NGHIÊN cứu CÁC điều KIỆN STRESS môi TRƯỜNG đến KHẢ NĂNG TỔNG hợp EXOPOLYSACCHARIDES CỦA VI KHUẨN lactobacillus plantarum

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Phú Thọ NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN STRESS MÔI TRƯỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG TỔNG HỢP EXOPOLYSACCHARIDES CỦA VI KHUẨN Lactobacillus plantarum LUẬN ÁN TIẾN SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC HÀ NỘI - 2022 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Phú Thọ NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN STRESS MÔI TRƯỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG TỔNG HỢP EXOPOLYSACCHARIDES CỦA VI KHUẨN Lactobacillus plantarum Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 42 02 01 LUẬN ÁN TIẾN SỸ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS Hoàng Quốc Khánh TS Nguyễn Hữu Thanh Hà Nội - 2022 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học độc lập riêng tơi Các số liệu sử dụng phân tích luận án có nguồn gốc rõ ràng, cơng bố theo quy định Các kết nghiên cứu luận án tơi tự tìm hiểu, phân tích cách trung thực, khách quan phù hợp với thực tiễn Việt Nam Các kết chưa công bố nghiên cứu khác Tác giả luận án Nguyễn Phú Thọ LỜI CẢM ƠN Trong suốt thời gian học tập, thực luận án nhận quan tâm, động viên, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi Quý quan, thầy cô, đồng nghiệp, anh chị, bạn bè gia đình Đầu tiên tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến TS Hoàng Quốc Khánh TS Nguyễn Hữu Thanh, người thầy, người hướng dẫn khoa học mà tơi kính trọng ln tận tình bảo hướng dẫn nội dung, phương pháp thực thí nghiệm giúp tơi trưởng thành q trình nghiên cứu để hồn thành luận án Xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc Ban lãnh đạo Viện Sinh học Nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh Phịng đào tạo, Học viện Khoa học Công nghệ Việt Nam tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn tất mơn học suốt q trình học tập Viện Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban lãnh đạo Trường Đại học An Giang, Trung tâm Ứng dụng Tiến Khoa học Công nghệ Cần Thơ hỗ trợ, giúp đỡ thời gian thực hoàn thành luận án Xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến tập thể Quý thầy cô, bạn bè, gia đình ln bên tơi, động viên, chia sẻ khó khan động lực để tơi cố gắng hồn thành luận án Tơi xin cảm ơn đề tài cấp Nhà Nước thuộc Chương trình Khoa học Công nghệ Tây Nam Bộ: “Nghiên cứu xây dựng qui trình sản xuất prebiotic từ vi khuẩn lactic ứng dụng sản xuất thức ăn cho Tôm nhằm hạn chế bệnh hoại tử gan tụy cấp (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease – AHND)” Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh hỗ trợ phần kinh phí cho nghiên cứu luận án Nguyễn Phú Thọ tài trợ Tập đồn Vingroup – Cơng ty CP hỗ trợ Chương trình học bổng thạc sĩ, tiến sĩ nước Quỹ Đổi sáng tạo Vingroup (VINIF), Viện Nghiên cứu Dữ liệu lớn, VINIF.2021.TS.110 Tác giả luận án Nguyễn Phú Thọ mã số MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT iv DANH MỤC BẢNG v DANH MỤC HÌNH vi TÓM TẮT ix ABSTRACT xi MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN .3 1.1 Giới thiệu L plantarum 1.2 Cấu trúc vách tế bào Lactobacillus 1.3 EPS LAB 1.3.1 Phân loại EPS LAB 1.3.2 Thành phần cấu trúc EPS LAB 1.4 Hoạt tính sinh học EPS 14 1.5 Sinh tổng hợp EPS LAB 18 1.6 Di truyền liên quan đến sản xuất EPS Lactobacillus 23 1.7 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp EPS LAB 29 1.8 Phản ứng LAB tác động stress môi trường 30 1.9 Stress môi trường đáp ứng sinh tổng hợp EPS LAB 33 1.9.1 Stress môi trường sản xuất EPS LAB 33 1.9.2 Stress môi trường khả chịu stress LAB 34 1.9.3 Sự thích nghi với stress mơi trường làm tăng khả sống sót LAB 35 1.9.4 Stress môi trường thay đổi thành phần monosaccharide EPS 36 2.9.5 Stress môi trường biểu gen liên quan tổng hợp EPS 37 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1 Đối tượng nghiên cứu 40 2.2 Hóa chất 40 i 2.3 Phương pháp nghiên cứu 40 2.3.