NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG NGUỒN GEN DI TRUYỀN QUẦN THỂ THÔNG LÁ DẸT (Pinus krempfii Lecomte) Ở TÂY NGUYÊN – LOÀI ĐẶC HỮU CỦA VIỆT NAM”

1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT TRẦN THỊ LIỄU “NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG NGUỒN GEN DI TRUYỀN QUẦN THỂ THÔNG LÁ DẸT (Pinus krempfii Lecomte) Ở TÂY NGUYÊN – LOÀI ĐẶC HỮU CỦA VIỆT NAM” LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC HÀ NỘI - NĂM 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT TRẦN THỊ LIỄU Đề tài : “NGHIÊN CỨU ĐA DẠNG NGUỒN GEN DI TRUYỀN QUẦN THỂ THÔNG LÁ DẸT (Pinus krempfii Lecomte) Ở TÂY NGUYÊN – LOÀI ĐẶC HỮU CỦA VIỆT NAM” Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn: PGS TS Đinh Thị Phòng Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam TSGS TS Lê Xuân HÀ NỘI, NĂM 2014 MỞ ĐẦU Tây Nguyên vùng giàu loài kim Việt Nam Hầu hết loài kim Tây Nguyên lồi có giá trị khoa học kinh tế cao Nhiều loài đứng trước nguy bị đe dọa tuyệt chủng, có lồi Thơng dẹt (Pinus krempfii Lecomte) hay cịn gọi Thơng hai dẹt, Thơng Sri, Thơng Sré, lồi đặc hữu hẹp Việt Nam [4] Đây nguồn gen quý độc đáo với hình dải mác khơng hình kim lồi Thơng khác [32], [33] Gỗ Thơng dẹt mềm, nhựa, màu từ trắng đến vàng nhạt, nhẹ, có nhiều đặc tính kỹ thuật tốt Hiện rừng Thông dẹt bị đe dọa nghiêm trọng tình trạng phá rừng làm nương rẫy, nhiều bị môi trường sinh sống tối ưu nên chết rụi, số già tự đổ gãy dẫn đến suy giảm số lượng loài nghiêm trọng Tái sinh tự nhiên hạn chế giai đoạn mầm, lại gặp chủ yếu nơi có khoảng trống, ven đường Mặt khác lại thiếu vắng tái sinh tuổi trung gian, nên khó đủ sức thay cánh rừng Thơng dẹt cổ thụ tồn [5], [6] Theo Quỹ Bảo tồn Thiên nhiên quốc tế (IUCN) 2013 Thông dẹt xếp vào bậc bị tuyệt chủng VU A2c, B1ab (iii) [65] Vì vậy, việc bảo tồn hiệu nguồn gen Thông dẹt nhiệm vụ cấp bách đặt cho nhà nghiên cứu Tuy nhiên, nghiên cứu trước tập trung vào việc phân loại dựa đặc điểm hình thái nơi phân bố, nghiên cứu đa dạng di truyền nguồn gen hạn chế tập trung cho số loài [7], [8], [46] Đặc biệt dẫn liệu đa dạng nguồn gen di truyền, trình tự nucleotide đặc trưng cho lồi Thông dẹt chưa nghiên cứu Với phát triển mạnh mẽ công nghệ sinh học đại, nhiều loại thị phân tử sử dụng để đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen làm sở cho nghiên cứu bảo tồn tái tạo nguồn gen đối tượng sinh vật nói chung lồi kim nói riêng [7], [10], [29], [34], [56], [68] Trong loại thị thị ISSR (Internal Sequence Simple Repeat) SSR (Sequence Simple Repeat) ứng dụng rộng rãi có hiệu việc đánh giá đa dạng di truyền mức độ quần thể loài Hơn nữa, phân tích phân tử nhận dạng vùng gen đặc trưng sử dụng rộng rãi giới Việt Nam để đánh giá mơ hình đa dạng di truyền thực vật kỹ thuật có lợi tiềm cho việc điều tra thực vật quý Vì đến có số cơng trình nghiên cứu cơng bố hiệu cao phân tích phân tử nghiên cứu đa dạng di truyền xác định trình tự nucletide vùng gen đặc trưng cho số loài kim Việt Nam [2], [3], [7] Điển hình cơng bố Vũ Đình Duy cộng (2010) việc sử dụng thị ISSR SSR đánh giá đa dạng di truyền loài kim Pơ mu (Fokienia hodginsii), Sa mộc dầu (Cunninghamia lanceolata var konishii), Hoàng đàn hữu liên (Cupressus tonkinesis) Thủy tùng (Glytostrobus pensilis) giải mã trình tự vùng gen 18S hai loài Pơ mu Sa mộc dầu có mức độ suy giảm cao loài Thủy tùng Hoàng đàn hữu liên Kết giải mã trình tự vùng gen 18S cịn cho phép giải vấn đề tồn taxon Sa mộc dầu (Cunninghamia lanceolata var konishii) Tương tự, Đinh Thị Phòng cộng (2009), Vũ Thi Thu Hiền cộng (2009) sử dụng thị thị RAPD, ISSR cpSSR để nghiên cứu mối quan hệ di truyền loài Pơ mu, Bách xanh phục vụ cho cho công tác bảo tồn Hiện ngân hàng Genbank (2014) lưu giữ 884.000 trình tự nucleotide cho loài kim (conifers), tập trung vào hai vùng gen nhân (ITS) vùng gen lục lạp (cpDNA), làm sở cho xác định trình tự nucleotide đặc trưng cho lồi Thơng dẹt Xuất phát từ sở khoa học đây, tiến hành đề tài “Nghiên cứu đa dạng nguồn gen di truyền quần thể Thông dẹt tự nhiên (Pinus krempfii Lecomte) Tây Nguyên - loài đặc hữu Việt Nam” với mục tiêu nội dung nghiên cứu sau: - Xác định mức độ đa dạng nguồn gen di truyền cho quần thể Thông dẹt tự nhiên thu tỉnh Tây Nguyên thị SSR ISSR - Xác định trình tự nucleotide đặc trưng vùng gen (2 vùng gen lục lạp vùng gen nhân) cho loài Thông dẹt Tây Nguyên 5 CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu tổng quát loài Thơng dẹt 1.1.1 Vị trí phân loại Thơng dẹt (Pinus krempfii Lecomte) cịn gọi Thơng hai dẹt hay Thơng Sri, Thơng Sré, lồi đặc hữu Việt Nam, phân bố tỉnh Khánh Hòa, Lâm Đồng, Đắc Lắc Ninh Thuận Theo phân loại khoa học, Thông dẹt thuộc: Giới (regnum): Plantae Ngành (phylum): Pinophyta Lớp (class): Pinopsida Bộ (order): Pinales Họ (familia): Pinaceae Chi (genus): Pinus 1.1.2 Một số đặc điểm sinh học giá trị bảo tồn lồi Thơng dẹt Theo đánh giá nhà khoa học ngồi nước, Thơng dẹt lồi cổ sinh vật hoi cịn sót lại ngày nay, với chiều cao lên đến 30 m, đường kính đạt 1,5 - 1,6 m, tới m [47] Tán thường rộng, dày, sẫm màu có hình rẻ quạt Đoạn thân cành lớn, khơng có cành nhánh, trịn mọc thẳng lên (Hình 1.1) Nón xuất vào tháng - tồn thời gian dài Hạt chín vào tháng 7- 10, màu nâu nhạt có cánh trắng Khi chín, hạt phát tán phạm vi tương đối rộng Cây mầm thường có khoảng 10 - 13 mầm có hình xoắn cong hướng lưỡi liềm, dài khoảng - cm, sau đến nhỏ mọc quanh thân, dài 1,5 - 2,5 cm Khi non, dài