NGHIÊN CỨU HIỆU QUẢ DỰ PHÒNG CỦA IGY KHÁNG UREASE CỦA VI KHUẨN HELICOBACTER PYLORI TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG

TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC CẦN THƠ – SỐ 22-23-24-25/2019 NGHIÊN CỨU HIỆU QUẢ DỰ PHÒNG CỦA IGY KHÁNG UREASE CỦA VI KHUẨN HELICOBACTER PYLORI TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG Đỗ Hoàng Long Trường Đại học Y Dược Cần Thơ Email: dhlong@ctump.edu.vn TÓM TẮT Đặt vấn đề: Ức chế enzyme urease kháng thể đặc hiệu theo đường uống hướng nghiên cứu điều trị dự phòng nhiễm Helicobacter pylori Mục tiêu: Nghiên cứu tiến hành nhằm khảo sát tác dụng dự phòng nhiễm H pylori IgY kháng urease H pylori chuột nhắt trắng Đối tượng phương pháp nghiên cứu: Chuột điều trị dự phịng thức ăn có khơng có chứa IgY kháng urease H pylori tuần trước cho uống H pylori liên tục kết thúc thí nghiệm Chín tuần sau bắt đầu điều trị, chuột xác định nồng độ kháng thể IgG kháng H pylori huyết thanh, tình trạng viêm nhiễm H pylori mảnh sinh thiết dày Kết quả: Có khác biệt có ý nghĩa thống kê hiệu giá kháng thể IgG, tiệt trừ H pylori giảm tình trạng viêm dày liên quan H pylori hai nhóm chuột nhóm nhiễm H pylori Kết luận: Miễn dịch thụ động đường uống với IgY kháng đặc hiệu urease H pylori dự phòng thâm nhiễm vi khuẩn H pylori chuột thực nghiệm Từ khóa: H pylori; IgY kháng urease; miễn dịch thụ động đường uống; tác dụng dự phòng ABSTRACT STUDY OF THE PREVENTIVE EFFECT OF ANTI-UREASE IGY ON HELICOBACTER PYLORI INFECTION IN WHITE MICE Do Hoang Long Can Tho University of Medicine and Pharmacy Background: Urease inhibition with oral specific antibody is a new approach in prevention and treatment of Helicobacter pylori infection Objectives: This research aimed to investigate the preventive effect of anti-urease IgY on H pylori infection in experimental animal Materials and methods: White mice were prophylactic treated by having food with or without anti-urease IgY a week before H pylori inoculation and continuously till end of the monitoring time Nine weeks after the start of the diet, the mice were examined to determine the reactivity of anti-H pylori IgG in serum and the inflammation and infection status of the stomach biopsy Results: There were significant differences in the anti-H pylori IgG titer, the eradication of H pylori and the reduction of H pylori-associated gastritis between the two groups of infected mice Conclusion: Oral administration of urease-specific IgY prevented H pylori colonization in the inocculated mice Keywords: Helicobacter pylori; Anti-urease IgY; Oral passive immunization; Preventive effect I ĐẶT VẤN ĐỀ Helicobacter pylori nguyên nhân gây viêm loét dày - tá tràng thường gặp Việt Nam giới chiếm tỉ lệ 75 – 95%, enzyme urease H pylori tiết yếu tố định sống vi khuẩn tạo thuận lợi cho chúng công vào niêm mạc dày [3] Điều trị viêm loét dày - tá tràng nhiễm H pylori phức tạp áp dụng nhiều phác đồ khả thất bại điều trị lớn tình trạng vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh ngày tăng, đặc biệt nước chậm phát triển phát triển [4], [5] Gà có khả sinh kháng thể đặc hiệu với mầm bệnh tương tự động vật có vú, kháng thể đặc hiệu từ máu gà mái chuyển qua tích tụ lịng đỏ trứng