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm 40 2.3.2 Các phương pháp phân lập tuyển chọn vi khuẩn L platarum 43 2.3.3 Phương pháp thu nhận EPS 44 2.3.4 Các phương pháp phân tích tính chất EPS thu 44 2.3.5 Phương pháp đếm mật số vi khuẩn tính khả sống sót sau đơng khơ 45 2.3.6 Phương pháp xác định thành phần monosaccharide EPS 45 2.3.7 Phương pháp phân tích biểu gen 46 2.3.8 Phương pháp xử lý số liệu 48 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49 3.1 Phân lập định danh chủng vi khuẩn Lactobacillus 49 3.2 Ảnh hưởng stress môi trường lên khả sinh tổng hợp EPS L plantarum VAL6 53 3.2.1 Stress nhiệt 53 3.2.2 Stress pH 55 3.2.3 Stress NaCl 58 3.2.4 Tăng nồng độ CO2 61 3.2.5 So sánh ảnh hưởng điều kiện stress môi trường khác lên khả sản xuất EPS, hoạt tính sinh học EPS thu 63 3.3 Ảnh hưởng stress môi trường lên thành phần monosaccharide EPS sản xuất L plantarum VAL6 69 3.3.1 Stress nhiệt 69 3.3.2 Stress pH 72 3.3.3 Stress NaCl 74 3.3.4 Tăng nồng độ CO2 75 3.3.5 Đánh giá ảnh hưởng yếu tố môi trường lên thành phần monosaccharide EPS 76 3.4 Ảnh hưởng stress môi trường lên biểu mRNA gen liên quan tổng hợp EPS 78 3.4.1 Stress nhiệt 78 3.4.2 Stress pH 80 ii 3.4.3 Stress NaCl 83 3.4.4 Tăng nồng độ CO2 85 3.4.5 Đánh giá ảnh hưởng yếu tố môi trường lên biểu mRNA gen liên quan tổng hợp EPS 86 3.5 Thảo luận chung 89 3.5.1 Sự hình thành EPS 89 3.5.2 Đáp ứng biểu mRNA gen liên quan tổng hợp EPS 90 3.5.3 Khả hình thành đường thành phần EPS 91 3.5.4 Mối quan hệ biểu gen với suất thành phần monosaccharide EPS 92 3.5.5 Tác động stress môi trường với khả sống sót L plantarum VAL6 93 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 95 NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 97 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ .978 TÀI LIỆU THAM KHẢO .99 PHỤ LỤC 127 iii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT EPS: Exopolysaccharide CIP: Protein cảm ứng lạnh Cs.: Cộng C55-P: Undecaprenyl phosphate DPPH: 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-Diphenyl-1-(2,4,6-trinitrophenyl) hydrazyl GC-FID: Gas Chromatography - Flame Ionization Detection GDA: Glutamate decarboxylase Glu: Glucose; Gal: Galactose; Man: Mannose; Rha: Rhamnose; Ara: Arabinose; Xyl: Xylose; Fru: Fructose GT: glycosyltransferase HoPS: Homopolysaccharide HePS: Heteropolysaccharide HC II: Heparin Cofactor II IS: transasease LAB: Lactic acid bacteria (Vi khuẩn lactic) MRS: Man Rogosa Sharpe PE: Polyetylen PG: Peptidoglycan iv DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 HoPS sản xuất LAB Bảng 1.2 Cấu trúc đơn vị lặp lại EPS số LAB Bảng 1.3 Thành phần monosaccharide EPS số dòng L plantarum 12 Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm ni cấy tăng cường CO2 .42 Bảng 2.2 Các đoạn mồi sử dụng phân tích Real-time qPCR 47 Bảng 3.1 Đặc điểm hình thái, sinh hóa chủng LAB phân lập từ thực phẩm lên men 49 Bảng 3.2 Ảnh hưởng điều kiện stress môi trường khác lên suất EPS, mật số tỷ lệ sống sót sau sấy đơng khơ L plantarum VAL6 64 Bảng 3.3 Mật số vi khuẩn probiotic ni cấy mơi trường MRS khơng đường có bổ sung EPS L plantarum VAL6 68 Bảng 3.4 Thay đổi biểu mRNA gen liên quan tổng hợp EPS tác động thách thức môi trường so với điều kiện không gây stress 89 v DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Vị trí phát sinh lồi L plantarum so với số LAB liên quan khác dựa trình tự 16S rRNA Hình 1.2 Cấu trúc vách tế bào vi khuẩn Gram dương Hình 1.3 Cấu trúc dạng vòng cạnh (pyranose) glucose cạnh (furanose) fructose Hình 1.4 Hoạt tính sinh học EPS sản xuất LAB 15 Hình 1.5 Các chế kháng khuẩn EPS 16 Hình 1.6 Sơ đồ chi tiết sản xuất EPS LAB thông qua việc chuyển đổi đường lactose, galactose glucose tế bào chất 19 Hình 1.7 Cấu tạo nucleotide-đường 20 Hình 1.8 Sơ đồ sinh tổng hợp EPS L lactis NIZO .21 Hình 1.9 Tổng hợp dextran glycosyltransferase (dextran sucrase) 22 Hình 1.10 Sơ đồ tổ chức di truyền cụm gen eps L plantarum 28 Hình 1.11 Sơ đồ tổ chức di truyền cụm gen eps LAB khác .28 Hình 1.12 Stress mơi trường kích thích sản xuất EPS .33 Hình 1.13 Cơ chế điều hịa phiên mã chống lại stress môi trường vi khuẩn 37 Hình 3.1 Hình dạng tế bào chủng vi khuẩn L6 kính hiển vi quang học 49 Hình 3.2 Đặc điểm khuân lạc chủng vi khuẩn L6 50 Hình 3.3 Khả sản xuất EPS chủng LAB phân lập từ thực phẩm lên men 50 Hình 3.4 Kết BLAST SEARCH để phân lồi chủng L6 51 Hình 3.5 Cây phát sinh loài chủng L plantarum VAL6 xây dựng cách so sánh trình tự 16S rRNA 52 Hình 3.6 Sản phẩm khuyếch đại PCR gen recA 52 Hình 3.7 Năng suất EPS sản xuất L plantarum VAL6 điều kiện stress nhiệt 53 Hình 3.8 Sự thay đổi mật số L plantarum VAL6 điều kiện stress nhiệt 54 Hình 3.9 Tỷ lệ sống sót sau đơng khơ L plantarum VAL6 stress nhiệt 55 Hình 3.10 Năng suất EPS sản xuất L plantarum VAL6 điều kiện stress pH 56 Hình 3.11 Sự thay đổi mật số L plantarum VAL6 điều kiện stress pH 57 vi Rhizobium radiobacter SZ4S7S14 as the cell's response to salt stress, International Journal of Biological Macromolecules, 2020, 164, 4339-4347 245 R Tollerson, 2nd, M Ibba, Translational regulation of environmental adaptation in bacteria, Journal of Biological Chemistry, 2020, 295 (30), 10434-10445 246 J Zhang, C.L Poh, Regulating exopolysaccharide gene wcaF allows control of Escherichia coli biofilm formation, Scientific Reports, 2018, (1), 13127-31135 247 M Guchte, P Serror, C Chervaux, T Smokvina, S Ehrlich, E Maguin, Stress response in lactic acid bacteria, Antonie van Leeuwenhoek, 2002, 82, 187-216 248 P Teixeira, H Castro, R Kirby, Evidence of membrane lipid oxidation of spraydried Lactobacillus bulgaricus during storage, Letters in Applied Microbiology, 1996, 22 (1), 34-38 249 A Monteagudo-Mera, R.A Rastall, G.R Gibson, D Charalampopoulos, A Chatzifragkou, Adhesion mechanisms mediated by probiotics and prebiotics and their potential impact on human health, Applied Microbiology and Biotechnology, 2019, 103 (16), 6463-6472 250 F.M Carvalho, R Teixeira-Santos, F.J.M Mergulhao, L.C Gomes, Effect of Lactobacillus plantarum Biofilms on the Adhesion of Escherichia coli to Urinary Tract Devices, Antibiotics, 2021, 10 (8), 966-103 251 L Karygianni, Z Ren, H Koo, T Thurnheer, Biofilm Matrixome: Extracellular Components in Structured Microbial Communities, Trends in Microbiology, 2020, 28 (8), 668-681 126 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Phương trình đường chuẩn Trolox 0,7 0,6 OD 0,5 y = -0,0063x + 0,6541 R² = 0,9616 0,4 0,3 0,2 0,1 0 20 40 60 80 100 120 Nồng độ Trolox (μmol/mL) Phụ lục 2: Phương trình đường chuẩn protein 0.9 0.8 OD (595 nm) 0.7 0.6 0.5 y = 0.0026x + 0.0174 0.4 0.3 R2 = 0.9919 0.2 0.1 0 50 100 150 200 250 300 350 Nồng độ BSA (mg/ml) Phụ lục 3: Xử lý thống kê Phân tích Duncan khả sản xuất EPS chủng LAB phân lập 127 Bảng 1.1 Phân tích Duncan suất EPS chủng LAB phân lập Chủng LAB CK1 CK7 DC2 CC2 N1 L3 RM L5 CC1 L2 CK5 L4 CK6 CK4 DC1 RM1 CK3 L1 L6 Count 3 3 3 3 3 3 3 3 3 Mean 2.36667 2.43667 2.58333 2.72333 2.87333 3.11 3.35667 3.47 3.51667 3.72333 3.81667 4.17667 4.33667 4.39333 4.57 4.98667 5.14667 5.44 5.72333 Homogeneous Groups X X XX XX X X X X XX XX X X XX XX X X X X X Phân tích Duncan ảnh hưởng stress môi trường lên sản xuất EPS L plantarum VAL6 2.1 Ảnh hưởng stress nhiệt Bảng 2.1.1 Ảnh hưởng nhiệt độ gây stress lên sản xuất EPS Nhiệt độ ( oC) Không gây stress 47 42 Count 15 15 15 LS Mean 7.97099 12.0996 12.153 LS Sigma 0.0472878 0.0472878 0.0472878 Homogeneous Groups