rộng (dài 10 - 15 cm) xếp hai lưỡi kéo phần đầu cành Khi trưởng thành, nhỏ ngắn lại (dài - cm), màu sẫm, mọc tập trung đầu cành, làm cho tán thông già trở nên dày sẫm màu Đặc điểm đặc trưng hình dải mác nhọn đầu, dẹt [32], [33] 6 B A C Hình 1.1 Hình ảnh Thơng dẹt Lâm Đồng (A: trưởng thành; B: nón quả; C: tái sinh) (ảnh Nguyễn Tiến Hiệp) Gỗ Thông dẹt mềm, nhựa, màu từ trắng đến vàng nhạt, nhẹ, có nhiều đặc tính kỹ thuật tốt sử dụng công nghiệp xây dựng Theo IUCN (2013), Thông dẹt đánh giá mức bị tuyệt chủng (VU A2c B1ab (iii) Hiện nay, rừng Thông dẹt bị đe dọa nghiêm trọng tình trạng phá rừng làm nương rẫy, nhiều bị môi trường sinh sống tối ưu nên chết rụi, số già tự đổ gãy Tái sinh tự nhiên hạn chế giai đoạn mầm, lại gặp chủ yếu nơi có khoảng trống, ven đường Mặt khác lại thiếu vắng tái sinh tuổi trung gian, nên khó đủ sức thay cánh rừng Thông dẹt cổ thụ tồn [5], [6] 1.1.3 Tình hình phân bố Thông dẹt Tây Nguyên Phân bố nước: Loài đặc hữu hẹp tiểu vùng địa lý thực vật Nam Trường Sơn, phân bố chủ yếu tỉnh Lâm Đồng số vùng giáp ranh thuộc tỉnh lân cận Đắc Lắc, Khánh Hòa Ninh Thuận 7 Phân bố giới: không gặp nơi giới ngồi Việt Nam Thơng dẹt thường mọc độ cao từ 1000 đến 2000 m so với mực nước biển, khu rừng khép tán thường xanh, xen với họ Đậu họ Long não Loài thường mọc đỉnh sườn núi nơi có lớp đất ẩm tầng mùn dày [4], [36] Căn vào dẫn liệu thu thập qua khảo sát, nghiên cứu điểm rừng nguyên sinh hầu khắp nước ta đối chiếu với tiêu chuẩn thứ hạng Danh lục đỏ IUCN, đầu thấy vài tiêu chuẩn loài chưa đến mức bị đe dọa tuyệt chủng (sự suy giảm quần thể khứ, nhiều < 30%, EOO < 5.000 km2, AOO < 500 km2, số lượng tiểu quần thể ≤ 10, hầu hết tiểu quần thể nằm Khu bảo tồn thiên nhiên, Khu du lịch sinh thái hay vùng núi xa xôi chưa bị lâm tặc vào chặt trộm) Tuy nhiên khoảng năm gần hai tiểu quần thể quan trọng thuộc VQG Bi Đúp - Núi Bà gồm gỗ to lớn dọc đường giao thông xây dựng từ Khánh Hòa lên Đà Lạt qua VQG Bi Đúp - Núi Bà đường giao thông xây dựng Đông Trường Sơn (từ Đà Lạt Quảng Nam) xuất nguy bị lâm tặc chặt hạ vận xuất nên thời điểm việc xếp loài vào thứ hạng nguy cấp VU A2a,c,d, A3a,c,d, B2a,c, C1 hợp lý [4] 1.2 Đa dạng di truyền quần thể thực vật 1.2.1 Khái niệm quần thể thực vật Quần thể định nghĩa tập hợp nhóm cá thể loài nơi sống cụ thể, chúng độc lập với quần thể khác quan hệ sinh sản [1] Di truyền quần thể truyền từ hệ sang hệ khác, bị ảnh hưởng yếu tố kích thước quần thể, sức sinh sản, khả sống sót, phương phức sinh sản, trao đổi đột biến di truyền Kích thước quần thể kết tương tác phức tạp liên quan đến điều kiện môi trường sống đặc tính quần thể lồi Kích thước quần thể đóng vai trị quan trọng liên quan đến phương thức sinh sản, di