mà chúng đẻ ra, lớp kháng thể có lòng đỏ trứng gọi kháng thể IgY (yolk immunoglobulin) quy trình sản xuất IgY đặc hiệu kháng nguyên tiến hành [1], [2] IgY sử dụng theo đường uống liệu pháp miễn dịch thụ động để dự phòng điều trị số bệnh TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC CẦN THƠ – SỐ 22-23-24-25/2019 tiêu chảy súc vật người Với hy vọng phương pháp miễn dịch trị liệu thụ động sử dụng kháng thể kháng urease H pylori có tác dụng ngăn ngừa nhiễm H pylori ức chế gây tổn thương chúng niêm mạc dày, tiến hành nghiên cứu với mục tiêu đánh giá hiệu ức chế H pylori động vật thực nghiệm chế phẩm IgY kháng urease H pylori II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Động vật thí nghiệm: Chuột nhắt trắng dùng để nghiên cứu khả dự phòng nhiễm H pylori chế phẩm IgY kháng urease: 28 chuột nhắt trắng đực, dòng Swiss, cân nặng từ 18 - 20g, khoẻ mạnh Ban Chăn ni động vật thí nghiệm, Phịng trang bị Vật tư kỹ thuật, Học viện Quân y cung cấp 2.1.2 Vật liệu nghiên cứu: - chủng vi khuẩn H pylori (HP13, HP16, HP18) phân lập từ mẫu sinh thiết niêm mạc dày bệnh nhân viêm loét dày tá tràng Bệnh viện 103 - Kháng thể IgY kháng enzyme urease chủng vi khuẩn H pylori (HP13, HP16, HP18) tách chiết tinh chế Bộ môn Miễn dịch, Học viện Quân y Phòng Protein - Độc chất - Tế bào, Trung tâm nghiên cứu ứng dụng Sinh Y Dược học, Học viện Quân y 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Chuẩn bị thức ăn chứa IgY kháng urease H pylori: Thức ăn chứa IgY kháng urease chuẩn bị cách tẩm dung dịch protein lòng đỏ trứng gà chứa IgY kháng urease vào thức ăn chăn nuôi công nghiệp dạng sợi ống giàu dinh dưỡng hấp tiệt trùng làm khô với tỷ lệ 4mg IgY/gam thức ăn theo phương pháp ước lượng nồng độ IgY lòng đỏ trứng Nomura 2.2.2 Phân nhóm chuột tiến hành nghiên cứu hiệu dự phịng: Chuột nhắt trắng chia nhóm: nhóm (5 con/nhóm), khơng gây nhiễm H pylori, nhóm cho ăn thức ăn thường nhóm có bổ sung IgY kháng urease vào thức ăn; nhóm (nhóm chứng) nhóm (nhóm bệnh), nhóm con, có gây nhiễm, nhóm cho ăn thức ăn thường nhóm có bổ sung IgY kháng urease vào thức ăn Một tuần sau tính từ lúc cho ăn thức ăn có IgY kháng urease H pylori (tuần 1), chuột nhóm bệnh có ăn thức ăn có IgY kháng urease H pylori không cho ăn đêm sáng hôm sau gây nhiễm H pylori cách dùng bơm tiêm cải tiến để bơm vi khuẩn vào dày với liều 108 CFU/ml (15 ml/kg cân nặng chuột) Các nhóm chuột tiếp tục cho ăn thức ăn có bổ sung IgY kháng urease khơng Đến tuần 9, kết thúc thí nghiệm lấy máu chuột xác định hiệu giá kháng thể kháng H pylori; mổ chuột lấy dày xét nghiệm giải phẫu bệnh để đánh giá mức độ viêm niêm mạc dày có mặt H pylori niêm mạc dày chuột III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Diễn biến hoạt động chuột q trình làm thí nghiệm Chuột nhóm hoạt động nhanh nhẹn ăn uống bình thường từ tuần đến tuần 9, trừ chuột nhóm hoạt động ngày sau gây nhiễm H pylori kèm theo bỏ ăn xù lơng Riêng chuột nhóm có giảm cân sau gây nhiễm tuần kết thúc thí nghiệm 3.2 Ảnh hưởng việc ăn thức ăn bổ sung IgY kháng urease lên cân nặng chuột - Với nhóm chuột khơng gây nhiễm H pylori, cân nặng trung bình chuột nhóm nhóm có tăng từ 16,8 16,4g thời điểm bắt đầu thực nghiệm đến 18,2g thời điểm kết thúc thực