X X X Bảng 2.1.2 Ảnh hưởng thời gian gây stress nhiệt lên sản xuất EPS Thời gian (giờ) Count 9 9 LS Mean 8.10048 11.1584 11.3731 11.4643 11.6098 LS Sigma 0.0610483 0.0610483 0.0610483 0.0610483 0.0610483 Homogeneous Groups X X X XX X Bảng 2.1.3 Ảnh hưởng nhiệt độ gây stress lên mật số L plantarum VAL6 Nhiệt độ ( oC) 47 42 Không gây stress Count 15 15 15 LS Mean 8.87487 9.06512 9.0959 LS Sigma 0.0157902 0.0157902 0.0157902 Homogeneous Groups X X X Bảng 2.1.4 Ảnh hưởng thời gian gây stress nhiệt lên mật số L plantarum VAL6 Thời gian (giờ) Count 9 9 LS Mean 8.79718 8.97722 9.05549 9.07702 9.15291 LS Sigma 0.0203851 0.0203851 0.0203851 0.0203851 0.0203851 128 Homogeneous Groups X X X X X Bảng 2.1.5 Sự sống sót sau đơng khơ L plantarum VAL6 sau gây stress nhiệt độ khác Nhiệt độ ( oC) Không gây stress 42 47 Count 15 15 15 LS Mean 0.01 4.86467 6.87533 LS Sigma 0.124823 0.124823 0.124823 Homogeneous Groups X X X Bảng 2.1.6 Sự sống sót sau đơng khơ L plantarum VAL6 sau stress nhiệt thời gian khác Thời gian (giờ) Count 9 9 LS Mean 0.01 3.22667 5.17444 5.34556 5.82667 LS Sigma 0.161146 0.161146 0.161146 0.161146 0.161146 Homogeneous Groups X X X X X 2.2 Ảnh hưởng stress pH Bảng 2.2.1 Ảnh hưởng pH gây stress lên sản xuất EPS pH Không gây stress pH pH Count 15 15 15 LS Mean 7.97099 13.8746 39.4751 LS Sigma 0.217267 0.217267 0.217267 Homogeneous Groups X X X Bảng 2.2.2 Ảnh hưởng thời gian gây stress pH lên sản xuất EPS Thời gian (giờ) Count 9 9 LS Mean 7.92187 22.4564 23.1401 23.6762 25.0067 LS Sigma 0.280491 0.280491 0.280491 0.280491 0.280491 Homogeneous Groups X X XX X X Bảng 2.2.3 Ảnh hưởng pH gây stress lên mật số L plantarum VAL6 pH pH pH Không gây stress Count 15 15 15 LS Mean 6.58949 8.64848 8.89998 LS Sigma 0.0216903 0.0216903 0.0216903 Homogeneous Groups X X X Bảng 2.2.4 Ảnh hưởng thời gian gây stress pH lên mật số L plantarum VAL6 Thời gian (giờ) Count 9 9 LS Mean 7.05166 7.75981 8.03605 8.32515 9.05724 LS Sigma 0.028002 0.028002 0.028002 0.028002 0.028002 Homogeneous Groups X X X X X Bảng 2.2.5 Sự sống sót sau đông khô L plantarum VAL6 sau gây stress pH khác pH Không gây stress pH pH Count 15 LS Mean 0.0133333 LS Sigma 0.64195 15 15 15.996 22.172 0.64195 0.64195 129 Homogeneous Groups X X X Bảng 2.2.6 Sự sống sót sau đông khô L plantarum VAL6 sau stress pH thời gian khác Thời gian (giờ) Count 9 9 LS Mean 0.01 10.1678 17.5778 17.8422 18.0378 LS Sigma 0.828754 0.828754 0.828754 0.828754 0.828754 Homogeneous Groups X X X X X 2.3 Ảnh hưởng stress NaCl Bảng 2.3.1 Ảnh hưởng stress NaCl lên sản xuất EPS Xử lý Không gây stress NaCl Count 15 15 LS Mean 7.97099 9.40572 LS Sigma 0.0743079 0.0743079 Homogeneous Groups X X Bảng 2.3.2 Ảnh hưởng thời gian gây stress NaCl lên sản xuất EPS Thời gian (giờ) Count 6 6 LS Mean 7.96943 8.77033 8.82667 8.89467 8.98067 LS Sigma 0.117491 0.117491 0.117491 0.117491 0.117491 Homogeneous Groups X X X X X Bảng 2.3.3 Ảnh hưởng gây stress NaCl đến mật số L plantarum VAL6 Xử lý NaCl Không gây stress Count 15 15 LS Mean 9.04551 9.06523 LS Sigma 0.01169 0.01169 Homogeneous Groups X X Bảng 2.3.4 Ảnh hưởng thời gian gây stress NaCl đến mật số L plantarum VAL6 Thời gian (giờ) Count 6 6 LS Mean 9.01397 9.04612 9.06474 9.06905 9.08298 LS Sigma 0.0184834 0.0184834 0.0184834 0.0184834 0.0184834 Homogeneous Groups X XX XX XX X Bảng 2.3.5 Sự sống sót sau đông khô L plantarum VAL6 sau gây stress NaCl Xử lý Không gây stress NaCl Count 15 15 LS Mean 0.01 4.63879 LS Sigma 0.0393055 0.0393055 Homogeneous Groups X X Bảng 2.3.6 Sự sống sót sau đông khô L plantarum VAL6 sau stress NaCl thời gian khác Thời gian (giờ) Count 6 6 LS Mean 0.0105336 2.67193 2.90042 2.99347 3.04564 130 LS Sigma 0.0621475 0.0621475 0.0621475 0.0621475 0.0621475 Homogeneous Groups X X X X X 2.4 Ảnh hưởng sự tăng nồng độ CO2 Bảng 2.4.1 Ảnh hưởng