Luận văn thạc sĩ VNU UET tổng hợp các hạt nano từ tính với các lớp kháng thể trên bề mặt ứng dụng trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm

TỔNG QUAN

Tổng quan về hạt nano từ

Bất cứ vật liệu từ nào cũng có sự hưởng ứng với từ trường bên ngoài H thể hiện bằng độ từ hóa (từ độ –M) Tỷ số χ = M/H đƣợc gọi là độ cảm từ Tùy thuộc vào giá trị độ cảm từ có thể phân ra làm các loại vật liệu từ khác nhau

Vật liệu có χ < 0 (~ –10 –6 ) đƣợc gọi là vật liệu nghịch từ Vật liệu có χ > 0 (~ –10 –6 ) đƣợc gọi là vật liệu thuận từ Vật liệu có χ > 0 với giá trị rất lớn có thể là vật liệu sắt từ

[9] Ngoài độ cảm từ, một số thông số khác cũng rất quan trọng trong việc xác định tính chất vật liệu ví dụ như từ độ bão hòa (từ độ đạt cực đại tại từ trường lớn), từ dư (từ độ còn dư sau khi ngừng tác động của từ trường ngoài), lực kháng từ (từ trường ngoài cần thiết để một hệ sau khi đạt trạng thái bão hòa từ, bị khử từ) Khi kích thước của hạt giảm đến một giá trị nào đó, thông thường đến vài chục nanomét, tính sắt từ biến mất, chuyển động nhiệt thắng thế làm cho vật liệu trở thành vật liệu siêu thuận từ Đối với vật liệu siêu thuận từ, thì từ dƣ và lực kháng từ bằng không Đây là một đặc điểm rất quan trọng cho vật liệu từ cho các ứng dụng y sinh học Hạt nano từ trong sinh học cần phải thỏa mãn ba điều kiện sau: tính đồng nhất của các hạt cao, độ bão hòa từ lớn và vật liệu có tính tương hợp sinh học (không có độc tính) [22]

Tính đồng nhất về kích thước của hạt nano liên quan đến phương pháp chế tạo, còn độ bão hòa từ và tính tương hợp sinh học liên quan đến bản chất của vật liệu

Trong tự nhiên, sắt (Fe) là vật liệu có độ bão hòa từ lớn nhất tại nhiệt độ phòng và tính ổn định trong môi trường không khí nên vật liệu oxit sắt được nghiên cứu rất nhiều làm hạt nano từ tính

1.1.2 Tính chất của hạt nano oxit sắt từ 1.1.2.1 Tính chất vật liệu nano

Vật liệu nano từ có tính chất đặc biệt là do kích thước của nó có thể so sánh được với kích thước tới hạn vật liệu mà tại đó các tính chất vật lý, hóa học của các vật liệu hoàn toàn bị thay đổi [30] Một vài tính chất đặc trƣng của vật liệu nano từ:

- Độ cứng rất cao: các nhà nghiên cứu cho rằng độ cứng tăng lên là do hai yếu tố:

+ Do hiệu ứng kích thước nano hạn chế sự lan truyền của các sai lệch mạng trong vật liệu (làm cho vật liệu bị yếu đi)

+ Do hiệu ứng giam hãm lƣợng làm tăng độ cứng riêng của các hạt tinh thể

- Diện tích bề mặt lớn nhờ kích thước ở mức độ nano

- Tính siêu thuận từ hoặc tính thuận từ tùy vào kích thước của vật liệu nano

Hạt nano từ tính đƣợc chế tạo từ nhiều loại nguyên liệu khác nhau, từ đơn chất kim loại (Co, Ni, Fe ) đến hợp kim (Pt/Fe, Co-Sm ) Nó đƣợc ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau Với kích thước ở mức độ nano mét (thường nhỏ hơn 10 nm) các hạt nano từ có thể đƣợc xem nhƣ chỉ chức một vùng từ (đô-men), nên với nhiệt độ dưới nhiệt độ Curie thì dao động nhiệt cũng đủ năng lượng để phá vỡ mô-men từ mạng lưới Tính chất này giống như vật liệu thuận từ, chỉ khác nhau là trong vật liệu thuận từ (paramagnetism) thì những momen từ riêng lẻ là của từng nguyên tử, còn trong vật liệu siêu thuận từ (superparamagnetism) là của từng đô-men nên đƣợc gọi là vật liệu siêu thuận từ Hai đặc trƣng cơ bản của các chất siêu thuận từ là:

- Đường cong từ hóa không bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ

- Không có hiện tƣợng từ trễ, có nghĩa là lực kháng từ bằng 0

Hình 1.1 Đường cong từ hóa của vật liệu siêu thuận từ

Hầu hết các hạt nano từ tính ứng dụng trong y sinh học đều đƣợc chế tạo từ nguyên liệu sắt hoặc các loại oxit sắt do tính tương thích sinh học và hoàn toàn vô hại đối với cơ thể khi sử dụng ở hàm lƣợng thấp Trong đó, những loại hạt oxit sắt từ hoặc nano từ có cấu trúc Fe/FexOy đƣợc dùng rộng rãi nhất nhờ vào tính trơ của lớp oxit có thể bảo vệ hạt tránh các tác nhân ăn mòn Bên cạnh đó, lớp hydroxit (–OH) bên ngoài có đƣợc do phản ứng của các ion Fe n+ (n = 2,3) bề mặt hạt với các phân tử H2O xung quanh giúp hạt có thể dễ dàng thực hiện các phản ứng gắn kết với các hoạt chất sinh học (protein, DNA, RNA ) một cách trực tiếp hoặc gián tiếp

Một nguyên nhân quan trọng khác, đó là tỷ lệ giữa diện tích bề mặt và thể tích (S/V) rất lớn của các hạt nano Chính nhờ ƣu thế này mà hạt nano trở thành một công cụ hiệu quả sử dụng để trích ly các hợp chất sinh học có hàm lƣợng thấp đến rất thấp với hiệu suất cao.

Tính siêu thuận từ của oxit sắt từ Fe 3 O 4

Khi giảm kích thước của các hạt oxit sắt từ Fe3O4 thì chúng sẽ là những hạt đơn đômen, vì với kích thước đó nhỏ hơn rất nhiều độ rộng của vách đômen nên không đủ thời gian để các vách đômen có thể hình thành trong hạt Ngay cả trong trường hợp vật liệu có tính dị hướng vuông góc rất lớn, có thể thiết lập các vách đômen có độ dày cỡ vài nano mét thì việc hình thành các đômen nhƣ vậy sẽ tốn năng lƣợng rất lớn Khi đó năng lƣợng dao động nhiệt không đủ mạnh để thắng lực liên kết giữa các phân tử kề nhau nhưng đủ mạnh để thay đổi hướng của mômen từ trong toàn bộ tinh thể Kết quả là có một sự sắp xếp ngẫu nhiên hướng mômen từ trong tinh thể khi không có từ trường ngoài Do đó mômen từ trong toàn tinh thể bằng không

Hiện tượng này làm hạn chế khả năng ghi lại môi trường từ của những hạt từ nhỏ bởi vì siêu thuận từ sẽ làm cho hạt từ mất đi bộ nhớ từ Điều đó có nghĩa là khi có sự tác động của từ trường ngoài thì các mômen từ nhanh chóng sắp xếp theo chiều của từ trường và tồn tại một độ từ hóa riêng [19] Khi từ trường ngoài ngừng tác động, các mômen từ của hạt lại sắp xếp và định hướng ngẫu nhiên như lúc đầu, vật liệu sẽ không còn từ tính nữa (Hình 1.2) Khi đó độ từ hóa và lực kháng từ bằng 0

Khi không có từ trường Khi có từ trường

Hình 1.2 Sự định hướng của các hạt siêu thuận từ

Bảng 1.2 Một số giá trị lực kháng từ ở một số vật liệu từ tiêu biểu [7]:

Vật liệu Lực kháng từ (Oe)

Supermalloy Fe15,7Ni79Mo5Mn0,3 0,002

Ni1-xZnxFeO3, ferrite từ mềm siêu cao tần 15-200

Alnico (nam châm phổ biến) 1500-2000

Co-Pt-Cr màng mỏng từ cứng sử dụng trong ổ đĩa cứng 1700

NdFeB (nam châm đất hiếm mạnh nhất) 10000

Chất lỏng từ

Chất lỏng từ là một khái niệm chỉ một dung dịch bao gồm các hạt có từ tính lơ lửng trong một chất lỏng mang [32], [28] Chất lỏng từ gồm ba thành phần chính là: hạt từ tính (chất rắn), chất bao phủ về mặt (còn gọi là chất hoạt hóa bề mặt, là chất rắn hoặc chất lỏng) và dung môi (là môi trường chứa hạt từ và chất bao phủ bề mặt)

Trong các thành phần trên thì hạt từ tính là thành phần quan trọng nhất trong chất lỏng từ, tính chất đặc biệt của chất lỏng từ phụ thuộc chủ yếu vào tính chất của hạt từ

Các hạt từ tính là có thể là sắt từ hoặc siêu thuận từ Hạt từ tính thường được dùng nhất là hạt oxit sắt γ-Fe2O3 (maghemite), Fe3O4 (magnetite)

Hình 1.3 Hình dạng chất lỏng từ

Chất hoạt hóa bề mặt có tác dụng làm cho hạt nano phân tán trong dung môi, tránh các hạt kết tụ lại với nhau ngay cả khi có mặt của từ trường Chất hoạt hóa bề mặt còn có tác dụng che phủ hạt nano khỏi sự phát hiện của hệ thống bảo vệ cơ thể (hệ miễn dịch) và dễ dàng tạo mối liên kết hóa học với các phân tử khác

Nếu từ tính của chất lỏng từ do hạt từ quyết định thì tính lỏng của nó do dung môi quyết định Dung môi có thể là các chất phân cực như nước, cồn… hoặc các chất không phân cực nhƣ dầu, dung môi hữu cơ Dung môi có thể có độ nhớt rất khác nhau hoặc có khả năng bay hơi dưới điều kiện bình thường cũng khác nhau Tùy thuộc vào các ứng dụng cụ thể mà người ta dùng dung môi thích hợp Các ứng dụng sinh hóa thường dùng dung môi là nước vì nước có tính tương hợp sinh học

1.3.2 Đặc trƣng của chất lỏng từ

Chất lỏng từ là một môi trường đa thành phần (gồm hạt từ rắn, chất bao, chất lỏng mang) tương tác hoàn toàn với nhau Khi các thành phần trong chất lỏng từ hòa quyện với nhau thành một thể keo tạo nên sự cân bằng nồng độ hạt từ trong keo [28]

Các yếu tố ảnh hưởng đến trạng thái cân bằng nồng độ keo là hình dạng, kích thước hạt từ tính, nồng độ hạt, sự tương tác giữa các hạt (có yếu tố lực hấp dẫn và lực từ của hạt), độ nhớt chất lỏng, nhiệt độ môi trường, khả năng khuếch tán của hạt…

Coi các hạt từ có dạng hình cầu, đường kính dh, khi được từ hóa trong một từ trường H không đổi có thể đạt được sự cân bằng nồng độ hạt sau khoảng thời gian là:

  3KTdh (omG) 2 (1.1) K: hằng số Boltzmann

o: độ từ thẩm chân không m: mômen từ của hạt từ

G = H: độ biến thiên của từ trường từ hóa bên ngoài

1.3.3 Từ độ của chất lỏng từ

Từ độ của chất lỏng từ phụ thuộc từ tính của chất hạt từ, kích thước hạt, nồng độ hạt từ, nhiệt độ môi trường, từ trường từ hóa…

Từ độ bão hòa của chất lỏng từ: s 3

: Hệ số từ hóa của vật liệu

Phần thể tích của hạt từ trong chất lỏng tương ứng theo tỉ lệ: m

Các lớp bề mặt của hạt nano oxit sắt Fe 3 O 4

Các hạt nano từ Fe3O4 có xu hướng kết đám lại với nhau trong chất lỏng mang bởi tồn tại sự tương tác lưỡng cực từ mạnh giữa các hạt và lực Van der Waals, ngoài ra chúng còn dễ bị oxi hóa Để ngăn ngừa sự kết đám và sự oxi hóa cũng nhƣ làm tăng khả năng tương thích sinh học của chúng, hạt nano từ Fe3O4 với vai trò lớp lõi cần đƣợc thay đổi bề mặt bởi những lớp vỏ là các chất có hoạt tính bề mặt hoặc polymer [47-49].

