 cho tube 15ml x 1, tủ đông -18 đến -30oC với số lượng tùy vào mẫu nhiều hay ít, tủ mát # 280 lít với số lượng tùy mẫu nhiều hay Phòng đặt máy PCR real-time PCR Đây phòng làm nhiệm vụ chạy máy PCR real-time PCR Phòng cần trang bị máy real-time PCR máy PCR thường với số lượng tùy mẫu nhiều hay Để làm chẩn đốn nên đặt máy hãng có giấy phép quốc tế (lisence) cung cấp máy PCR/real-time PCR dùng cho chẩn đoán Biorad cơng ty có giấy phép Để đảm bảo máy chạy ổn định, không bị tắt cúp điện chừng nên trang bị lưu điện 6KVA phải có dây nối đất Phịng đặt máy PCR nên thơng với phịng tách chiết nucleic acid Phòng điện di đọc kết Đây phòng làm nhiệm vụ chế gel điện di, thực điện di đọc kết điện di Phòng phải trang bị thiết bị dụng cụ sau: Một buồng thao tác điện di: tủ thao tác khí tỉnh có trang bị đèn chiếu sáng đèn cực tím, buồng đặt từ hãng sản xuất nước ngồi hay tự đóng (hình 65) Kích thước tối thiểu cho người làm việc Trong buồng thao tác phải trang bị dụng cụ thiết bị sau: vortex x 1, điện di agarose loại minigel x 2, máy ly tâm compact x 1, micropipette 1-20ul x 1, hộp nhựa đựng gel dùng xong x 1, hộp nhựa đựng gel chưa/đang dùng x 1, hộp nhựa đựng đầu pipette dơ x Các dụng cụ thiết bị khác phải có là: lị vi sóng, hệ thống chụp ảnh gel, tủ đổ gel, cân điện tử để cân agarose 141 Phòng điện di đọc kết nên tách biệt hay thông với g đặt máy PCR/real-time PCR Phòng pha chế thuốc thử PCR real-time PCR Chỉ có ng thí nghiệm chẩn đốn lớn nên có ng này, ải tách phịng nói Phịng trước vào phải thay áo áo chuyên dùng phòng mà thơi Các thiết bị, hóa chất, dụng cụ để pha để phịng, khơng đem ngồi Nói chung phịng phải tinh Các thiết bị dụng cụ phịng nên có là: Tủ thao tác pha chế thuốc thử, nên clean bench dành cho người có trang bị đèn cực tím đèn chiếu sáng Trong tủ trang bị: vortex x 1, máy ủ nhiệt khô x 1, máy ly tâm 13000 x 1, micropipette 1000ul x 2, micropipette 20-200ul x 2, micropipette 1-20ul x 1, lọ để vật liệu dơ, nhiễm x Tủ thao tác cân chỉnh pH, nên clean bench dành cho hay người có trang bị đèn cực tím đèn chiếu sáng, bên có: cân điện tử x 1, máy đo pH x1, khuấy từ x 1, micropipette 1000ul x 1, micropipette 200ul x 1, micropipette 20ul x1 Tủ thao tác pha hóa chất độc, nên tủ an tòan sinh học lớp bên trang bị cân điện tử x 1, máy đo pH x1, khuấy từ x 1, micropipette 1000ul x 1, micropipette 200ul x 1, micropipette 20ul x 1, pipette aid x Các thiết bị khác, có số lượng tùy qui mô, máy làm đá vảy, máy ly tâm 13,000 x1, máy ly tâm bàn 4000 cho tube 15ml x 1, tủ đông -18 đến -30oC với số lượng tùy vào mẫu nhiều hay ít, tủ mát # 280 lít với số lượng tùy mẫu nhiều hay Dưới minh họa phịng thí nghiệm sinh học phân tử chẩn đoán lớn bao gồm cà PCR/real-time PCR giải trình tự (hình 66, 67) dành cho bệnh viện lớn thành phố Hồ Chí Minh mà chúng tơi gửi thiết kế Ngồi chúng tơi đưa thiết kế phịng thí nghiệm PCR/real-time PCR cho phịng thí nghiệm trung bình (hình 68) 142 Hình 65: Mơ hình tủ thao tác PCR tự đóng Hình 66: Sơ đồ phịng pha chế thuốc thử sinh học phân tử 143 Hình 67: Sơ đồ phòng tách chiết nucleic acid phòng điện di kết hợp phịng giải trình tự 144 Hình : Sơ đồ phịng thí nghiệm PCR real-time PCR dành cho phịng thí nghiệm lâm sàng bệnh viện tuyến thành phố hay tỉnh 145