tăng nồng độ CO2 lên sản xuất EPS Thời gian (giờ) Không gây stress 24 Count 3 3 Mean 8.0049 14.8519 16.7849 17.3192 Homogeneous Groups X X X X Bảng 2.4.2 Ảnh hưởng tăng nồng độ CO2 lên mật số L plantarum VAL6 Thời gian (giờ) Không gây stress 24 Count 3 3 Mean 9.0342 9.24561 9.3763 9.39868 Homogeneous Groups X X X X Bảng 2.4.3 Sự sống sót sau đơng khơ L plantarum VAL6 sau nuôi cấy điều kiện tăng nồng độ CO2 Thời gian (giờ) Không gây stress 24 Count 3 3 Mean 0.114023 11.5702 18.4756 25.188 Homogeneous Groups X X X X 2.5 So sánh ảnh hưởng điều kiện stress môi trường khác lên L plantarum VAL6 Bảng 2.5.1 Ảnh hưởng điều kiện stress môi trường khác lên sản xuất EPS Xử lý Không gây stress NaCl 42 oC 47 oC pH CO2 pH Count 3 3 3 Mean 8.07533 9.92 13.2693 13.4847 16.5016 17.3192 50.4431 Homogeneous Groups X X X X X X X Bảng 2.5.2 Ảnh hưởng điều kiện stress môi trường khác lên mật số L plantarum VAL6 Xử lý pH 47 oC pH NaCl 42 oC Không gây stress CO2 Count 3 3 3 Mean 6.2357 9.00636 9.04147 9.06259 9.07358 9.08652 9.39868 131 Homogeneous Groups X X X X X X X Bảng 2.5.3 Sự sống sót sau đông khô L plantarum VAL6 sau gây stress điều kiện khác Xử lý Không gây stress NaCl 42 oC 47 oC pH CO2 pH Count 3 3 3 Mean 0.019208 5.79084 6.67194 8.83984 22.7863 25.188 30.7213 Homogeneous Groups X X XX X X X X Bảng 2.5.4 Khả bắt gốc tự DPPH loại EPS sản xuất L plantarum VAL6 điều kiện stress môi trường khác Loại EPS EPS42 EPSn EPSpH8 EPSNaCl EPS47 EPSCO2 EPSpH3 Count 3 3 3 Mean 7.93879 8.37105 10.1019 10.2592 10.3057 12.7757 14.0079 Homogeneous Groups X X X X X X X Bảng 2.5.5 Hàm lượng protein EPS sản xuất L plantarum VAL6 điều kiện stress môi trường khác Loại EPS EPSn EPS42 EPS47 EPSpH8 EPSNaCl EPSCO2 EPSpH3 Count 3 3 3 Mean 3.50409 4.33739 4.57388 4.64361 4.71224 6.59919 6.71054 Homogeneous Groups X X XX X X X X 2.6 Khả kích thích vi khuẩn probiotic EPS sản xuất L plantarum VAL6 điều kiện stress mơi trường khác Bảng 2.6.1 Khả kích thích vi khuẩn L acidophilus EPS sản xuất L plantarum VAL6 điều kiện stress môi trường khác Loại EPS EPSCO2 EPSpH8 EPSNaCl EPSn EPS42 Đối chứng EPSpH3 EPS47 Count 3 3 3 3 Mean 8.06121 8.06159 8.07384 8.09696 8.1257 8.14048 8.14505 8.19478 132 Homogeneous Groups X X X X XX XX XX X Bảng 2.6.2 Khả kích thích vi khuẩn L plantarum EPS sản xuất L plantarum VAL6 điều kiện stress môi trường khác Loại EPS EPS47 EPSNaCl EPSpH3 Đối chứng EPSpH8 EPSn EPS42 EPSCO2 Count 3 3 3 3 Mean 8.08862 8.09907 8.10489 8.1332 8.1396 8.17044 8.1731 8.23906 Homogeneous Groups X X X XX XX X X X Bảng 2.6.3 Khả kích thích vi khuẩn B longum EPS sản xuất L plantarum VAL6 điều kiện stress môi trường khác Loại EPS EPSpH8 EPSNaCl EPS42 EPSn EPSpH3 Đối chứng EPS47 EPSCO2 Count 3 3 3 3 Mean 8.03808 8.04912 8.06571 8.08396 8.11504 8.1332 8.14539 8.25762 Homogeneous Groups X X X XX XX X X X Phân tích Duncan ảnh hưởng stress môi trường lên thành phần monosaccharide EPS sản xuất L plantarum VAL6 3.1 Ảnh hưởng stress nhiệt Bảng 3.1.1 Ảnh hưởng stress nhiệt lên hàm lượng mannose EPS Nhiệt độ xử lý, oC 47 42 Không gây stress Count 15 15 15 LS Mean 68.4173 76.6467 83.4453 LS Sigma 1.26837 1.26837 1.26837 Homogeneous Groups X X X Bảng 3.1.2 Ảnh hưởng stress nhiệt lên hàm lượng glucose EPS Nhiệt độ xử lý, oC Không gây stress 42 47 Count 15 15 15 LS Mean 14.0133 17.5747 19.3413 LS Sigma 0.529219 0.529219 0.529219 Homogeneous Groups X X X Bảng 3.1.3 Ảnh hưởng stress nhiệt lên hàm lượng galactose EPS Nhiệt độ xử lý, oC Không gây stress 47 42 Count 15 15 15 LS Mean 1.15267 2.35533 2.97667 LS Sigma 0.246349 0.246349 0.246349 Homogeneous Groups X X X Bảng 3.1.4 Ảnh hưởng stress nhiệt lên hàm lượng rhamnose EPS Nhiệt độ xử lý, oC 42 Không gây stress 47 Count 15 15 15 LS Mean 0.388667 0.704133 3.14867 LS Sigma 0.392061 0.392061 0.392061 133 Homogeneous Groups X X X Bảng 3.1.5 Ảnh