1.4.1 Bọc silica lên bề mặt hạt nano oxit sắt

Silica là một ôxít của silicon với công thức hóa học là SiO2 Silica thường được tìm thấy trong tự nhiên là cát, thạch anh và trong thành tế bào của tảo silic Nó là thành phần chính của hầu hết các loại thủy tinh và chất nền nhƣ bê tông Silica là khoáng vật chiếm nhiều nhất trong lớp vỏ trái đất

Phủ SiO2 thì còn đƣợc dùng để cải tiến các tính chất của những oxit sắt Điều này có thể tạo thành lớp bảo vệ ổn định của lõi từ tính chống lại sự kết tụ và sự ngâm chiết trong môi trường axit, điều khiển khoảng cách phân ly giữa các hạt, làm ổn định các tính chất từ, điều khiển sự phân bố kích thước của các đám nano từ tính, điều khiển sự nung kết và sự ăn mòn Cuối cùng là bảo vệ chống lại sự oxi hóa trong suốt quá trình xử lý nhiệt trong không khí

Lớp phủ silica làm tăng kích thước của hạt và làm thay đổi tính chất từ của hạt nano từ Lớp bọc silica có độ dày khoảng 5 – 200nm có thể đƣợc điều khiển bằng cách thay đổi nồng độ amoniac và tỉ lệ của TEOS với nước

Hình 1.4 Cấu trúc silica và bề mặt hạt từ

1.4.2 Phủ 3- aminopropyltriethoxysilane (APTES) lên các hạt nano Fe 3 O 4 @SiO 2

Hình 1.5 Cấu tạo của phân tử APTES Để ứng dụng trong sinh học, các hạt nano cần phải đƣợc chức năng hóa bề mặt để có thể tiếp hợp với các đối tƣợng sinh học nhƣ DNA, kháng thể, enzyme Các nhóm chức thường gặp là nhóm amino, biotin, steptavidin, carbonxyl, thiol Để có được các nhóm chức ở bề mặt hạt nano, chúng ta sử dụng nguyên tắc thủy phân organosilane để tạo một lớp polymer trên bề mặt hạt nano Organosilane là các phân tử có hai nhóm chức có công thức tổng quát là X-(CH2) n -SiR n (OR’)3–n , trong đó X là nhóm chức cần thiết để tiếp hợp các đối tƣợng sinh học, (CH2) n là lớp đệm hữu cơ, phụ thuộc vào n mà lớp đệm này có thể dày hay mỏng, SiR n là nhóm liên kết với nhóm hydroxyl của bề mặt hạt nano Alkoxysilane với rất nhiều các nhóm chức X khác nhau đã đƣợc thương mại hóa Nhóm amino được sử dụng nhiều nhất trong các ứng dụng sinh học

Trong quá trình chức năng hóa bề mặt, với phân tử organosilane, xảy ra hai phản ứng đồng thời đó là quá trình thủy phân các nhóm silane alkoxy n thành các nhóm silanol hoạt tính và quá trình hóa rắn của các silanol với nhóm –OH tự do trên bề mặt hạt nano để tạo ra các liên kết Si-O-Si bền vững

Gần đây, phức chất chứa nhóm amino như APTES đã được sử du ̣ng rất rô ̣ng rãi có tác dụng làm tăng khả năng bám dí nh giƣ̃a các vâ ̣t liê ̣u hƣ̃u cơ và vô cơ [46] Nhóm chƣ́c 3-ethoxy trong mỗi phân tƣ̉ APTES có thể thủy phân và phản ƣ́ng t ạo ra nhóm chƣ́c năng đô ̣ng (–OH) có thể gắn kết lên bề mặt hợ p chất vô cơ Hơn nƣ̃a nhóm –NH2 có thể ảnh hưở ng, tác động lên bề mặt nhóm hydroxyl Do đó, lực van der Waals giữa các phân tử APTES làm chúng hình thành lớp đơn phân tử theo trật tự nhất định Vì thế, các phân tử APTES với cấu trúc đa lớp có thể gắn kết với một số gốc liên kết hóa học Người ta sử du ̣ng APTES như là chất hoa ̣t hóa bề mă ̣t làm tăng khả năng gắn kết giƣ̃a giƣ̃a APTES và lớp polymer hay ngay cả giƣ̃a các lớp APTES

Chúng tôi sử dụng APTES để tạo ra nhóm amino trên bề mặt hạt nano Ở đây, APTES được sử dụng để gắn với các hạt nano kim loại, làm cho silica có sự tương tác mạnh mẽ giữa nhóm amin và các hạt kim loại Đồng thời, hạt nano đƣợc chức năng hóa bề mặt bởi APTES sẽ làm tăng kh ả năng gắn kháng thể lên gấp nhiều lần so với các hạt nano chƣa hoa ̣t hóa bề mă ̣t với phân tƣ̉ APTES

1.4.3 Các hạt nano Fe 3 O 4 @SiO 2 /NH 2 đƣợc hoạt hóa bởi glutaraldehyde

Sau khi đƣợc thay đổi bề mặt bởi APTES, các hạt nano đƣợc hoạt hóa bởi GA để hình thành những nhóm aldehyde trên bề mặt hạt nano và các nhóm aldehyde của hạt nano liên kết với nhóm amino của kháng thể NS1 bằng liên kết đồng trị.

Ứng dụng hạt nano composite siêu thuận từ trong lĩnh vực y sinh học

Ngày nay, người ta đã chứng minh được rằng tính chất từ của các hạt sắt từ bị thay đổi đột ngột bởi hiệu ứng kích thước lượng tử và sự giảm diện tích bề mặt của các hạt từ kích thước nano Một hạt của vật liệu từ với một đường kính giới hạn, phụ thuộc vào vật liệu hạt, nó chỉ chứa một đơn đômen, nên các hạt này có một trạng thái có độ từ hóa không đổi tại bất kì trạng thái nào, nó không tương tác với các đômen bên cạnh trong một hạt hoặc một chất huyền phù phân tán tốt Kích thước tới hạn là kích thước đơn đômen của vật liệu Vậy một vật liệu chứa nhiều hạt có kích thước nano trình bày tính chất từ khi có một từ trường ngoài, nhưng độ từ hóa không đổi khi từ trường ngoài mất đi Đặc điểm đặc biệt này làm cho các hạt nano siêu thuận từ trở thành một sản phẩm nghiên cứu có giá trị trong các ứng dụng sinh học, và nhiều khả năng ứng dụng thì đƣợc nghiên cứu và phát triển bởi các nhà nghiên cứu Các ứng dụng y sinh của các hạt nano siêu thuận từ có thể đƣợc phân loại: ứng dụng bên trong (in vivo) và bên ngoài (in vitro) cơ thể [36],[45]

Trong các nghiên cứu trong in vitro, kỹ thuật phân tách từ miễn dịch của các tế bào, các protein, DNA/RNA, vi khuẩn, vi-rút và các phân tử khác thì đƣợc nghiên cứu rộng rãi và đạt đƣợc nhiều thành công to lớn Bên cạnh đó các ứng dụng trong in vivo của các vật liệu có cấu trúc nano siêu thuận từ đã đƣợc nhiều nhà nghiên cứu quan tâm và nhiều ứng dụng bên trong cơ thể thì liên quan trực tiếp đến cuộc sống hàng ngày của chúng ta, nhƣ nghiên cứu lâm sàng của trị liệu ung thƣ và chẩn đoán sớm các tế bào ung thƣ Các ứng dụng tiêu biểu trong lĩnh vực đặc biệt này là dẫn truyền thuốc, sản xuất dung dịch từ để nâng thân nhiệt cục bộ (hyperthermia), chẩn đoán các tác nhân tương phản của ảnh cộng hưởng từ, tách chiết tế bào và chẩn đoán dịch bệnh

Bất lợi chính của đa số hóa học trị liệu là chúng tương đối không đặc hiệu Các thuốc điều trị đƣợc tiêm trong tĩnh mạch và phân phối đến toàn bộ cơ thể, kết quả tác động thứ yếu của chất độc như thuốc tấn công các tế bào bình thường, khỏe mạnh ngoài các tế bào khối u đích [42],[43]

Liệu pháp dƣợc của các khối u ác tính, một trong những thử thách lớn nhất đến việc phân phối chính xác lượng thuốc tương ứng đến vị trí mong muốn bên trong cơ thể và duy trì liều lƣợng trong khoảng thời gian phù hợp Dẫn truyền thuốc chính xác có thể tránh lƣợng thuốc đƣa vào cho bệnh nhân cao hơn định mức và do đó làm giảm khả năng của tác dụng phụ Sử dụng các hạt nano siêu thuận từ nhƣ các hạt mang, nó cung cấp một phương pháp hướng đích vật lý và hóa học cho dẫn truyền thuốc Đưa thuốc bằng cách này có thể phân phối đến vị trí bệnh bằng cách sử dụng từ trường ngoài Thêm vào đó, các bề mặt chức năng có thể chọn các tế bào đặc biệt để phân phối và đƣa thuốc [19]

Mặc dù, các hạt nano siêu thuận từ thì có tiềm năng rất to lớn trong ứng dụng dẫn truyền thuốc Tuy nhiên sử dụng các hạt nano siêu thuận từ nhƣ các hạt mang, dẫn truyền thuốc có thể bị hƣ hỏng do các đặc điểm khác nhau của các hạt mang thuốc nhƣ các tính chất vật lý, nồng độ của các hạt huyền phù và liều lƣợng thể huyền phù tiêm vào, các loại thuốc đưa vào cùng với các hạt từ có thể ảnh hưởng đến hiệu quả dẫn truyền thuốc Hơn nữa, sự phân bố kích thước hạt, các nhóm chức năng gắn trên bề mặt hạt, cường độ của từ trường ngoài và lộ trình tiêm các hạt, cũng như các điều kiện sinh lí học của bệnh nhân có thể ảnh hưởng đến phương thức dẫn truyền thuốc Vì vậy sẽ cần rất nhiều thời gian cho các nghiên cứu thử nghiệm trước khi đưa vào cơ thể người

Hình 1.6 Nguyên lí dẫn thuốc dùng hạt nano từ tính

Một thanh nam châm bên ngoài rất mạnh tạo ra một gradientt từ trường kéo các hạt nano từ tính gắn với thuốc đến vị trí mong muốn Ở đó quá trình nhả thuốc diễn ra làm cho hiệu quả sử dụng thuốc đƣợc tăng lên nhiều lần.

1.5.2 Phương pháp đốt nhiệt từ [4]

Phương pháp đốt các tế bào ung thư bằng từ trường ngoài mà không ảnh hưởng đến các tế bào bình thường là một trong những ứng dụng quan trọng khác của hạt nano từ tính Một trong những nghiên cứu đầu tiên về đốt nhiệt từ xuất hiện từ năm 1957

[13] Nguyên tắc hoạt động là các hạt nano từ tính có kích thước từ 20 – 100nm được phân tán trong các mô mong muốn sau đó tác dụng một từ trường xoay chiều với tần số 1,2 MHz bên ngoài đủ lớn về cường độ và tần số để làm cho các hạt nano hưởng ứng mà tạo ra nhiệt nung nóng những vùng xung quanh Nhiệt độ khoảng 42°C trong khoảng 30 phút có thể đủ để giết chết các tế bào ung thư trong khi các tế bào thường vẫn an toàn

Nghiên cứu về kĩ thuật tăng thân nhiệt cục bộ đƣợc phát triển từ rất lâu và có rất nhiều công trình đề cập đến kĩ thuật này nhƣng chƣa có công bố nào thành công trên người Khó khăn chủ yếu đó là việc dẫn truyền lượng hạt nano phù hợp để tạo ra đủ nhiệt lượng khi có sự có mặt của từ trường ngoài mạnh trong phạm vi điều trị cho phép Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nung nóng cục bộ là lưu lượng máu và phân bố của các mô Thực nghiệm và tính toán cho biết tỉ số phát nhiệt vào khoảng 100 mW/cm 3 là đủ trong hầu hết các trường hợp thực nghiệm [14] Tần số và biên độ của từ trường thường dùng dao động trong khoảng f = 0,05 – 1,2 MHz, H < 0,02T

[37],[38] Mật độ hạt nano cần thiết vào khoảng 5 – 10 mg/cm 3

Các hạt nano oxit sắt siêu thuận từ đã phủ lớp tương thích sinh học thì được tiêm vào cơ thể bị ung thƣ Các hạt này liền đi vào khối u thông qua các lỗ ở tế bào nội mô của mạch máu nuôi dƣỡng khối u Khi đã vào trong khối u các hạt này sẽ liên kết với nhau nhờ các enzym protease trong khối u Khối hạt liên kết này sẽ phát ra các tín hiệu từ mạnh, qua đó thông báo vị trí khối u qua cộng hưởng từ hạt nhân

Bằng cách sử dụng các hạt nano hoặc các đầu dò nano có gắn kháng thể để tìm kiếm các tế bào ung thƣ, các vi-rút, vi khuẩn gây bệnh ở mức độ nano mét nên cực nhạy nhờ vào phương pháp liên kết đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể, mỗi kháng thể chỉ có thể nhận diện đƣợc một kháng nguyên duy nhất Dung dịch chứa các hạt nano từ này sẽ hút các loại vi khuẩn, vi-rút gây bệnh khi được trộn lẫn với huyết tương, huyết thanh của người, sau đó sẽ được tách chiết và phân tích để chẩn đoán bệnh

Phương pháp này giúp chẩn đoán sớm được một số bệnh, tiết kiệm được thời gian và chi phí Hiện nay chẩn đoán nano bắt đầu đƣợc ứng dụng trong lâm sàng ở một số nước, đem lại nhiều hứa hẹn

1.5.4 Phân tách và chọn lọc tế bào

Trong y sinh học, người ta thường xuyên phải tách một loại thực thể sinh học nào đó ra khỏi môi trường của chúng để làm tăng nồng độ khi phân tích hoặc cho các mục đích khác Phân tách tế bào sử dụng các hạt nano từ tính là một trong những phương pháp thường được sử dụng.