truyền tiến hoá Nguồn gốc tiến hoá thường liên quan đến cá thể lai (thế hệ tiếp theo) quần thể loài Thụ phấn chéo sản sinh cá thể lai đa dạng Cấu trúc di truyền cá thể đóng góp vào tính đa dạng quần thể trì khả thích nghi cao quần thể nhiều môi trường sống Tác động người đến môi trường sống thường dẫn đến phá vỡ cấu trúc quần thể hình thành quần thể nhỏ, cô lập dẫn đến làm suy giảm khả thích nghi quần thể với mơi trường sống Trong quần thể, hệ sau sản sinh thụ phấn cận noãn dẫn đến khác biệt di truyền quần thể lớn làm tăng tần số gen đồng hợp tử quần thể nhỏ 1.2.2 Tính đa dạng di truyền quần thể thực vật Đa dạng sinh học thường đề cập đến mức độ khác dạng sống bao gồm cá thể động vật, thực vật, vi sinh vật biểu từ mức độ phân tử đến hệ sinh thái Công ước quốc tế Đa dạng sinh học (1994) xác định đa dạng sinh học bao gồm cấp: (i) đa dạng loài (đa dạng di truyền hay đa dạng nguồn gen), (ii) đa dạng loài (đa dạng thành phần loài hay đa dạng loài) (iii) đa dạng hệ sinh thái Đa dạng sinh học kết q trình tiến hố tự nhiên trải qua hàng triệu năm, bao gồm mức độ hệ sinh thái, lồi di truyền Lý thuyết tiến hố sở chọn lọc tự nhiên Darwin dự đoán đa dạng di truyền thành phần đa dạng sinh học Đa dạng di truyền hay gọi đa dạng gen (đa dạng DNA), tập hợp biến đổi gen kiểu gen nội loài Đây đa dạng quan trọng nhất, định lồi tồn lâu dài tự nhiên hay không Tính đa dạng này, nguồn cung cấp vật liệu cho chương trình chọn tạo cải tiến giống [1] Đa dạng di truyền cho phép cá thể loài xử lý trước biến đổi bất lợi môi trường sống có khả tự phục hồi mơi trường sống chúng Như vậy, đa dạng di truyền đề cập đến mức độ đa hình cá thể suốt thời gian sống nó, phản ánh số alen quần thể vị trí địa lý khoảng thời gian cụ thể số alen loài phạm vi phân bố địa lý lịch sử tồn 1.2.3 Một số kỹ thuật sinh học phân tử nghiên cứu đa dạng di truyền thực vật a) Kỹ thuật isozyme Kỹ thuật isozyme kỹ thuật nghiên cứu đa hình enzyme Phương pháp Hunter Market đưa từ năm 1957, sau Harris hồn thiện vào năm 1966 bắt đầu sử dụng phổ biến từ thập niên 70 đến Mặc dù có nhiều kỹ thuật phân tử phát triển kỹ thuật isozyme sử dụng cách thức thực tương đối nhanh, chi phí thấp, thích hợp cho nghiên cứu xác định mức độ biến đổi di truyền cấp độ thấp Ngoài việc kết hợp kỹ thuật isozyme với kỹ thuật nghiên cứu đa hình DNA cho phép phân tích, so sánh đặc tính bền vững (hoặc thay đổi) theo điều kiện khác môi trường [9] b) Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Kỹ thuật RAPD hai nhóm nghiên cứu Welsh Clelland (1991) Williams cộng (1990) đồng thời xây dựng [70], [71] Kỹ thuật dựa ứng dụng kỹ thuật PCR sử dụng mồi đơn có trình tự ngẫu nhiên gồm khoảng 10 nucleotide Số lượng đoạn DNA nhân phụ thuộc