hưởng stress nhiệt lên hàm lượng xylose EPS Nhiệt độ xử lý, oC Không gây stress 42 47 Count 15 15 15 LS Mean 0.68548 1.57133 1.88267 LS Sigma 0.313 0.313 0.313 Homogeneous Groups X XX X 3.2 Ảnh hưởng stress pH Bảng 3.2.1 Ảnh hưởng stress pH lên hàm lượng mannose EPS pH Không gây stress Count 15 15 15 LS Mean 75.4693 79.0067 83.4453 LS Sigma 0.691227 0.691227 0.691227 Homogeneous Groups X X X Bảng 3.2.2 Ảnh hưởng stress pH lên hàm lượng glucose EPS pH Không gây stress Count 15 15 15 LS Mean 13.9107 14.0133 17.0353 LS Sigma 0.293597 0.293597 0.293597 Homogeneous Groups X X X Bảng 3.2.3 Ảnh hưởng stress pH lên hàm lượng galactose EPS pH Không gây stress Count 15 15 LS Mean 1.13867 1.15267 LS Sigma 0.282336 0.282336 15 5.346 0.282336 Homogeneous Groups X X X 3.3 Ảnh hưởng stress NaCl Bảng 3.3.1 Ảnh hưởng stress NaCl lên hàm lượng mannose EPS Xử lý NaCl Không gây stress Count 15 15 LS Mean 82.432 83.4453 LS Sigma 0.238508 0.238508 Homogeneous Groups X X Bảng 3.3.2 Ảnh hưởng stress NaCl lên hàm lượng glucose EPS Xử lý NaCl Không xử lý Count 15 15 LS Mean 13.86 14.0133 LS Sigma 0.113384 0.113384 Homogeneous Groups X X Bảng 3.3.3 Ảnh hưởng stress NaCl lên hàm lượng galactose EPS Xử lý Không gây stress NaCl Count 15 LS Mean 1.15267 LS Sigma 0.101423 15 2.566 0.101423 Homogeneous Groups X X Bảng 3.3.4 Ảnh hưởng stress NaCl lên hàm lượng rhamnose EPS Xử lý Không gây stress NaCl Count 15 LS Mean 0.704133 LS Sigma 0.0140222 15 0.848667 0.0140222 134 Homogeneous Groups X X 3.4 Ảnh hưởng sự tăng nồng độ CO2 Bảng 3.4.1 Ảnh hưởng tăng nồng độ CO2 lên hàm lượng mannose EPS Xử lý CO2 (giờ) 24 Đối chứng Count 3 3 Mean 71.9767 75.1333 76.3133 83.4567 Homogeneous Groups X X X X Bảng 3.4.2 Ảnh hưởng tăng nồng độ CO2 lên hàm lượng glucose EPS Xử lý CO2 (giờ) Đối chứng 24 Count 3 3 Mean 13.95 16.38 16.5 23.41 Homogeneous Groups X X X X Bảng 3.4.3 Ảnh hưởng tăng nồng độ CO2 lên hàm lượng galactose EPS Xử lý CO2 (giờ) Đối chứng 24 Count 3 3 Mean 1.38 2.0 2.06667 2.3 Homogeneous Groups X X X X Bảng 3.4.4 Ảnh hưởng tăng nồng độ CO2 lên hàm lượng rhamnose EPS Xử lý CO2 (giờ) Đối chứng 24 Count 3 3 Mean 0.7 2.53667 5.1 6.29667 Homogeneous Groups X X X X Phân tích Duncan ảnh hưởng stress môi trường lên sự biểu gen liên quan tổng hợp EPS L plantarum VAL6 4.1 Ảnh hưởng stress nhiệt Bảng 4.1.1 Ảnh hưởng nhiệt độ gây stress lên biểu gen glmU Xử lý Không gây stress 42 oC 47 oC Count 15 LS Mean 0.98404 LS Sigma 0.0305305 Homogeneous Groups X 15 15 1.00916 1.03487 0.0305305 0.0305305 X X Bảng 4.1.2 Ảnh hưởng thời gian stress nhiệt lên biểu gen glmU Thời gian (giờ) Count 9 9 LS Mean 0.978057 0.991816 1.00375 1.02804 1.04513 LS Sigma 0.0394147 0.0394147 0.0394147 0.0394147 0.0394147 135 Homogeneous Groups X X X X X Bảng 4.1.3 Ảnh hưởng nhiệt độ gây stress lên biểu gen pgmB1 Xử lý 42 oC Không gây stress 47 oC Count 15 15 LS Mean 0.998226 1.00221 LS Sigma 0.0335944 0.0335944 Homogeneous Groups X X 15 1.11067 0.0335944 X Bảng 4.1.4 Ảnh hưởng thời gian stress nhiệt lên biểu gen pgmB1 Thời gian (giờ) Count 9 9 LS Mean 1.00898 1.01483 1.02992 1.05631 1.07515 LS Sigma 0.0433701 0.0433701 0.0433701 0.0433701 0.0433701 Homogeneous Groups X X X X X Bảng 4.1.5 Ảnh hưởng nhiệt độ gây stress lên biểu gen cps4E Xử lý Không gây stress 42 oC 47 oC Xu ly Count 15 LS Mean 1.01893 LS Sigma 1.7974 15 15 6.05245 18.8797 1.7974 1.7974 Homogeneous Groups X X X Bảng 4.1.6 Ảnh hưởng thời gian stress nhiệt lên biểu gen cps4E Thời gian (giờ) Count 9 9 LS Mean 1.00324 1.55457 9.80616 13.3869 17.5009 LS Sigma 2.32043 2.32043 2.32043 2.32043 2.32043 Homogeneous Groups X X X XX X Bảng 4.1.7 Ảnh hưởng nhiệt độ gây stress lên biểu gen cps4F Xử lý Không gây stress 42 oC 47 oC Count 15 15 15 LS Mean 1.00942 10.8918 16.313 LS Sigma 1.67557 1.67557 1.67557 Homogeneous Groups X X X Bảng 4.1.8 Ảnh hưởng