Quá trình phân tách đƣợc chia làm hai giai đoạn:

– Đánh dấu thực thế sinh học cần nghiên cứu;

– Tách các thực thể được đánh dấu ra khỏi môi trường bằng từ trường

Việc đánh dấu được thực hiện thông qua các hạt nano từ tính Hạt nano thường dùng là hạt oxit sắt Các hạt này được bao phủ bởi một loại hóa chất có tính tương hợp sinh học nhƣ là dextran, polyvinyl alcohol (PVA), Hóa chất bao phủ không những có thể tạo liên kết với một vị trí nào đó trên bề mặt tế bào hoặc phân tử mà còn giúp cho các hạt nano phân tán tốt trong dung môi, tăng tính ổn định của chất lỏng từ Giống nhƣ trong hệ miễn dịch, vị trí liên kết đặc biệt trên bề mặt tế bào sẽ đƣợc các kháng thể hoặc các phân tử khác nhƣ các hormone, axit folic tìm thấy Các kháng thể sẽ liên kết với các kháng nguyên Đây là cách rất hiệu quả và chính xác để đánh dấu tế bào Các hạt từ tính được bao phủ bởi các chất hoạt hóa tương tự các phân tử trong hệ miễn dịch đã có thể tạo ra các liên kết với các tế bào hồng cầu, tế bào ung thƣ phổi, vi khuẩn, tế bào ung thư đường tiết niệu và thể golgi [31] Đối với các tế bào lớn, kích thước của các hạt từ tính đôi lúc cũng cần phải lớn, có thể đạt kích thước vài trăm nano mét

Quá trình phân tách được thực hiện nhờ một gradientt từ trường ngoài Từ trường ngoài tạo một lực hút các hạt từ tính có mang các tế bào đƣợc đánh dấu Các tế bào không đƣợc đánh dấu sẽ không đƣợc giữ lại và thoát ra ngoài Lực tác động lên hạt từ tính được cho bởi phương trình sau:

Chất sinh miễn dịch – kháng nguyên

Bất kì một chất nào khi đƣa vào cơ thể động vật ở điều kiện thích hợp gây ra đáp ứng miễn dịch đều đƣợc gọi là chất sinh miễn dịch Bất cứ một chất nào khi gắn với thành phần của đáp ứng miễn dịch (kháng thể hoặc tế bào Lympho hoặc cả hai) đều đƣợc gọi là kháng nguyên Tất cả các chất sinh miễn dịch đều là kháng nguyên, song một số chất đƣợc coi là kháng nguyên nhƣng không gây đáp ứng miễn dịch Ví dụ hapten là các chất có khối lƣợng phân tử thấp có thể gắn với kháng thể đặc hiệu nhƣng bản thân nó không kích thích tạo kháng thể Hapten bao gồm các phân tử đường, axit amin, các polyme nhỏ và nhiều loại chất kháng sinh Điều kiện bắt buộc của một chất sinh miễn dịch:

Tính lạ (đối với cơ thể), khối lƣợng phân tử lớn, cấu trúc phân tử phức tạp Nếu thiếu một trong 3 tiêu chuẩn này thì cũng phải gắn với chất mang để làm tăng khối lƣợng phân tử hoặc có mức độ phức tạp về cấu trúc (ví dụ: hapten gắn với protein gây đáp ứng miễn dịch)

Tính đặc hiệu của kháng nguyên

Sự liên kết giữa kháng nguyên với kháng thể hay với tế bào lympho luôn mang tính đặc hiệu cao, nghĩa là phải khớp với nhau nhƣ khóa với chìa Kháng thể hay tế bào lympho không phải liên kết với toàn bộ phân tử kháng nguyên mà chỉ với những phần nhất định của kháng nguyên, gọi là quyết định kháng nguyên hay là epitope Phần tương ứng với nó trên mỗi kháng thể gọi là vị trí kết hợp kháng nguyên hay paratop

Phần tương ứng với quyết định kháng nguyên nằm trên tế bào lympho gọi là thụ thể (chẳng hạn thụ thể của tế bào T là TCR – T cell receptor) Mỗi epitope chỉ gắn đặc hiệu với một paratop của kháng thể hoặc TCR và chỉ sinh ra một dòng kháng thể đặc hiệu Một kháng nguyên có nhiều epitope khác nhau sẽ tạo thành nhiều dòng kháng thể khác nhau tương ứng với từng epitope.

Kháng thể

Kháng thể (antibody) là các phân tử immunoglobulin (có bản chất glycoprotein), do các tế bào lympho B cũng như các tương bào (biệt hóa từ lympho B) tiết ra để hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hóa các tác nhân lạ, chẳng hạn các vi khuẩn hoặc vi-rút Mỗi kháng thể chỉ có thể nhận diện một epitope kháng nguyên duy nhất [18],[2] Một số kháng thể có sẵn trong các dịch khác của cơ thể (ví dụ: sữa) gọi là kháng thể tự nhiên hay kháng thể không đặc hiệu Ở đây, chúng tôi chỉ đề cập đến loại kháng thể miễn dịch

Bản chất kháng thể: là protein (γ-globulin) nên các tác nhân hóa, lý nhƣ nhiệt độ, pH,… có khả năng làm biến tính protein thì cũng có thể phá hủy kháng thể

Có 5 loại Ig là IgG, IgA, IgM, IgD, IgE

Cấu trúc của kháng thể miễn dịch:

Tất cả các Ig đều có cấu trúc giống nhau, trong đó IgG là kháng thể lưu hành phổ biến nên ta xem xét nhƣ một mô hình chung cho các lớp kháng thể khác

IgG chứa 4 chuỗi peptid, bao gồm 2 chuỗi nhẹ (kí hiệu là L) và 2 chuỗi nặng (kí hiệu là H) liên kết với nhau bởi cầu disulfur (S–S) Trình tự axit amin giống hệt nhau theo từng đôi chuỗi nặng và từng đôi chuỗi nhẹ Mỗi chuỗi nhẹ chứa 212 axit amin, mỗi chuỗi nặng chứa khoảng 450 axit amin.Cả phân tử có cấu tạo đối xứng

Dưới tác dụng của papain (enzyme phân giải protein), phân tử được phân giải thành 3 mảnh Trong đó, 2 mảnh nhỏ chứa toàn bộ 2 chuỗi nhẹ và nửa chuỗi nặng có đầu amin (–NH2) Đây là nơi gắn với kháng nguyên và đƣợc gọi là đoạn Fab (Fragment of antigen binding) Mảnh còn lại chứa hai nửa có đầu carboxyl (–COOH) của hai chuỗi nặng, không gắn đƣợc với kháng nguyên nhƣng có khả năng kết dính nên đƣợc gọi là phần Fc (Fragment crystallizable)

Nhƣ vậy, phân tử IgG chứa hai vị trí kết hợp kháng nguyên, chiếm khoảng 1% diện tích bề mặt của IgG Vị trí kết hợp kháng nguyên nằm ở phía đầu amin của hai chuỗi nặng và nhẹ

Hình 1.8 Cấu trúc của IgG

IgG cũng chứa một lƣợng nhỏ carbon hydrat nhƣng không liên quan đến vị trí kết hợp kháng nguyên.

Chẩn đoán sớm và chính xác bệnh truyền nhiễm bằng phương pháp ELISA có sử dụng hạt nano từ

có sử dụng hạt nano từ

ELISA (Enzym – Linked ImmunoSorbent Assay) là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm

ELISA đƣợc sử dụng phổ biến nhờ vào những ƣu điểm sau: dễ thực hiện, tốc độ nhanh, chi phí thấp, dễ sản xuất, an toàn với độ nhạy và độ đặc hiệu chấp nhận đƣợc

Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên, kháng thể và cơ chất; thực hiện qua hai bước:

– Phản ứng miễn dịch học: là sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể

– Phản ứng giữa enzym và cơ chất: enzym sẽ biến đổi cơ chất và tạo tín hiệu có thể xác định đƣợc (ví dụ: huỳnh quang, màu sắc,…) [17]

Hình 1.9 Kĩ thuật ELISA có sử dụng các hạt nano từ

Sơ lƣợc về bệnh sốt xuất huyết

Sốt xuất huyết dengue (dengue hemorrhagic fever, DHF hay Sốt dengue (dengue fever, DF), tại Việt Nam thường được gọi chung là bệnh sốt xuất huyết, có biểu hiện nặng nhất của bệnh là hội chứng sốc dengue (dengue shock syndrome, DSS) đƣợc gây ra do Dengue virus (chi Flavivirus, họ Flaviviridae)

1.9.2 Đặc điểm của virus gây bệnh sốt xuất huyết

Hình 1.10 Mô tả về cấu trúc của Virus Dengue

Có một lớp vỏ lipoprotein bên ngoài bao bọc một caspid, hệ gen của virus gồm phức hợp ARN nhận biết dương tính Virus Dengue thuộc nhóm Flavivirus (họ Arbovirus nhóm B hay Flaviviridae) virus Dengue có 4 typ huyết thanh: 1,2,3 và 4 Có nhân ARN, có 3 gen Protein có cấu trúc Protein C (lõi), Protein M (màng), Protein (vỏ) và 7 Protein không cấu trúc Protein E có chức năng trung hòa và tương tác với các thụ thể

+ NS1 là glycoprotein, kháng nguyên kết hợp bổ thể, có vai trò quan trọng trong phản ứng đáp ứng miễn dịch của cơ thể khi bị nhiễm virus NS1 của virus Dengue có trọng lượng phân tử 46-50 kD, thể hiện dưới 2 dạng: dạng kết hợp màng (mNS1) và dạng tiết (sNS1) quyết định tính đặc hiệu nhóm và loài Chức năng của NS1 đến nay chưa được xác định đầy đủ, nhưng người ta nhận thấy nó tham gia vào quá trình sao chép RNA của virus, cần thiết cho sự tồn tại của virus [5]:

+ NS2 là protein có kích thước lớn.

+ NS2a là protein liên kết màng, có kích thước nhỏ.

+ NS2b là protein liên kết màng, có kích thước nhỏ Vùng trung tâm của NS2B nhƣ là đồng yếu tố của protein NS3 có hoạt tính serine protease.

+ NS3 là protein có hoạt tính serin-protease và helicase Mã amin cuối cùng của NS3 là serine protease, cần thiết cho quá trình sao chép của virus [34]

+ NS4a là protein liên kết màng, có kích thước nhỏ.

+ NS4b là protein liên kết màng, có kích thước nhỏ.