nghiệm theo thứ tự Không có khác biệt có ý nghĩa thống kê nhóm TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC CẦN THƠ – SỐ 22-23-24-25/2019 chuột Không ghi nhận ảnh hưởng việc ăn thức ăn bổ sung IgY kháng urease lên cân nặng chuột - Với nhóm chuột gây nhiễm H pylori, cân nặng trung bình chuột nhóm (nhóm chuột khơng dự phịng) giảm từ 17,5g thời điểm bắt đầu thực nghiệm đến 17,4g thời điểm kết thúc thí nghiệm (giảm 0,1g) Trong đó, cân nặng trung bình chuột nhóm (nhóm chuột dự phịng IgY kháng urease H pylori) thay đổi từ 17,3g thời điểm bắt đầu thực nghiệm đến 19,1g thời điểm kết thúc thí nghiệm (tăng 1,7g) Mặc dù khơng có khác biệt có ý nghĩa thống kê nhóm chuột (nhóm nhóm 4) tăng cân nhóm cho thấy ảnh hưởng dự phòng IgY kháng urease vi khuẩn H pylori nhóm chuột gây nhiễm việc tăng cân chuột Như vậy, nhóm chuột ăn thức ăn có IgY kháng urease H pylori nhóm chứng nhóm nhiễm có tăng cân nhiều hơn, điều giải thích IgY chất protein tăng cường thêm dinh dưỡng để giúp chuột phát triển tốt Nhưng điểm đặc biệt cần nhấn mạnh qua kết thu sơ chứng minh tính khơng gây dị ứng kháng thể gà sử dụng chuột Qua phần khẳng định tính khơng độc chế phẩm IgY kháng urease H pylori tính an tồn chế phẩm sử dụng đường uống Thêm vào đó, cân nặng chuột nhóm nhiễm có dự phịng IgY kháng urease H pylori tăng biểu rõ hiệu ức chế vi khuẩn H pylori chế phẩm IgY kháng urease H pylori (1) (2) Biểu đồ Diễn biến cân nặng trung bình chuột: (1) nhóm khơng gây nhiễm (2) nhóm gây nhiễm 3.3 Xét nghiệm kháng thể kháng H pylori máu chuột gây nhiễm vi khuẩn Kháng thể kháng H pylori sinh toàn máu chuột (100%) nhóm khơng dự phịng (nhóm 3) nhóm chuột có dự phịng (nhóm 4) IgY kháng urease H pylori đạt 66,6% kháng thể kháng H pylori Thêm vào đó, hoạt độ kháng thể kháng H pylori máu chuột gây nhiễm H pylori có dự phịng IgY kháng urease H pylori thấp so với nhóm chuột khơng dự phòng (p = 0,003) 3.4 Kết đánh giá mức độ viêm niêm mạc dày chuột Tỷ lệ dày bị viêm nhóm chuột gây nhiễm H pylori khơng dự phịng ăn thức ăn chứa IgY kháng urease cao (100%) tỷ lệ dày bị viêm nhóm chuột gây nhiễm H pylori có dự phịng ăn thức ăn chứa IgY kháng urease đạt 77,7% Mức độ viêm dạy dày chuột gây nhiễm H pylori khơng dự phịng IgY kháng urease H pylori cao so với nhóm chuột dự phịng (p = 0,004) 3.5 Kết đánh giá mật độ vi khuẩn niêm mạc dày chuột Chuột khơng gây nhiễm (nhóm 2) khơng có diện vi khuẩn H pylori, toàn chuột gây nhiễm H pylori khơng dự phịng ăn thức ăn chứa IgY kháng urease (nhóm 3) có H pylori diện niêm mạc dày (100%) Riêng nhóm chuột có dự phòng ăn thức ăn chứa IgY kháng urease (nhóm 4) mật độ vi khuẩn (44,4%) Mật độ H pylori niêm mạc dạy dày chuột gây nhiễm H pylori khơng dự TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC CẦN THƠ – SỐ 22-23-24-25/2019 phòng IgY kháng urease H pylori cao so với nhóm chuột dự phịng (p  0,0001) (3) (4) Biểu đồ Dạ dày chuột gây nhiễm: (3) mức độ viêm (4) mật độ vi khuẩn H pylori (1) (2) Hình Tổn thương mô học dày chuột N3-C1: (1) nhuộm H&E (2) nhuộm Giemsa Khi so sánh tác dụng dự phịng IgY kháng urease H pylori kết phù hợp với nghiên cứu Nomura cộng Thứ nhất, tồn chuột nhóm nêu giảm kháng thể kháng H pylori huyết tiệt trừ H pylori mơ bệnh học dày nhóm