thời gian stress nhiệt lên biểu gen cps4E Thời gian (giờ) Count 9 9 LS Mean 1.01099 1.82196 8.8285 14.8409 20.5213 LS Sigma 2.16315 2.16315 2.16315 2.16315 2.16315 Homogeneous Groups X X X XX X Bảng 4.1.9 Ảnh hưởng nhiệt độ gây stress lên biểu gen cps4J Xử lý Không gây stress 42 oC 47 oC Count 15 15 15 LS Mean 1.02796 8.16981 10.4208 LS Sigma 1.02377 1.02377 1.02377 Homogeneous Groups X X X Bảng 4.1.10 Ảnh hưởng thời gian stress nhiệt lên biểu gen cps4J Thời gian (giờ) Count 9 9 LS Mean 1.00463 2.27021 5.8204 11.0805 12.5219 LS Sigma 1.32168 1.32168 1.32168 1.32168 1.32168 136 Homogeneous Groups X XX X X X Bảng 4.1.11 Ảnh hưởng nhiệt độ gây stress lên biểu gen cps4H Xử lý 47 oC Không gây stress 42 oC Count 15 15 15 LS Mean 1.00431 1.03203 1.03589 LS Sigma 0.0250358 0.0250358 0.0250358 Homogeneous Groups X X X Bảng 4.1.12 Ảnh hưởng thời gian stress nhiệt lên biểu gen cps4H Thời gian (giờ) Count 9 9 LS Mean 0.990091 1.00246 1.02726 1.03433 1.06623 LS Sigma 0.0323211 0.0323211 0.0323211 0.0323211 0.0323211 Homogeneous Groups X X X X X 4.2 Ảnh hưởng stress pH Bảng 4.2.1 Ảnh hưởng pH gây stress lên biểu gen glmU Xử lý pH Không gây stress pH Count 15 15 15 LS Mean 0.981679 1.02458 1.03669 LS Sigma 0.0248151 0.0248151 0.0248151 Homogeneous Groups X X X Bảng 4.2.2 Ảnh hưởng thời gian stress pH lên biểu gen glmU Thời gian (giờ) Count 9 9 LS Mean 1.0009 1.0009 1.00591 1.01599 1.04789 LS Sigma 0.0320362 0.0320362 0.0320362 0.0320362 0.0320362 Homogeneous Groups X X X X X Bảng 4.2.3 Ảnh hưởng pH gây stress lên biểu gen pgmB1 Xử lý pH pH Không gây stress Count 15 15 15 LS Mean 0.809848 0.963282 1.01408 LS Sigma 0.0192156 0.0192156 0.0192156 Homogeneous Groups X X X Bảng 4.2.4 Ảnh hưởng thời gian stress pH lên biểu gen pgmB1 Thời gian (giờ) Count 9 9 LS Mean 0.871767 0.874518 0.926345 0.96466 1.00807 LS Sigma 0.0248072 0.0248072 0.0248072 0.0248072 0.0248072 Homogeneous Groups X X XX XX X Bảng 4.2.5 Ảnh hưởng pH gây stress lên biểu gen cps4E Xử lý pH Không gây stress pH Count 15 15 15 LS Mean 0.902592 1.03978 2.95007 LS Sigma 0.0452186 0.0452186 0.0452186 Homogeneous Groups X X X Bảng 4.2.6 Ảnh hưởng thời gian stress pH lên biểu gen cps4E Thời gian (giờ) Count 9 9 LS Mean 1.00068 1.74069 1.76759 1.77853 1.8666 LS Sigma 0.0583769 0.0583769 0.0583769 0.0583769 0.0583769 137 Homogeneous Groups X X X X X Bảng 4.2.7 Ảnh hưởng pH gây stress lên biểu gen cps4F Xừ lý Không gây stress pH pH Count 15 LS Mean 1.01755 LS Sigma 0.0316732 Homogeneous Groups X 15 15 1.04862 2.41135 0.0316732 0.0316732 X X Bảng 4.2.8 Ảnh hưởng thời gian stress pH lên biểu gen cps4E Thời gian (giờ) Count 9 9 LS Mean 1.00144 1.38155 1.60198 1.69281 1.78476 LS Sigma 0.0408899 0.0408899 0.0408899 0.0408899 0.0408899 Homogeneous Groups X X X XX X Bảng 4.2.9 Ảnh hưởng pH gây stress lên biểu gen cps4J Xử lý pH Không gây stress pH Count 15 15 15 LS Mean 0.953106 1.02761 1.0558 LS Sigma 0.0258386 0.0258386 0.0258386 Homogeneous Groups X XX X Bảng 4.2.10 Ảnh hưởng thời gian stress pH lên biểu gen cps4J Thời gian (giờ) Count 9 9 LS Mean 0.975955 1.00034 1.00679 1.01732 1.06046 LS Sigma 0.0333575 0.0333575 0.0333575 0.0333575 0.0333575 Homogeneous Groups X X X X X Bảng 4.2.11 Ảnh hưởng pH gây stress lên biểu gen cps4H Xừ lý pH Không gây stress pH Count 15 15 15 LS Mean 0.931317 1.04202 3.30459 LS Sigma 0.043065 0.043065 0.043065 Homogeneous Groups X X X Bảng 4.2.12 Ảnh hưởng thời gian stress pH lên biểu gen cps4H Thời gian (giờ) Count 9 9 LS Mean 1.00582 1.84554 1.93943 1.9957 2.01006 LS Sigma 0.0555966 0.0555966 0.0555966 0.0555966 0.0555966 Homogeneous Groups X X X X X 4.3 Ảnh hưởng stress NaCl Bảng 4.3.1 Ảnh hưởng NaCl lên biểu gen glmU Xử lý NaCl Không gây stress Count 15 15 LS Mean 0.698061 1.02438 LS Sigma 0.0229045 0.0229045 Homogeneous Groups X X Bảng 4.3.2 Ảnh hưởng thời