Các virus Dengue có nhiều kháng nguyên, có kháng nguyên đặc hiệu của typ, có những kháng nguyên chung của phân nhóm và nhóm Cả 4 typ huyết thanh virus Dengue có họ hàng với nhau phản ứng chéo nhau Tuy nhiên kháng thể thu đƣợc sau khi nhiễm một typ huyết thanh có phản ứng dương tính nhưng không trung hòa hoàn toàn đƣợc các typ còn lại [38].

Sơ lƣợc về bệnh ung thƣ gan

Các nghiên cứu về sinh bệnh học của ung thƣ biểu mô tế bào gan đã chỉ ra rằng có một số protein đóng vai trò trong sự tiến triển của căn bệnh này Theo kết quả của nghiên cứu tìm kiếm các gen có thể có vai trò trong ung thƣ biểu mô tế bào gan, Hsu và các công sự đã cho thấy rằng: so với gan bình thường và các tổn thương gan không ác tính, lƣợng ARN thông tin mã hóa cho Glypican-3 tăng cao đáng kể trong ung thƣ biểu mô tế bào gan Glypican-3 là một sulfate proteoglycan heparan đƣợc liên kết với màng tế bào bởi một glycosyl-phosphatidylinositol Bằng phương pháp nhuộm mô cố định và phương pháp ELISA, Mariana I Capurro cùng các cộng sự đã chứng minh rằng Glypican-3 được thể hiện trong hầu hết các trường hợp ung thư biểu mô gan nhưng không phát hiện được trong những trường hợp tế bào gan bình thường hoặc tổn thương gan lành tính Từ đó, nhóm nghiên cứu đề xuất rằng Glypican-3 có thể được sử dụng nhƣ một loại huyết thanh và là dấu hiệu hoá mô của ung thƣ biểu mô tế bào gan

1.11 Phương pháp đồng kết tủa dùng để tổng hợp hạt nano từ Fe 3 O 4

Phương pháp đồng kết tủa [26] là phương pháp đã lâu đời và đơn giản Chất tạo phản ứng là các muối vô cơ như FeCl2, FeCl3, FeSO4, …được hòa tan trong môi trường nước, sau đó được cho phản ứng với dung dịch bazơ hydroxit như KOH, NaOH,

NH4OH,…để tạo kết tủa Hạt nano hình thành có kích thước khoảng 2 – 30 nm Ta có thể điều khiển kích thước hạt bằng việc thay đổi độ pH, thay đổi lượng nước, nồng độ dung dịch muối ban đầu, nhiệt độ trong lúc chế tạo Để thu đƣợc hạt có độ đồng nhất cao, cần phân tách thành hai giai đoạn hình thành mầm và phát triển mầm Quá trình tạo mầm đƣợc đặc trƣng bởi sự tăng nồng độ của chất đến gần nồng độ bão hòa tới hạn Trong quá trình phát triển mầm, nồng độ của dung dịch giảm Có ba cơ chế phát triển mầm (Hình 1.1): hạt đồng nhất phát triển nhờ sự khuyếch tán (đường cong I), hạt đồng nhất phát triển do sự kết hợp các phần tử nhỏ lại với nhau (đường cong II), hạt đồng nhất nhận được do sự kết hợp của nhiều mầm (đường cong III)

Hình 1.11 Cơ chế hình thành các hạt nano

Cơ chế tổng hợp hạt nano Fe3O4 nhƣ sau: với tỉ phần mol Fe 3+ /Fe 2+ = 2: 1 trong môi trường kiềm có pH = 9 – 14

Fe 3+ + H2O → Fe(OH)x 3–x (thông qua quá trình mất proton) (2.1)

Fe 2+ + H2O → Fe(OH)y 2–y (thông qua quá trình mất proton) (2.2)

Fe(OH)x 3–x + Fe(OH)y 2–y → Fe3O4 (thông qua quá trình oxi hóa và dehydride hóa) (2.3)

Tổng hợp các phản ứng trên chúng ta có phương trình sau:

Magnetite dễ bị oxi hóa trong không khí thành maghemite (-Fe2O3) theo phương trình:

4 Fe3O4 + O2 → 6-Fe2O3 (2.5) Ở nhiệt độ cao, maghemite bị oxi hóa thành hematite (α- Fe2O3)

Mặc dù đồng kết tủa là phương pháp đơn giản nhưng khi các hạt hình thành chúng kết tụ rất mạnh Sự kết tụ làm hạn chế khả năng ứng dụng tiếp theo, do đó, đòi hỏi phải có sự biến đổi bề mặt Ngoài ra, để ứng dụng trong y sinh học các hạt này cần đƣợc chức năng hóa bề mặt với các chất tương thích sinh học

1.12 Phương pháp tạo lớp bao phủ SiO 2 lên hạt nano từ Fe 3 O 4

Có nhiều phương pháp để tạo lớp phủ SiO2 lên hạt nano oxit sắt từ, trong bài này chúng tôi sử dụng phương pháp Stober được Stober, Fink và Bohn phát triển Phương pháp này đƣợc sử dụng rộng rãi để điều chế các hạt cầu nano silica đơn phân tán qua quá trình thủy phân và ngƣng tụ tetraethylorthosilicate (TEOS) trong dung dịch bazơ gồm nước và rượu Để thúc đẩy hình thành cấu trúc đặc sít hơn là mạng polymer thì trong quá trình điều chế hạt tỉ lệ thể tích của nước/TEOS thường là lớn hơn 20/1 và độ pH cao [12]

Hình 1.12 Sơ đồ quá trình thủy phân và ngưng tụ TEOS

1.13 Phương pháp chức năng hóa bề mặt hạt nano Fe 3 O 4 @SiO 2 VỚI APTES

Phản ứng silane hóa bề mặt hạt nano lõi – vỏ Fe3O4@SiO2 bằng APTES diễn ra theo hai giai đoạn [20]:

– Giai đoạn 1: xảy ra phản ứng thủy phân Khi đó, nhóm alkoxit (–OC2H5) đƣợc thay thế bằng nhóm hydroxyl (–OH) để hình thành nhóm hoạt động silanol (Si–OH) trên phân tử APTES

– Giai đoạn 2: nhóm silanol trên bề mặt hạt nano sẽ liên kết cộng hóa trị với nhóm silanol của APTES để hình thành liên kết Si–O–Si qua phản ứng khử nước

Hình 1.13 Sơ đồ phản ứng gắn APTES lên hạt nano Fe 3 O 4 @SiO 2

1.14 Phương pháp tách miễn dịch từ (IMS)

Mặc dù các phương pháp nhanh thường được sử dụng nhưng hầu hết các phương pháp này chỉ tập trung và các khía cạnh phát hiện mà bỏ qua giai đoạn xử lý mẫu trước khi phân tích Thông thường việc phát hiện phát hiện vi sinh vật gây bệnh trên các nền mẫu phức tạp rất khó khăn nếu không có giai đoạn cô đặc và tinh chế Yêu cầu quan trọng nhất trong xử lý mẫu là ligal phải có ái lực đặc hiệu cao để bắt giữ chọn lọc và cô đặc đƣợc vi sinh vật mục tiêu [41]

Trong nhiều năm, tương tác kháng nguyên – kháng thể đã được sử dụng để thiết kế kỹ thuật phân tích miễn dịch từ và cảm biến sinh học Hiệu quả của phức hợp hạt từ mang kháng thể phụ thuộc vào khả năng kháng thể tương thích với bề mặt chất rắn từ tính Cải tiến đáng kể trong sản xuất các hạt từ đã thu hút mối quan tâm về việc sử dụng chúng làm giá đỡ cho các kháng thể, từ đó tiến hành tóm bắt, phân tách sinh học

Hình 1.14 Phương pháp tách miễn dịch từ (IMS)

1.15 Phương pháp cố định kháng thể vào giá rắn

Có nhiều yếu tố cần xem xét khi lựa chọn phương pháp cố định kháng thể: giá rắn đƣợc lựa chọn, nhóm chức trên phân tử kháng thể, nhóm phản ứng trên giá rắn, điều kiện cố định, Nếu quá trình cố định không phù hợp sẽ gây nên một số tác động: gắn đa điểm, định hướng không phù hợp hay che lấp không gian [15],[35] Cố định kháng thể ngẫu nhiên, trực tiếp thông qua nhóm amin trên phân tử lysine:

Nhóm amin có trên phân tử lysine gặp rất nhiều tại các vị trí dọc theo phân tử kháng thể và cả vùng gắn kháng nguyên Do đó, quá trình cố định ngẫu nhiên đa hướng này có thể làm giảm hoạt tính gắn kháng nguyên của kháng thể Vì vậy, dung tích gắn sau cùng có thể thấp hơn dự kiến

Hình 1.15 Các tình huống có thể xảy ra khi kháng thể được gắn ngẫu nhiên vào pha rắn [3] a Còn nguyên hoạt tính b Còn 1 phần hoạt tính c Không còn hoạt tính

1.16 Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford

Trong các phương pháp xác định hàm lượng protein thì đây là phương pháp có độ nhạy cao, cú thể xỏc định tới 1àg, hoỏ chất đơn giản ớt tốn thời gian Một ƣu điểm lớn của phương pháp này là ít bị cản trở bởi các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu protein

Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brillant Blue khi tạo phức hợp với protein Trong dung dịch mang tính axit khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm ở dạng màu đỏ có bước sống thấp thu cực đại là 465 nm và khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm chuyển sang dạng màu xanh dương và hấp thu cực đại ở mức cực đại ở bước sóng 595 nm Độ hấp thu ở bước sóng 596 nm có liên hệ một cách trực tiếp với nồng độ protein Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết được nồng độ Sau khi cho dung dịch protein vào thuốc nhuộm màu, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1giờ

Tiến hành đo phổ tử ngoại khả kiến của dung dịch ta đƣợc ODx, độ hấp thụ sẽ tỷ lệ với lƣợng proteintrong mẫu Thực hiện một đối chứng với HCl (ODO)

Phương pháp tạo lớp bao phủ Sio 2 lên hạt nano từ Fe 3 O 4

Có nhiều phương pháp để tạo lớp phủ SiO2 lên hạt nano oxit sắt từ, trong bài này chúng tôi sử dụng phương pháp Stober được Stober, Fink và Bohn phát triển Phương pháp này đƣợc sử dụng rộng rãi để điều chế các hạt cầu nano silica đơn phân tán qua quá trình thủy phân và ngƣng tụ tetraethylorthosilicate (TEOS) trong dung dịch bazơ gồm nước và rượu Để thúc đẩy hình thành cấu trúc đặc sít hơn là mạng polymer thì trong quá trình điều chế hạt tỉ lệ thể tích của nước/TEOS thường là lớn hơn 20/1 và độ pH cao [12]

Hình 1.12 Sơ đồ quá trình thủy phân và ngưng tụ TEOS

Phương pháp chức năng hóa bề mặt hạt nano Fe 3 O 4 @SiO 2 VỚI APTES

Phản ứng silane hóa bề mặt hạt nano lõi – vỏ Fe3O4@SiO2 bằng APTES diễn ra theo hai giai đoạn [20]:

– Giai đoạn 1: xảy ra phản ứng thủy phân Khi đó, nhóm alkoxit (–OC2H5) đƣợc thay thế bằng nhóm hydroxyl (–OH) để hình thành nhóm hoạt động silanol (Si–OH) trên phân tử APTES

– Giai đoạn 2: nhóm silanol trên bề mặt hạt nano sẽ liên kết cộng hóa trị với nhóm silanol của APTES để hình thành liên kết Si–O–Si qua phản ứng khử nước

Hình 1.13 Sơ đồ phản ứng gắn APTES lên hạt nano Fe 3 O 4 @SiO 2

Phương pháp tách miễn dịch từ (IMS)

Mặc dù các phương pháp nhanh thường được sử dụng nhưng hầu hết các phương pháp này chỉ tập trung và các khía cạnh phát hiện mà bỏ qua giai đoạn xử lý mẫu trước khi phân tích Thông thường việc phát hiện phát hiện vi sinh vật gây bệnh trên các nền mẫu phức tạp rất khó khăn nếu không có giai đoạn cô đặc và tinh chế Yêu cầu quan trọng nhất trong xử lý mẫu là ligal phải có ái lực đặc hiệu cao để bắt giữ chọn lọc và cô đặc đƣợc vi sinh vật mục tiêu [41]