chuột gây nhiễm chưa đạt hiệu 100% Thứ hai, có 55,6% chuột nhóm tiệt trừ H pylori (HP-) thấp Nomura cộng (100%), số HP (-) nghiên cứu chúng tơi có 40% cho kết viêm dày âm tính, điều phản ánh phần khả tiệt trừ H pylori hay tác dụng dự phòng chế phẩm IgY kháng urease H pylori giúp bảo vệ dày chuột chống lại công thâm nhiễm H pylori, nghĩa loại bỏ tác nhân gây viêm dày Vai trò dự phòng IgY kháng urease H pylori chuột nhóm biểu qua giảm có ý nghĩa thống kê vi khuẩn H pylori niêm mạc dày (p < 0.0001) Thêm vào đó, tình trạng viêm dày chuột nhóm giảm tỉ lệ thuận theo giảm H pylori niêm mạc dày cách có ý nghĩa thống kê (p = 0.004) Nhìn chung, tỉ lệ nhiễm H pylori nhóm chiếm cao nhất, tương đương với kháng thể kháng H pylori huyết cao mức độ viêm dày cao nhóm Điều giúp nhận định IgY kháng urease H pylori góp phần làm giảm nhẹ viêm dày H pylori làm yếu phần tác động urease dày thông qua việc ức chế urease H pylori, từ làm yếu tố sinh tồn H pylori làm cho chúng giảm gây tổn thương viêm niêm mạc dày chuột dễ bị tiệt trừ IgY kháng urease H pylori sử dụng cho chuột nhắt trắng trước gây nhiễm vi khuẩn H pylori với mong muốn đánh giá tác dụng dự phòng nhiễm vi khuẩn động vật thực nghiệm Qua nghiên cứu nhận thấy tỉ lệ nhiễm H pylori thấp hơn, mức độ viêm dày nhẹ chuột tăng cân nhiều nhóm chuột sử dụng IgY kháng urease H pylori chế phẩm chứng minh tính khơng độc tính an tồn sử dụng đường uống Như vậy, IgY kháng urease H pylori có tác dụng dự phịng nhiễm vi khuẩn H pylori IV KẾT LUẬN TẠP CHÍ Y DƯỢC HỌC CẦN THƠ – SỐ 22-23-24-25/2019 Đã gây nhiễm thành cơng H pylori qua đường tiêu hóa cho chuột nhắt trắng dòng Swiss với liều 108 CFU/ml/chuột Tỷ lệ chuột nhiễm H pylori đạt 100% qua khảo sát xét nghiệm ELISA tìm kháng thể kháng H pylori máu vi khuẩn H pylori niêm mạc dày chuột gây nhiễm Ăn thức ăn tẩm IgY kháng urease liều 4mg IgY/gam thức ăn trước gây nhiễm tuần liên tục sau gây nhiễm thấy có tác dụng dự phịng động vật thực nghiệm thông qua tiêu hạn chế giảm cân, giảm hoạt độ kháng thể kháng H pylori máu, giảm viêm giảm mật độ vi khuẩn H pylori tiêu giải phẫu bệnh lý TÀI LIỆU THAM KHẢO Đỗ Minh Trung, Hồng Trung Kiên, Lê Văn Đơng (2010) Nghiên cứu tách chiết, tinh kháng thể IgY từ lịng đỏ trứng gà Tạp chí Thơng tin y dược, Chuyên đề Miễn dịch học, 77-81 Ko K.Y., Ahn D.U (2007) Preparation of immunoglobulin Y from egg yolk using ammonium sulfate precipitation and ion exchange chromatography Poultry Science, 86(2):400-407 Kusters J.G., van Vliet A.H.M., Kuipers E.J (2006) Pathogenesis of Helicobacter pylori infection Clinical Microbiology Reviews, 19(3):449-490 Miwa H., Ghoshal U.C., Gonlachanvit S., et al (2012) Asian Consensus report on Functional dyspepsia Journal of Neurogastroenterology and Motility, 18(2):150 - 168 Nomura S., Suzuki H., Masaoka T., et al (2005) Effect of dietary anti-urease immunoglobulin Y on Helicobacter pylori infection in Mongolian gerbils Helicobacter, 10(1):43-52 WHO Geneva (2009) Proposal for the inclusion of a proton pump inhibitor for the treatment of dyspepsia in the WHO model list of essential medicines 17th Expert Committee on the selection and use of essential medicines, 1-31 (Ngày nhận bài: 20/9/2019 - Ngày duyệt đăng: 04/11/2019)