gian stress NaCl lên biểu gen glmU Thời gian (giờ) Count 6 6 LS Mean 0.737247 0.761834 0.879274 0.922202 1.00556 138 LS Sigma 0.0362153 0.0362153 0.0362153 0.0362153 0.0362153 Homogeneous Groups X X X XX X Bảng 4.3.3 Ảnh hưởng NaCl lên biểu gen pgmB1 Xử lý NaCl Không gây stress Count 15 15 LS Mean 0.798268 1.02428 LS Sigma 0.0217129 0.0217129 Homogeneous Groups X X Bảng 4.3.4 Ảnh hưởng thời gian stress NaCl lên biểu gen pgmB1 Thời gian (giờ) Count 6 6 LS Mean 0.810415 0.823111 0.886269 1.00492 1.03165 LS Sigma 0.0343311 0.0343311 0.0343311 0.0343311 0.0343311 Homogeneous Groups X X X X X Bảng 4.3.5 Ảnh hưởng NaCl lên biểu gen cps4E Xử lý Count Không gây stress 15 NaCl 15 LS Mean 1.0265 1.10127 LS Sigma 0.0259663 0.0259663 Homogeneous Groups X X Bảng 4.3.6 Ảnh hưởng thời gian stress NaCl lên biểu gen cps4E Thời gian (giờ) Count 6 6 LS Mean 1.00888 1.04191 1.05307 1.05829 1.15727 LS Sigma 0.0410563 0.0410563 0.0410563 0.0410563 0.0410563 Homogeneous Groups X XX XX XX X Bảng 4.3.7 Ảnh hưởng NaCl lên biểu gen cps4F Xử lý Không gây stress NaCl Count 15 LS Mean 1.01911 LS Sigma 0.0186305 Homogeneous Groups X 15 1.06181 0.0186305 X Bảng 4.3.8 Ảnh hưởng thời gian stress NaCl lên biểu gen cps4E Thời gian (giờ) Count 6 6 LS Mean 1.00147 1.00908 1.01776 1.04078 1.13322 LS Sigma 0.0294574 0.0294574 0.0294574 0.0294574 0.0294574 Homogeneous Groups X X X X X Bảng 4.3.9 Ảnh hưởng NaCl lên biểu gen cps4J Xử lý NaCl Không gây stress Count 15 15 LS Mean 0.68223 1.01943 LS Sigma 0.018509 0.018509 Homogeneous Groups X X Bảng 4.3.10 Ảnh hưởng thời gian stress NaCl lên biểu gen cps4J Thời gian (giờ) Count 6 6 LS Mean 0.67012 0.788749 0.823339 0.967737 1.0042 LS Sigma 0.0292653 0.0292653 0.0292653 0.0292653 0.0292653 139 Homogeneous Groups X X X X X Bảng 4.3.11 Ảnh hưởng NaCl lên biểu gen cps4H Xử lý NaCl Không gây stress Count 15 15 LS Mean 0.772223 1.02476 LS Sigma 0.0251163 0.0251163 Homogeneous Groups X X Bảng 4.3.12 Ảnh hưởng thời gian stress NaCl lên biểu gen cps4H Thời gian (giờ) Count 6 6 LS Mean 0.773343 0.796611 0.885296 1.00567 1.03154 LS Sigma 0.0397123 0.0397123 0.0397123 0.0397123 0.0397123 Homogeneous Groups X X X X X 4.4 Ảnh hưởng sự tăng nồng độ CO2 Bảng 4.4.1 Ảnh hưởng tăng nồng độ CO2 lên biểu gen glmU Xử lý Đối chứng giờ 24 Count 3 3 Mean 1.00663 1.24166 1.48182 1.9303 Homogeneous Groups X XX X X Bảng 4.4.2 Ảnh hưởng tăng nồng độ CO2 lên biểu gen pgmB1 Xử lý Đối chứng giờ 24 Count 3 3 Mean 1.00135 1.32839 1.98419 3.00043 Homogeneous Groups X X X X Bảng 4.4.3 Ảnh hưởng tăng nồng độ CO2 lên biểu gen cps4E Xử lý Đối chứng giờ 24 Count 3 3 Mean 1.00355 1.10818 1.49894 1.81314 Homogeneous Groups X X X X Bảng 4.4.4 Ảnh hưởng tăng nồng độ CO2 lên biểu gen cps4F Xử lý Đối chứng giờ 24 Count 3 3 Mean 1.00737 1.14053 1.25079 1.45782 Homogeneous Groups X X XX X Bảng 4.4.5 Ảnh hưởng tăng nồng độ CO2 lên biểu gen cps4J Xử lý Đối chứng giờ 24 Count 3 3 Mean 1.00021 1.13131 1.14519 1.75234 Homogeneous Groups X X X X Bảng 4.4.6 Ảnh hưởng tăng nồng độ CO2 lên biểu gen cps4H Xử lý Đối chứng giờ 24 Count 3 3 Mean 1.00026 1.03908 1.56589 2.56026 140 Homogeneous Groups X X X X ... ĐÀO TẠO VI? ??N HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VI? ??T NAM HỌC VI? ??N KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - Nguyễn Phú Thọ NGHIÊN CỨU CÁC ĐIỀU KIỆN STRESS MÔI TRƯỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG TỔNG HỢP EXOPOLYSACCHARIDES. .. 94 viii TÓM TẮT Luận án ? ?Nghiên cứu điều kiện stress môi trường đến khả tổng hợp exopolysaccharides vi khuẩn Lactobacillus plantarum? ?? thực nhằm mục đích xác định điều kiện stress thích... tác động điều kiện stress môi trường, nghiên cứu xác định xác định điều kiện stress thích hợp kích thích khả sinh tổng hợp mạnh EPS L plantarum Năng suất EPS cao (50,44 g/L) thu điều kiện stress