Trong nhiều năm, tương tác kháng nguyên – kháng thể đã được sử dụng để thiết kế kỹ thuật phân tích miễn dịch từ và cảm biến sinh học Hiệu quả của phức hợp hạt từ mang kháng thể phụ thuộc vào khả năng kháng thể tương thích với bề mặt chất rắn từ tính Cải tiến đáng kể trong sản xuất các hạt từ đã thu hút mối quan tâm về việc sử dụng chúng làm giá đỡ cho các kháng thể, từ đó tiến hành tóm bắt, phân tách sinh học

Hình 1.14 Phương pháp tách miễn dịch từ (IMS)

Phương pháp cố định kháng thể vào giá rắn

Có nhiều yếu tố cần xem xét khi lựa chọn phương pháp cố định kháng thể: giá rắn đƣợc lựa chọn, nhóm chức trên phân tử kháng thể, nhóm phản ứng trên giá rắn, điều kiện cố định, Nếu quá trình cố định không phù hợp sẽ gây nên một số tác động: gắn đa điểm, định hướng không phù hợp hay che lấp không gian [15],[35] Cố định kháng thể ngẫu nhiên, trực tiếp thông qua nhóm amin trên phân tử lysine:

Nhóm amin có trên phân tử lysine gặp rất nhiều tại các vị trí dọc theo phân tử kháng thể và cả vùng gắn kháng nguyên Do đó, quá trình cố định ngẫu nhiên đa hướng này có thể làm giảm hoạt tính gắn kháng nguyên của kháng thể Vì vậy, dung tích gắn sau cùng có thể thấp hơn dự kiến

Hình 1.15 Các tình huống có thể xảy ra khi kháng thể được gắn ngẫu nhiên vào pha rắn [3] a Còn nguyên hoạt tính b Còn 1 phần hoạt tính c Không còn hoạt tính

Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford

Trong các phương pháp xác định hàm lượng protein thì đây là phương pháp có độ nhạy cao, cú thể xỏc định tới 1àg, hoỏ chất đơn giản ớt tốn thời gian Một ƣu điểm lớn của phương pháp này là ít bị cản trở bởi các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu protein

Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brillant Blue khi tạo phức hợp với protein Trong dung dịch mang tính axit khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm ở dạng màu đỏ có bước sống thấp thu cực đại là 465 nm và khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm chuyển sang dạng màu xanh dương và hấp thu cực đại ở mức cực đại ở bước sóng 595 nm Độ hấp thu ở bước sóng 596 nm có liên hệ một cách trực tiếp với nồng độ protein Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết được nồng độ Sau khi cho dung dịch protein vào thuốc nhuộm màu, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1giờ

Tiến hành đo phổ tử ngoại khả kiến của dung dịch ta đƣợc ODx, độ hấp thụ sẽ tỷ lệ với lƣợng proteintrong mẫu Thực hiện một đối chứng với HCl (ODO)

Lấy giá trị ∆OD = ODx– ODO Lƣợng protein trong mẫu dung dịch đo đƣợc xác định bằng cách dựa vào đường chuẩn từ giá trị ∆OD ở trục tung, từ đó suy ra giá trị nồng độ protein tương ứng trên trục hoành

Các phương pháp phân tích

Phương pháp nhiễu xạ tia X (X-ray Diffaction, XRD)là một kỹ thuật quan trọng cho sự nghiên cứu cấu trúc, xác định pha, nhận dạng thành phần và đo lường kích thước trung bình của của nhiều loại vật liệu khác nhau

Khi tia X chiếu vào một mẫu bột, các lớp tinh thể của mẫu hoạt động giống nhƣ những tấm gương phản xạ chùm tia X Sự giao thoa sau đó xuất hiện giữa chùm tia phản xạ, giữa các dòng khác nhau của nguyên tử trong tinh thể Điều này thể hiện trong định luật Bragg: nλ = 2dsinθ (n = 1, 2, 3, ) (2.8)

: bước sóng tia X( A 0 ); n: Bậc giao thoa; : Góc hợp bởi tia tới và mặt phẳng mạng; d: Hằng số mạng (khoảng cách giữa các lớp nguyên tử trong tinh thể)

Sự mở rộng đỉnh của đỉnh thí nghiệm nhiễu xạ có thể cho chúng ta các thông tin về đường kính trung bình của hạt thông qua công thức Scherrer:

 = FWHM: độ bán rộng của vạch nhiễu xạ

Sản phẩm sau khi tổng hợp xong đƣợc đo nhiễu xạ tia X bằng máy Siemens Diffraktometer Viện Vật Lý Việt Nam

1.17.2 Phổ hấp thụ hồng ngoại

FT–IR hoạt động dựa trên sự hấp thụ bức xạ hồng ngoại của vật chất cần nghiên cứu Phương pháp này ghi nhận các dao động đặc trưng của các liên kết hóa học giữa các nguyên tử, nó cho phép phân tích với hàm lƣợng chất mẫu rất thấp và có thể phân tích cấu trúc, định tính và cả định lƣợng Có thể đạt độ nhạy rất cao ngay cả khi mẫu chỉ có bề dày cỡ nano mét

Sản phẩm sau khi tổng hợp đƣợc tiến hành đo tại Viện Địa Lý

Từ kế mẫu rung (Vibrating Specimen Magnetometer – VSM) thường được dùng để đo lường tính chất từ của vật liệu như một hàm của từ trường, nhiệt độ và thời gian

VSM thì dựa trên sự dao động của mẫu trong từ trường để tạo ra một mômen từ xoay chiều trong hệ có đầu dò thích hợp

Từ kế mẫu rung hoạt động theo nguyên tắc cảm ứng điện từ, sức điện động sinh ra bởi mẫu sắt từ khi chúng dao động với tần số không đổi, dưới sự có mặt của từ trường không đổi và đồng nhất

1.17.4 Kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM)

Kính hiển vi điện tử truyền qua TEM (Transmission Electron Microscope) là một công cụ thiết yếu để phân tích một cách trực quan các vật liệu nano TEM có khả năng quan sát các cấu trúc và hình dạng của mẫu

Mẫu phân tích là mẫu lỏng, được phủ lên trên lưới đồng, nano kim loại sẽ bám vào bề mặt lưới và đo bằng kính hiển vi điện tử truyền qua TEM, JEM-1400, Nhật (Phòng Thí nghiệm trọng điểm Quốc Gia Vật liệu Polymer và Composite, ĐH Bách Khoa, Tp HCM) Sau khi tinh chỉnh máy để đạt đƣợc ảnh TEM của hạt nano kim loại rõ nét nhất, các ảnh TEM sẽ được chụp và gửi dữ liệu đến máy tính dưới dạng file ảnh

1.17.5 Phổ tử ngoại khả kiến

Phương pháp đó phổ UV – Vis là một phương pháp định lượng, xác định nồng độ của các chất thông qua độ hấp thụ của dung dịch

Cho chùm ánh sáng có độ dài sóng xác định có thể thấy đƣợc (Vis) hoặc không thấy được (UV – IR) đi qua vật thể hấp thu (thường ở dạng dung dịch) Dựa vào lượng ánh sáng đã bị hấp thu bởi dung dịch mà suy ra nồng độ của dung dịch đó

1.17.6 Phân tích nhiê ̣t tro ̣ng lượng (TGA)

TGA là phương pháp dựa trên cơ sở xác đi ̣nh khối lượng của mẫu vâ ̣t chấ t bi ̣ mất đi ( hoă ̣c nhâ ̣n vào) trong quá trình chuyển pha nhƣ mô ̣t hàm của nhiê ̣t đô ̣

Khi vâ ̣t chất bi ̣ nung nóng khối lượng chúng sẽ bi ̣ mất đi từ các quá trình đơn giản nhƣ bay hơi hoă ̣c tƣ̀ các phản ƣ́ng hóa ho ̣c giải phóng k hí Mô ̣t số vâ ̣t liê ̣u có thể nhâ ̣n đươ ̣c khối lượng do chúng phản ứng với môi trường kiểm tra

Phép đo TGA nhằm xác định : Khối lươ ̣ng bi ̣ mất trong quá trình chuyển pha , khối lươ ̣ng bi ̣ mất theo thời gian và theo nhiê ̣t đô ̣ do quá trình khử nước hoặc phân ly Đường phổ TGA đặc trưng cho một hợp chất hoặc một hệ do thứ tự của các phản ứng hóa học xuất hiện tại một khoảng nhiệt độ xác định là một hàm của cấu trúc phân tử Sự thay đổi của khố i lượng là kết quả của quá trình đứt gãy hoă ̣c hình thành vô số các liên kết vật lý và hóa học tại một nhiệt độ gia tăng dẫn đến sự bay hơi của các sản phẩm hoă ̣c ta ̣o thành các sản phẩm nă ̣ng hơn

Nhiê ̣t đô ̣ sử du ̣ng bình thường khoảng 1200 o C Môi trường sử du ̣ng là khí trơ hoă ̣c khí tích cực

Các quá trình diễn ra trong phương pháp phân tích này thông thường là bay hơi , hủy cấu trúc , phân hủy cacbonat , oxi hóa sulphua , oxi hóa florua , tái hydra t hóa… Đó là các quá trình ta ̣o nên nhƣ̃ng đƣ́t gãy hoă ̣c hình thành các liên kết vâ ̣t lý hóa ho ̣c xảy ra trong mẫu chất Đây là phương pháp phân tích khối lượng nên những thông tin nhâ ̣n được rất tốt cho viê ̣c xác đi ̣nh thành phần khối lượng các chất có mă ̣t trong mô ̣t mẫu chất nào đó Bên ca ̣nh đó , ta xác đi ̣nh được thành phần đô ̣ ẩm , thành phần dung môi , chất phu ̣ gia của một loại vật liệu nào đó

Trong luận văn này, chúng tôi tiến hành đo đạt mẫu bằng các thiết bị và ở các địa điểm sau: Ảnh hiển vi điện tử truyền qua (TEM): Mẫu đem phân tích là mẫu lỏng, đƣợc phủ lên trên lưới đồng, nano kim loại sẽ bám vào bề mặt lưới và đo bằng kính hiển vi điện tử truyền qua TEM, JEM-1400 (Joel, Japan) tại PTN Trọng điểm QG Vật liệu Polyme và compozit

Phổ hồng ngoại biến đổi Fourier (FT-IR) đƣợc ghi bởi máy quang phổ

TENSOR 27 (Brucker, Germany), đo tại phòng thí nghiệm Vật liệu kĩ thuật cao, F.17, trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh và Viện Vật Lý Việt Nam Đường cong từ hóa được đo ở nhiệt độ phòng bởi từ kế mẫu rung (VSM)

MicroSense (USA) – Viện Vật lý TpHCM

Giản đồ nhiễu xạ tia X (XRD) đƣợc đo bởi máy D8–ADVANCE (Bruker,

PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

Vật liệu

Hệ thống máy đọc ELISA, Thermo

Nam châm vĩnh cửu – DynaMag-2, Invitrogen

Ống nghiệm thủy tinh 20 ml

Hệ thống điện di Mini Protean, BioRad

Hóa chất

STT Tên hóa chất Công thức phân tử Xuất xứ

1 Sắt (II) clorua FeCl 2 4H 2 O Sigma

2 Sắt (III) clorua FeCl 3 6H 2 O Sigma

8 Albumin from bovine serum BSA Sigma

13 2-[N-morpholino]ethane sulfonic axit] MES Sigma

14 (Sulfo-) N-hydroxy Succinimide NHS Sigma

15 Sodium dodecyl sulfate SDS Sigma

17 Kháng thể sốt xuất huyết NS3, NS1 Sigma

18 Kháng thể ung thƣ gan Glypican 3 Sigma

Tổng hợp hạt trần nano oxít sắt từ fe 3 o 4 bằng phương pháp đồng kết tủa

Từ sự kế thừa các kết quả nghiên cứu thực nghiệm của nhóm nghiên cứu trước đây, chúng tôi tiến hành tổng hợp hạt nano oxit sắt Fe3O4 theo thường quy tối ưu:

Hình 2.1 Mẫu γ -Fe 3 O 4 và Fe 3 O 4 sau khi sấy và nghiền mịn

– Hạt nano được tổng hợp bằng phương pháp đồng kết tủa và có sự thay đổi về tỷ số mol Fe 3+ :Fe 2+ = 1,75:1, theo đó 7,5684 g FeCl3.6H2O và 3,1736 g FeCl 2 4H2O đƣợc hòa tan trong 320ml nước cất bằng khuấy cơ trong 30 phút trong môi trường khí N2, nhiệt độ của hỗn hợp dung dịch duy trì ở 70 o C

– 50 ml dung dịch NH3.H2O đƣợc thêm nhanh vào hỗn hợp dung dịch trên (pH ~ 9,5) và khuấy thêm 1 giờ nữa cũng trong môi trường khí N2 và ở nhiệt độ 70 o C để phản ứng xảy ra hoàn toàn

– Để hỗn hợp dung dịch nguội đến nhiệt độ phòng, các hạt kết tủa đƣợc rửa nhiều lần bằng nước cất và được tách bằng nam châm

– Các hạt kết tủa được sấy khô trong môi trường chân không ở 70 o C.