vào độ dài vị trí đoạn mồi, kích thước cấu trúc DNA genome Sự đa hình kỹ thuật RAPD nói chung đột biến vị trí gắn mồi làm ngăn trở đến việc bắt cặp mồi Kết sau điện di sản phẩm RAPD – PCR phát khác phổ phân đoạn DNA nhân Sự khác gọi tính đa hình chiều dài sản phẩm PCR Kỹ thuật RAPD thao tác nhanh, đơn giản, giá thành thấp, dễ thực không cần biết trước trình tự gen đối tượng cần nghiên cứu, sử dụng lượng nhỏ DNA khuôn, chất lượng DNA khuôn không cần độ tinh cao Tuy nhiên thị RAPD thị trội kiểu gen lặn quy định tính trạng khó phát đa hình điện di sản phẩm [13], [72] Kỹ thuật RAPD có độ xác không ổn định (thể mức độ lặp lại giống thấp) [9], [10] c) Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Đây kỹ thuật dựa tính đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn, Botstein cộng (1980) xây dựng vào năm 1980 để lập đồ di truyền người [15] Kỹ thuật dựa đặc điểm enzyme giới hạn khác nhau, tạo nên 10 đoạn cắt DNA khác phân biệt điện di đồ Số lượng đoạn phụ thuộc vào số điểm nhận biết enzyme giới hạn hệ gen, đoạn cắt gọi “dấu vân tay” đặc trưng cho phân tử DNA DNA mẫu nghiên cứu sau tách chiết tinh cắt với số loại enzyme giới hạn Tính đa hình độ dài phát nhờ đánh dấu phóng xạ mẫu dị DNA bổ sung tạo từ locus Chỉ thị RFLP thường ứng dụng số lĩnh vực như: nghiên cứu đa dạng genome, xây dựng đồ di truyền, xác định mức độ liên kết với tính trạng nơng sinh học, xác định lai F1 lai hữu tính lai tế bào trần, khả có chứa gen bất dục tế bào chất, bất dục đực nhân mẫn cảm với nhiệt độ ánh sáng, tìm dãy alen tự bất hợp, gen phục hồi gen trì Tuy nhiên kỹ thuật có nhược điểm quy trình phức tạp, cồng kềnh, tốn sử dụng chất đồng vị phóng xạ gây nguy hiểm cho người thao tác thí nghiệm d) Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) Kỹ thuật AFLP hiểu đa dạng đoạn DNA nhân lên có định hướng sau bị cắt enzyme giới hạn Nguyên tắc kỹ thuật tương tự kỹ thuật RAPD mồi sử dụng bao gồm phần cố định dài (5bp) chứa vị trí nhận biết enzyme giới hạn phần thay đổi ngắn (2-4bp) Phần cố định dài tạo ổn định sản phẩm nhân lên, phần thay đổi ngắn tạo nhiều locus, lên đến 100 locus nhân lên với mồi AFLP đơn AFLP phát khác đoạn DNA nhân có chọn lọc trình tự DNA hệ gene cắt (bởi enzyme giới hạn) gắn với đoạn tiếp hợp (adapter) Phương pháp cho phép sàng lọc đồng thời số lượng lớn thị khơng có nghĩa Sự đa hình xác định có mặt khơng có mặt phân đoạn DNA Phương pháp AFLP kết hợp ưu điểm RFLP RAPD nên có hiệu phát phân tích đa hình cách nhanh chóng, ổn định đáng tin cậy Tuy nhiên chi phí u cầu chun mơn kỹ thuật để thực phân tích AFLP cao nên phương pháp sử dụng để nghiên cứu phân loại học phân tử mà chủ yếu sử dụng việc thiết lập đồ di truyền tính trạng số lượng [72]