Quy trình tổng hợp hạt ôxít sắt bọc SiO 2

– Tetraethyl orthosilicate –TEOS (Merck) – Amoniac –NH4OH (Merck)

– Nước cất hai lần –H2O (Tại phòng Vật liệu mới và cấu trúc nano – Viện Vật lý)

Các dụng cụ thí nghiệm: Tương tự như giai đoạn tạo hạt trần

– Đầu tiên cho 20mg Fe3O4 và 8ml H2O siêu âm 30 phút

– Cho vào hỗn hợp trên 32ml ethanol + 2ml NH3 tiếp tục siêu âm 15 phút

– Nhỏ giọt thật chậm TEOS Siêu âm 4 giờ SiO2 đƣợc tạo thành trên bề mặt các hạt nano Fe3O4 thông qua sự thủy phân và ngƣng tụ TEOS

– Các hạt đƣợc tạo thành thì đƣợc quay ly tâm với tốc độ 4000 rpm khoảng 5 phút, sau đó các hạt nano từ Fe3O4@SiO2 thu được bằng tách từ và được rửa với nước khử ion và ethanol, riêng rẽ, khoảng 5 lần để lấy đi các chất phản ứng dƣ thừa các hạt từ, dung dịch từ thì được pha loãng với nước, alcohol và NH4OH Rung siêu âm hỗn hợp trên trong bồn nước để chúng đồng nhất với nhau

– Sấy khô ở 70 o C thu đƣợc các hạt nano từ lõi-vỏ

Một số phản ứng thuỷ phân TEOS (bọc lớp vỏ SiO2 cho mẫu hạt trần Fe3O4)

NH3 + H2O  NH4OH Si(OC2H5)4+C2H5OH+H2O  [Si(OH)4]n xC2H5OH.H2O [Si(OH)4]n.xC2H5OH.H2O  SiO2 + C2H5OH + H2O

Chức năng hóa bề mặt hạt nano Fe 3 O 4 @SiO 2 với aptes và glutaraldehyde

– APTES – Glutaraldehyde – Ethanol – C2H5OH – Nước cất hai lần – H2O

– Nhỏ chậm 0,4 ml APTES (Siêu âm 2 giờ)

– Lắng hạt bằng nam châm và rửa bằng ethanol và nước Sấy khô ở nhiệt độ 70 o C

– Lắng hạt bằng nam châm và rửa bằng ethanol và nước Sấy khô ở nhiệt độ 70 o C

– 20mg hạt nano Fe3O4@SiO2 APTES + 5ml glutaraldehyde Lắc 12 giờ

– Lắng hạt bằng nam châm và rửa bằng ethanol và nước Sấy khô ở nhiệt độ 70 o C.

Kiểm tra độ tinh thể của kháng thể bằng phương pháp điện di trên gel

– Acrylamide – Bis-crylamide – Tris base

– Bromophenol – Methanol – Bromophenol blu – Coomassie R250 – b-mercaptoethanol – Acetic axit

– Thang protein chuẩn: Board Range (161–0317, BioRad) – Kháng thể NS1-dengue 3

– Đỗ gel phân tích có nồng độ acryamid 12%-SDS Chờ cho gel polymer hóa Đặt lƣợc vào gel để tạo các giếng Đổ gel tụ chụm có nồng độ acryamid 4%–SDS Khi gel đông lấy lƣợc ra và lắp gel vào bình điện di

– Cho dung dịch đệm vào điện di

– Cho mẫu IgG xử lý với xanh glycerol-SDS vào trong các giếng

– Đậy nắp điện di, lắp nguồn điện Chạy điện di ở 110 V, 90 mA

– Khi vạch xanh đến đáy thùng Tắt nguồn

– Nhuộm với dung dịch Comassive trong 10 phút Tẩy gel bằng dung dịch tẩy.

Xác định nồng độ kháng thể bằng phương pháp Bradford

– Serva Blue G – Ethanol – H3PO4 85% (đệm PBS) – Các phiến nhựa ELISA – Dung dịch IgG chuẩn (500–0005, BioRad)

– Dung dịch IgG chuẩn: pha trong đệm PBS (dải nồng độ đi từ 0 – 32 g/ml)

– Dung dịch IgG chuẩn và dung dịch IgG mẫu đƣợc ủ với dung dịch Bradford trong 5 phút ở nhiệt độ phòng

– Hấp thụ quang của các dung dịch được đo ở bước sóng 595 nm

– Dựng đường chuẩn dựa trên IgG chuẩn và độ hấp thu của nó

– Dựa trên đường chuẩn xác định nồng độ của dung dịch IgG chưa biết

– Dùng phần mềm KC4 để xác định hàm lƣợng có trong mẫu.

Cộng hợp kháng thể lên hạt từ

– Huyền phù hạt từ bằng phương pháp lắc xoáy, thời gian: 30 phút

– Thêm kháng thể, ủ qua đêm ở nhiệt độ phòng – Rửa hạt từ bằng đệm PBS-1% Tween 20 (3 lần), bảo quản 4C

– Huyền phù lại hạt từ trong đệm PBS-1% Tween 20-0,1%BSA Bảo quản phức hạt từ kháng thể ở 4C

Trong phương pháp miễn dịch từ, kháng thể được cố định trên bề mặt từ đóng vai trò quan trọng quyết định khả năng bắt giữ tế bào vi sinh vật mục tiêu Do đó, để kháng thể sau khi gắn và bề mặt hạt từ đƣợc ổn định trong suốt thời gian ứng dụng không bị thay thế bằng phân tử sinh học khác cần thực hiện thông qua liên kết đồng trị [22]

Trong đề tài, tôi chọn nhóm amin (–NH2), để thực hiện phản ứng cộng hợp vào hạt từ bởi vì:

– -amin béo của lysine là nhóm phản ứng phổ biến nhất trên phân tử kháng thể

Hầu nhƣ tất cả các kháng thể đều chứa rất nhiều lysine, với tần suất cao thứ năm trong

20 axit amin tự nhiên Một phân tử IgG điển hình có chứa khoảng 90 lysine, trong đó có khoảng 30 phân tử được biến đổi dưới các điều kiện nồng độ hóa chất acyl hóa cao và thời gian ủ dài

– Nhóm –NH2 trên lysine ái nhân khá tốt ở pH trên 8 (pKa = 9,18) do đó phản ứng dễ dàng và nhanh chóng với một số hóa chất để tạo nối đồng trị

Hình 2.2 Cơ chế cộng hợp kháng thể lên hạt từ [57]

Xác định hiệu suất cộng hợp

Hiệu suất cộng hợp là tỉ số phần trăm giữa hàm lƣợng kháng thể gắn lên hạt từ và lượng kháng thể trước khi cộng hợp (với: lượng kháng thể gắn lên hạt từ là lượng kháng thể trước cộng hợp trừ đi lượng kháng thể có trong nước nổi sau khi cộng hợp được xác định bằng phương pháp Bradford

Hiệu suất cộng hợp đƣợc tính nhƣ sau: 1

Với A1: lƣợng kháng thể gắn lên hạt từ

A2: lượng kháng thể trước khi cộng hợp.

Phương pháp tách miễn dịch từ (IMS)

– Phức hợp hạt từ - kháng thể

– Lắc xoỏy dung dịch hạt từ - khỏng thể cho đến khi cặn phõn tỏn đều và hỳt 2 àl hỗn dịch này vào từng eppendorf 1,5 ml

– Thêm 1 ml mẫu môi trường tiền tăng sinh hay dãy vi khuẩn pha loãng vào Thay pipet cho từng mẫu

– Đặt các eppendorf này vào máy HulaMixer, lắc đảo các eppendorf để trộn đều mẫu và hạt từ - kháng thể trong 10 phút ở nhiệt độ phòng

– Đặt các eppendorf vào giá mẫu của DynaMag-2 Để yên 3 phút Mở nắp ống và hút bỏ nước nổi Thay pipet cho từng mẫu Lấy thanh từ khỏi DynaMag-2

– Thêm 1ml đệm rửa Đậy nắp, lắc vài lần để trộn đều

– Loại bỏ đệm rửa sử dụng nam châm DynaMag-2

– Rửa lặp lại nhƣ trên 2 lần

– Sau cựng huyền phự phức hợp hạt từ - vi-rỳt trong 100 àl đệm rửa hay NaCl 0,9% Sau đó lắc xoáy

– Phức hợp hạt từ - vi-rút được cấy trực tiếp lên môi trường thạch chọn lọc hay nuôi cấy trong môi trường tăng sinh chọn lọc.

KẾT QUẢ VÀ ĐỀ NGHỊ

Khảo sát lớp vỏ bọc silica trên mẫu F2

Sử dụng mẫu F2 để tiến hành bọc silica tạo mẫu FS Sau khi mẫu FS đƣợc sấy khô, rồi đem nung ở 600 o C và đem phân tích FT-IR Hình 3.4, ta thấy xuất hiện các đỉnh mới ở vùng số sóng 1080 cm –1 là các số sóng hấp thụ đặc trƣng của các dao động hóa trị và dao động biến dạng của liên kết Si–O–Si, chứng tỏ rằng có sự tạo thành mạng SiO2.

Số sóng tại 803 cm –1 đặc trƣng của liên kết SiO 4 Ngoài ra, ta thấy đỉnh hấp thụ ở số sóng 576 cm –1 là đặc trƣng của Fe–O đã tách ra thành các đỉnh ở số sóng 633,99 cm –1 và 585,09 cm –1 , cũng nhƣ đỉnh ở số sóng 445,74 cm –1 đã dịch nhỏ sang vùng số sóng cao, điều này chứng tỏ có sự tương tác giữa Fe và Si hình thành các liên kết Fe–O–Si

Nh ận xét : T ừ nh ững đỉ nh h ấ p th ụ trên, ta có thể k ế t lu ậ n r ằ ng SiO 2 đã bao phủ thành công trên bề m ặ t c ủ a h ạ t F2

Hình 3.4 Phổ hồng ngoại của mẫu FS

3.2.2 Khảo sát lƣợng TEOS nhỏ vào

Ethanol Amoniac Nước Thời gian TEOS Môi trường thí nghiệm FS6

Bảng 3.1 Khảo sát lượng TEOS nhỏ vào của mẫu FS6, FS4, FS2

Hình 3.5 Ảnh TEM của mẫu với lượng TEOS 0,6 ml FS6; 0,4 ml FS4; 0,2 ml FS2 ở thang đo 200nm (trên) và thang đo 20nm (dưới)

Nhận xét : Giảm lượng TEOS độ phân tán không cao, nhưng độ mỏng của vỏ giảm đi khá nhiều

Ethanol Amoniac Nước Thời gian TEOS Môi trường thí nghiệm FS2

Bảng 3.2 Khảo sát lượng TEOS nhỏ vào của mẫu FS2, FS1, FS05

Hình 3.6 Ảnh TEM của mẫu với lượng TEOS 0,2ml FS2; 0,1ml FS1; 0,05ml FS05 ở thang đo 200nm (trên) và thang đo 20nm (dưới)

K ế t lu ậ n: Đố i v ớ i m ẫ u FS, q uan sát ả nh TEM ta th ấ y r ất rõ cấu trúc lõi -v ỏ c ủ a h ạ t Fe 3 O 4 @SiO 2 Ch ứ ng t ỏ quá trình phủ SiO 2 r ất thành công Hạt có dạng hình c ầ u v ới kích thướ c h ạt trung bình khoảng 20 nm và tương đối đồng đề u

3.2.3 Phổ từ kế mẫu rung – VSM của các mẫu hạt từ F2, FS1, FS2, FS4

Tính chất từ của các mẫu FS tạo thành thể hiện trên hình 3.7 Nhìn vào đường cong từ hóa, ta thấy ở ba mẫu đều cho thấy lực kháng từ và độ từ dƣ gần tiến tới không, điều này chứng tỏ rằng các mẫu tạo thành đều có tính siêu thuận từ

Quan sát đường màu xanh dương cho ta kết quả độ từ hóa của mẫu FS1 với lượng TEOS 0.1ml là khoảng 46.61 emu/g; đường màu xanh lá ứng với mẫu FS2 với lượng TEOS 0.2ml có độ từ hóa là 21.33 emu/g; đường màu hồng với lượng TEOS 0.4ml ứng với mẫu FS4 có độ từ hóa là 11.32 emu/g

Nhận xét : Ta thấy rằng độ từ hóa tăng dần khi ta giảm lượng TEOS

Hình 3.7 Phổ từ kế mẫu rung – VSM mẫu F2 khảo sát với mẫu FS4, FS2, FS1

Mẫu TEOS Độ từ hóa cực đại M max

FS4 0,4 ml 11,32 0,0045 Độ từ hóa bão hòa của mẫu FS1 khá cao so với hai mẫu FS2 và FS4

Bảng 3.3 Độ từ hóa bão hòa của mẫu FS1, FS2 và FS4

3.2.4 So sánh phổ từ kế mẫu rung – VSM của các mẫu hạt từ trước và sau khi chức năng hóa bề mặt

Tính chất từ của các mẫu đã tạo thành thể hiện trên hình 3.8 Nhìn vào đường cong từ hóa trên, ta thấy ở cả ba đường cong đều cho thấy lực kháng từ và độ từ dư bằng không, điều này chứng tỏ rằng các mẫu tạo thành đều có tính siêu thuận từ

Quan sát đường màu đen cho ta kết quả độ từ hóa của mẫu F2 là khoảng

62 emu/g; đường màu đỏ ứng với mẫu FS có độ từ hóa là 45 emu/g; đường màu xanh ứng với mẫu FSA có độ từ hóa là 34 emu/g

Ta thấy rằng độ từ hóa giảm dần khi ta lần lƣợt phủ các lớp SiO2 và APTES bên ngoài

Hình 3.8 VSM mẫu F2, FS và FSA

Nhận xét : Kết quả trên cho thấy, sau khi gắn APTES, hạt mẫu FSA vẫn đảm bảo tính chất từ để ứng dụng trong y sinh học

3.2.5 Phương pháp nhiệt trọng lượng TGA

Hình 3.9 là kết quả đo TGA của mẫu hạt F2 đo ở môi trường khí N2, khối lượng mẫu 30,28mg, tốc độ gia nhiệt 10 o C/phút hình ảnh cho thấy nhiệt độ chuyển pha của mẫu hạt ở 74,31C tương ứng với phần trăm khối lượng phân hủy 82,17% (24.89 mg)

Khi nhiệt độ phân tích nhiệt tăng đến khoảng 95 o C, khối lƣợng mẫu giảm mạnh còn 86%, sau đó giảm dần (đường màu đỏ TG), đường DTG (màu xanh) đạo hàm của

TG cho thấy tốc độ giảm khối lƣợng tăng mạnh và đạt đỉnh tại 74.31 o C, sau đó giảm mạnh khi nhiệt độ tiến dần đến 95 o C và ổn định xấp xỉ 0.0 khi nhiệt độ tăng cao hơn

400 o C Kết quả trên cho thấy mẫu có độ bền nhiệt thấp, mẫu phân hủy mạnh và ổn định khi nhiệt độ đạt 400 o C

Hình 3.9 TGA của mẫu hạt FS

Hình 3.10 là kết quả đo TGA của mẫu hạt nano oxit sắt FS đo ở môi trường khí

N2, khối lƣợng mẫu 21,6210 mg, tốc độ gia nhiệt 10 o C/phút Độ chênh lệch giữa 2 lần mất khối lƣợng là 4.5% (7,6% – 3.1%) và dƣ lƣợng là 89.14%

Khi nhiệt độ phân tích nhiệt tăng đến khoảng 150 o C, khối lƣợng mẫu giảm mạnh còn 92%, sau đó giảm dần (đường màu đỏ TG)

Hình 3.10 TGA của mẫu hạt FSGA

Mẫu FSAG bị mất khối lƣợng 6.2% ở nhiệt độ 35 – 198 o C chủ yếu do mất mát của các chất hấp thụ nước trên bề mặt vật liệu

Phần còn lại không bay hơi trong khí quyển oxi hóa bao gồm chất độn và chất gia cường silica

Nhận xét : Từ tất cả các kết quả trên, chúng tôi cho rằng đã có sự tồn tại của APTES và glutaraldehyde trên bề mặt hạt Fe 3 O 4 @SiO 2

3.3 Ứng dụng các hạt nano từ tính với các lớp kháng thể trê bề mặt ứng dụng trong chẩn đoán bệnh truyền nhiễm

3.3.1 Chẩn đoán bệnh bệnh sốt xuất huyết với kháng thể NS1

3.3.1.1 Xác định thành phần protein trong kháng huyết thanh thương mại bằng phương pháp điện di SDS-PAGE 10%

Tên thương mại: Anti-Dengue NS3 glycoprotein antibody Hãng sản xuất: Abcam R Đây là kháng thể đơn dòng làm từ chuột (monoclonal muose)

Loại kháng thể IgG1 Điện di SDS–PAGE 12% để xác định thành phần protein của kháng huyết thanh thương mại

– Kháng thể đối NS3 có thể nhận biết đƣợc cả 2 loại virút sốt xuất huyết (16681 với NGC).

– Kháng nguyên virut này là một chất nhị trùng (dimer) nên nếu ko tách ra (bằng cách đun sôi) thì trọng lƣợng phân tử sẽ gấp đôi (khoảng 80K dalton; mỗi con kháng nguyên nặng khoảng 40,08K dalton

Chiết xuất toàn bộ tế bào của virút Dengue type 3 nhiễm tế bào BHK-21

Dãy 1: Đối chứng dương là protein abumin, kiểm tra khả năng hoạt động hệ  chạy ổn định

Dãy 2: Kháng thể NS3, 75kD

Hình 3.11 Phương pháp phân tích Gel Western blot của kháng thể NS3

3.3.1.2 Miễn dịch huỳnh quang với kháng thể thương mại NS3 Đầu tiên bôi (stain) tế bào bị nhiễm NS3 bằng cytofix/cytoderm để tế bào sáng lên

Ngâm trong dung dịch với kháng thể đối NS3 Kháng thể là đơn dòng từ chuột, nên sau khi cho kháng thể bám vô tế bào bị truyền nhiễm, đem ngâm thêm một dung dịch kháng thể thứ 2 Kháng thể thứ 2 này sẽ bám vô tế bào mô có kháng thể chuột

Kháng thể thứ 2 này đƣợc nhuộm thêm Alexa fluoro

 Nồng độ, hiệu suất hoạt động của kháng thể là 95%

Xanh dương là nhân tế bào BHK-21 Xanh lá cây là các tế bào bị nhiễm NS3 Hình 3.12 Miễn dịch huỳnh quang kháng thể NS3-DN3 Tỷ lệ 1:5000

3.3.2 Khảo sát chọn nồng độ kháng thể NS3 liên kết vào hạt từ 3.3.2.1 Độ hấp thu của kháng thể NS3

Từ các mẫu chuẩn suy được phương trình f(x) = 0,0902x + 0,003 ; R 2 = 0,988, từ phương trình suy được nồng độ NS3 thuộc phần nổi

Bảng 3.4 Độ hấp thu của kháng thể NS3

Hình 3.13 Đồ thị đường chuẩn kháng thể NS3

3.3.2.2 Chọn nồng độ kháng thể NS3 liên kết vào hạt từ

Mật độ của kháng thể vào hạt từ là yếu tố quyết định hiệu quả liên kết của hạt từ với vi-rút sau này Theo hướng dẫn từ nhà sản xuất, nồng độ gắn lên hạt tối đa là 400 g/ml đối với hạt có đường kính trên 100 nm Do đó, chúng tôi tiến hành gắn kháng thể ở các nồng độ khác nhau nhƣng không vƣợt quá nồng độ khuyến cáo của nhà sản xuất

Lượng kháng thể cần sử dụng phải tối ưu vì đây là sinh phẩm có giá thành tương đối cao nhƣng vẫn phải đảm bảo khả năng gắn kết với hạt từ

Kháng thể NS3 trước cộng hợp A 2

Bảng 3.5 Hiệu suất cộng hợp kháng thể và hạt từ

Nhận xét : Kết quả cho thấy F S 2 bám dính tốt với kháng thể ở điều kiện lượng khỏng thể 200 àg/ml hạt và mẫu FS1 bỏm dớnh tốt với khỏng thể ở điều kiện lượng khỏng thể 100 àg/ml hạt

3.3.2.3 Khảo sát đối chứng giữa kết quả xét nghiệm ELISA có sử dụng hạt nano từ với kết quả Viện Pasteur và Viện Y tế cộng đồng

Nồng độ NS3 (ng/mL serum)

Kết quả xét nghiệm ELISA sử dụng hạt nano từ

Bảng 3.6 Kết quả xét nghiệm ELISA có sử dụng hạt nano từ với kết quả Viện Pasteur

Nồng độ NS3 (ng/mL serum)

Kết quả xét nghiệm ELISA sử dụng hạt nao từ

Kết quả Viện Y tế cộng đồng

Bảng 3.7 Kết quả xét nghiệm ELISA có sử dụng hạt nano từ với kết quả Viện y tế cộng đồng

- Gắn được kháng thể NS1 lên hạt từ để chẩn đoán bệnh sốt xuất huyết

- Kết quả so sánh với xét nghiệm Viện Pasteur trùng khớp 60%

- Kết quả so với xét nghiệm tại Viện Y tế cộng đồng trùng khớp 80%

3.3.3 Chẩn đoán ung thƣ gan với Glypican 3 3.3.3.1 Gắn Glypican 3 lên hạt từ

Glypican 3 (ng/mL) 0,00 1,60 4,00 6,40 8,00 16,00 32,00 64,00 Abs-595nm 0,000 0,075 0.130 0.193 0.275 0.5 1.001 1.685

Bảng 3.8 Độ hấp thu của các mẫu Glypican 3 chuẩn

Từ các mẫu chuẩn suy được phương trình f(x) = 0,0266x + 0,0439 ;

R 2 = 0,9919, từ phương trình suy được nồng độ Glypican 3 thuộc phần nổi

Hình 3.14 Đồ thị đường chuẩn Glypican 3

Hạt nano (mg) Cấu trúc

Nồng độ Glypican 3 (ng/mL) Độ hấp thu 595nm

Glypican3 không dính (ng/mL)

Bảng 3.9 Hiệu suất bám dính Glypican 3 trên một số cấu trúc hạt nano

3.3.3.2 Khảo sát đối chứng giữa kết quả xét nghiệm ELISA có sử dụng hạt nano từ với kết quả siêu âm gan tại Bệnh viện Ung bứu Cần Thơ

Kết quả xét nghiện trên 14 mẫu bệnh phẩm do Bệnh viện Ung Bướu Cần Thơ cung cấp bằng phương pháp ELISA có sử dụng hạt nano từ

Bảng 3.10 Kết quả xét nghiệm ELISA có sử dụng hạt nano từ với kết quả Bệnh viện ung bứu Cần Thơ

– G ắn được kháng thể Glypican 3 lên hạ t t ừ ch ẩn đoán bệnh ung thư gan

– Kết quả so sánh với kết quả siêu âm gan tại Bệnh viện Ung bứu Cần Thơ : có 10/14 cho kết quả đúng

– Hiệu s uất cho kết quả đúng là 70%

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Nồng độ Glypican3 (ng/mL serum)

Kết quả xét nghiệm ELISA có sử dụng hạt nano từ

Kết quả siêu âm gan

Kết luận chung

Thử nghiệm và tổng kết quy trình tối ƣu bọc silica (SiO2) lên hạt nano oxit sắt

Fe3O4 với dạng hình cầu, có kích thước 20nm độ từ hóa bão hòa sau khi bọc SiO2 tương đối cao là 46 emu/g

Lớp phủ SiO2 đồng đều, ổn định và khá mỏng

Gắn đƣợc APTES, Glutaraldehyde lên bề mặt hạt nano

Kết luận 2: GẮN KHÁNG THỂ LÊN HẠT TỪ ỨNG DỤNG ĐỂ CHẨN ĐOÁN BỆNH TRUYỀN NHIỄM

Gắn đƣợc kháng thể NS1 lên hạt từ để chẩn đoán bệnh sốt xuất huyết đạt hiệu suất chính xác 60% - 80 %

Gắn đƣợc kháng thể Glypican 3 lên hạt từ chẩn đoán bệnh ung thƣ gan đạt hiệu xuất chính xác 70%

Kiến nghị

Trong giai đoạn nghiên cứu cần đƣợc tiếp tục Đo đạc thêm 1 H-NMR, XPS để xác định cấu trúc hóa học cũng nhƣ liên kết của các chất hữu cơ trên bề mặt hạt bao gồm APTES, Glutaraldehyde

Sử dụng hạt từ để gắn thêm một số kháng thể để chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm cho kết quả lâm sàng

1 Bs Lê Xuân Thủy, Cách phòng bệnh Sốt xuất huyết Cục y tế dự phòng, Bộ y tế,

2 Gs Phạm Hoàng Phiệt, Miễn dịch – sinh lý bệnh NXB Y học TP.HCM

3 Nguyễn Thị Nguyệt Thu Tách chiết, phân tích các aflatoxin trong thực phẩm và dược liệu bằng sắc kí ái lực miễn dịch và sắc kí lỏng hiệu năng cao Trường Đại học Dƣợc Hà Nội, 2011

4 PGS TS Nguyễn Hoàng Hải, Ứng dụng hạt nano từ tính oxit sắt Khoa Vật lý, Trường ĐH Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội

5 Phan Văn Bé Bảy, Hoàng Tiến Mỹ Elisa to detect NS1 antigen for the diagnosis of

Dengue fever and Dengue haemorrhagic fever Y học thành phố Hồ Chí Minh

6 Phòng Xét nghiệm Y khoa NK-BIOTEK Xét nghiệm phát hiện và định type Dengue để chẩn đoán sớm Sốt Dengue và Sốt xuất huyết Dengue, 2009

7 Composed by J B Calvert, The metal of Mars gives us magnetism and life, 2002

8 Chen, J.P., et al., Targeted delivery of tissue plasminogen activator by binding to silica-coated magnetic nanoparticle Int J Nanomedicine, 2012 7: p 5137-49

9 Chikazumi S., B.J., Physics of Ferromagnetism Oxford: Clarendon Press, 1997: p

10 Christian Pfeiffer, Christoph Rehbock, Dominik Hühn, Carolina Carrillo-Carrion, Dorleta Jimenez de Aberasturi, Vivian Merk, Stephan Barcikowski, Wolfgang J

Parak, Interaction of colloidal nanoparticles with their local environment: the (ionic) nanoenvironment around nanoparticles is different from bulk and determines the physico- chemical properties of the nanoparticles, 2014.

11 Epidemic and Pandemic Alert and Response (EPR)/WHO Dengue/dengue haemorrhagic fever, 2015

12 Gao, S., et al., Synthesis and Characterization of Fe(10)BO3/Fe3O4/SiO2 and GdFeO3/Fe3O4/SiO2: Nanocomposites of Biofunctional Materials

13 Gilchrist R K, Medal R, Shorey W D, Hanselman R C, Parrott J C and Taylor C B

1957 Selective inductive heating of lymph nodes Ann Surg 146 596–606

14 Granov A M, Muratov O V and Frolov V F Problems in the local hyperthermia of inductively heated embolized tissues Theor Foundations Chem Eng 36 63–6,

15 Greg T Hermanson, A.K.M., Paul Keith Smith, Immobilized Affinity Ligand Techniques Academic Press 1992

16 Jatin M Vyas, MD, PhD, Associate Professor in Medicine, Harvard Medical School; Assistant in Medicine, Division of Infectious Disease, Department of

Medicine, Massachusetts General Hospital, Boston, MA, MedlinePlus Medical Encyclopedia Dengue Hemorrhgic Fever, 2014

17 Jaime Eduardo Castellanos, Carolina Coronel-Ruiz, Dengue disease diagnosis: A puzzle to be solved 2014

18 J Pan and Q Yang, Antibody-funtionalized magnetic nanoparticles for the detection of carcinoembryonic antigen using a flow-injection electrochemical device Analytical and Bioanalytic Chemistry, 2007 388(1): p 279-286

19 Joan Estelrich 1, Elvira Escribano 2, Josep Queralt 3 and Maria Antònia Busquets,

Iron Oxit Nanoparticles for Magnetically-Guided and Magnetically-Responsive Drug Delivery, International Journal of Molecular Sciences, Int J Mol Sci 2015

20 Ki Do Kim, et al., Formation and surface Modification of Fe3O4 Nanoparticles by

Co – Precipitation and Sol-gel Method J Ind Eng Chem, 2007 13

21 Laval J M., Mazeran P.E., and Thomas D, Nanotechnology and its role in the development of new analytical devices 2000 Analyst 125(1): p 29-33

22 Leslie-Pelecky D., et al., Nanobiomagnetics in Advanced Magnetic

23 Ling Sun, Shuchao Hu, Hongmei Sun, Huiling Guo, Hongda Zhu, Mingxing Liu and Honghao, Sun Malachite green Adsorption onto Fe3O4@SiO2-NH2:

Isotherms, Kinetic and Process Optimization, 2012

24 Lide, David CRC Handbook of Chemistry and Physics 2000

25 Media Center/WHO Dengue and dengue haemorrhagic fever, may 2015

26 M Tajabadi, M.E Khosroshahi, New Finding on Magnetite Particle Size Reduction by Changing Temperature and Alkaline Media Concentration, APCBEE

27 M.Yamaura, R.L Camilo, L.C Sampaio, M.A Macedo, M.Nakamura, H.E Toma,

Preparation and characterization of (3-aminopropyl) triethoxysilane-coated magnetite nanoparticles, Journal of Magnetism and Magnetic Materials 279 (2004)

28 M S Krakov (1993), Magnetic fluid, Oxford University press, New York

29 Normile D Tropical medicine Surprising new dengue virus throws a spanner in disease control efforts Science 342 (6157): 415, 2013

30 Ozaki., M., Formation of Magnetic Particles, in Fine Particles T Sugimoto, Ed

New York: Marcel Dekker, Inc., p 662-682, 2000

31 Pankhurst, Q.A., J Connolly, S.K Jones, and J Dobson, 36 (2003) R167.], J

32 P Davies, J Popplewell, G Martin and R.W Chantrell, Monte Carlo simulation of the sttrure of magnetic fluid composites, Appl Phý., 19(469), 1986

33 Perry, R; Green D, Maloney J Perry's Chemical Engineers' Handbook Book

34 Perera R, Kuhn RJ Structural proteomics of dengue virus Current Opinion in Microbiology 11 (4): 369–77, 2008

35 Thermo Scientific Crosslinking Technical Handbook Picercenet

36 Q.A Pankhurst, J Connolly, S K Jones and J Dobson , Application of magnetic nanoparticles in biomedicine, Appl Phys., 36(13), p167-181, 2003

37 Reilly J P., Principles of nerve and heart excitation by time-varying magnetic fields Ann New York Acad Sci 649 96–117, 1992

38 Rosensweig R E, Heating magnetic fluid with alternating magnetic field J Magn

39 R Khatiri, A Reyhani, S.Z Mortazavi, M Hossainalipour, Immobilization of serum albumin on the synthesized three layers core–shell structures of super- paramagnetic iron oxit nanoparticles, Journal of Industrial and Engineering Chemistry, 19, 1642-1647, 2013

40 Rodenhuis-Zybert IA, Wilschut J, Smit JM "Dengue virus life cycle: viral and host factors modulating infectivity" Cell Mol Life Sci 67 (16): 2773–86, 2010

41 Safarík I1, Safaríková M, Forsythe SJ The application of magnetic separations in applied microbiology, J Appl Bacteriol.;78(6):575-85, 1995

42 Senyei A, W.K.a.C.C., Magnetic guidance of drug carrying microspheres J.Appl

43 U, M.K.a.S.o., Preparation and application of magnetic polymers for targeting of drugs FEBS Lett 102 p 112–6, 1979

44 Whitesides G M and Zhang X , Enviroment technology Nat biotech, 2003 21: p

45 Xiang-Hong Peng, Ximei Quian, Hui Mao A Y Wang, Zhuo (Georgia) Chen, Shuming Nei, D M Shin, Targeted magnetic iron oxit nanoparticles for tumor imaging and therapy, International Joural of Nanomedicine, p1311-p321, 2008

46 Xianqiao Liu, Zhiya Ma, Jianmin Xing, Huizhou Liu, Preparation and characterization of amino–silane modified Superparamagnetic silica nanospheres,

Journal of Magnetism and Magnetic Materials 270 (2004) 1–6], 2004

47 X Xue, J Wang, L Mei, Z Wang, K Qi, B Yang, Recognition and enrichment specificity of Fe3O4 magnetic nanoparticles surface modified by chitosan and Staphylococcus aureus enterotoxins A antiserum, Colloids Surf B Biointerfaces,

48 X Wang, G Zhou, H Zhang, S Du, Y Xu, C Wang, Immobilization and catalytic activity of lipase on mesoporous silica prepared from biocompatible gelatin organic template, Journal of Non-Crystalline Solids, 357, 3027-3032, 2011

49 X.C Shen, X.Z Fang, Y.H Zhou, H Liang, Synthesis and characterization of 3- amino propyl triethoxy silane - modified super paramagnetic magnetite Nanoparticles, Chemistry Letters, 33, 1468-1469, 2004

50 Weiwei Huang, Xin Yang, Song Zhao, Min Zhang, Xinglong Hu, Jing Wang and Haitian Fast and selective recognizes polysaccharide by surface molecularly imprinted film coated onto aldehyde-modified magnetic nanoparticles Zhao,

51 WHO Dengue haemorrhagic fever: diagnosis, treatment, prevention and control

52 Yunkai Zhu, Ying Sun, Yaqing Chen, Weiyong Liu, Jun Jiang, Wenbin Guan, Zhongyang Zhang and Yourong Duan, In Vivo Molecular MRI Imaging of Prostate Cancer by Targeting PSMA with Polypeptide-Labeled Superparamagnetic Iron Oxit Nanoparticles, Int J Mol Sci 2015, 16, 9573-9587

53 http://www.dieutri.vn/truyennhiem/25-4-2011/S203/Benh-truyen- nhiem.htm#ixzz3unnvQW1X

54 http://www.who.int/csr/disease/dengue/en/

55 http://www.bc.edu/schools/cas/biology/research/insect/dengue

56 http://www.ipt.acr.nasa.gov/nanotechnology.html

57 https://www.lifetechnologies.com/vn/en/home/life-science/protein-biology/protein- biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein- methods/covalent-immobilization-affinity-ligands.html

Một số ứng dụng của hạt nano từ tính

Bảng 1: Hạt nano từ tính bao bọc bởi các polymer tự hủy sinh học Chất mang Ứng dụng sinh học

Dẫn thuốc Tách tế bào

Poly(lactic axit) Xạ trị

Cố định enzym MRI Đốt nhiệt từ Dẫn thuốc

Bảng 2: Hạt nano từ tính bao bọc bởi các polymer thường

Ethyl-cellulose Thâm nhập động mạch

Tách tế bào, siêu vi, kí sinh trùng

Bảng 3: Một số loại polymer thường dùng để chức năng hóa bề mặt hạt nano từ tính

Polyethylene glycol Tăng thời gian lưu thông trong hệ tuần hoàn

Dextran Tăng thời gian lưu thông trong hệ tuần hoàn

Polyvinylpyrrolidone Tăng thời gian lưu thông trong hệ tuần hoàn

Fatty axits Ổn định hệ huyền phù, cung cấp nhóm carboxyl

Polyvinyl alcohol (PVA) Giúp hạt đồng nhất

Polyacrylic axit Tương hợp sinh học

Polypeptides Sinh học tế bào, dẫn thuốc

Phosphorylcholine Ổn định hệ huyền phù

Poly (D, L- lactide) Tương hợp sinh học

Poly(N-isopropylacryl amide) Dẫn thuốc, tách tế bào Chitosan Ứng dụng nhiều trong nông nghiệp, dƣợc phẩm

Gelatin Tương hợp sinh học

Bảng 4: Thống kê kết quả xét nghiệm và so sánh kết quả (độc lập) ở bệnh viện