TỔNG QUAN
Sinh lý quá trình đông máu
Đông máu là trạng thái tự bảo vệ của cơ thể, là chuỗi các phản ứng hóa học của các yếu tố đông máu có trong huyết tương, các mô tổn thương và tiểu cầu [25,36,39] Sau khi ra khỏi lòng mạch 2 - 4 phút, máu đông lại Trong máu và trong các mô có khoảng hơn 50 chất có ảnh hưởng tới quá trình đông máu Các chất kích thích quá trình gây đông máu gọi là các chất gây đông máu Các chất ức chế quá trình gây đông máu gọi là các chất chống đông
Máu có đông hay không là phụ thuộc vào sự cân bằng giữa các chất gây đông máu và các chất chống đông máu Bình thường, các chất chống đông máu chiếm ƣu thế, các chất gây đông ở dạng tiền chất không có hoạt tính, vì vậy máu không đông trong quá trình lưu thông trong mạch máu Khi máu, mạch máu bị tổn thương, khi máu lấy ra ngoài cơ thể, các chất gây đông máu được hoạt hóa và trở nên ƣu thế, đông máu đƣợc thực hiện [11,15,25,36]
1.1.1 Định nghĩa Đông máu là quá trình chuyển máu ở thể lỏng sang thể đặc, mà thực chất là chuyển fibrinogen ở dạng hòa tan trong huyết tương thành fibrin ở dạng không hòa tan dưới xúc tác của thrombin [20,25]
Lý thuyết dòng thác đông máu từ năm 1979 [15] là sự hoạt hoá theo chuỗi từ các tiền yếu tố zymogen thành dạng enzym hoạt hoá.Quá trình đông máu diễn ra qua 3 giai đoạn (Hình 1.1) [20,25,36]:
- Giai đoạn I: Hình thành phức hợp prothrombinase
- Giai đoạn II: Hình thành thrombin
- Giai đoạn III: Hình thành fibrin
1.1.2.1 Sự hình thành phức hợp prothrombinase
Khởi động cho cơ chế đông máu là sự hình thành phức hợp prothrombinase Đây là một cơ chế rất phức tạp và kéo dài nhất của quá trình đông máu Quá trình được xảy ra khi có chấn thương thành mạch và mô, khi có chấn thương máu, khi có sự tiếp xúc của máu với tế bào nội mạc tổn thương hoặc với sợi collagen của mạch máu, với các mô khác ngoài nội mạc hoặc với bất kỳ vật lạ nào [39,47,51] Phức hợp prothrombinase có tác dụng chuyển đổi prothrombin thành thrombin bằng sự phân cắt liên tục và đặc hiệu [25,51] Cơ chế lắp ráp và chuyển đổi prothrombin thành thrombin có tầm quan trọng đối với sức khoẻ con người, bởi vì sự phát triển thrombin không đủ là nguyên nhân gây bệnh Hemophilia và kết quả sản xuất thrombin quá mức gây nên huyết khối [11,51,54]
Hình 1.1 Sơ đồ quá trình đông máu [15]
Sự hình thành phức hợp prothrombinase theo hai cơ chế ngoại sinh và nội sinh Cơ chế ngoại sinh xuất hiện nếu có chấn thương thành mạch hoặc các mô kế cận Cơ chế nội sinh xuất hiện nếu có chấn thương máu hoặc máu lấy ra ngoài cơ thể từ lòng mạch Các yếu tố tham gia đường đông máu nội sinh có trong lòng mạch, còn một số yếu tố tham gia đường đông máu ngoại sinh không tồn tại trong máu lưu hành trong điều kiện sinh lý bình thường Cả
2 con đường đều có sự tham gia của yếu tố X hoạt hóa (Xh), yếu tố V hoạt hóa
(Vh), phospholipid mô, các phospholipid tiểu cầu và Ca 2+ để tạo thành phức hợp prothrombinase Các yếu tố tham gia vào quá trình đông máu hầu hết được tổng hợp tại gan và giải phóng vào huyết tương dưới dạng tiền chất không hoạt động Có các yếu tố đông máu sau [25,51,54]:
- Yếu tố III: Thromboplastin của mô
- Yếu tố IV: Ion Ca 2+
- Yếu tố VIII: Globulin A chống ƣa chảy máu (antihemophilic globin - AHG)
- Yếu tố IX: Globulin B chống ƣa chảy máu (plasma thromboplastin component - PTC)
- Yếu tố XI: Globulin C chống ƣa chảy máu (plasma thromboplastin antecedent - PTA)
- Yếu tố XIII: Yếu tố ổn định fibrin (fibrin stabilizing factor - FSF)
Trước đây các tác giả thấy rằng có 12 yếu tố đông máu được đặt tên bằng số Lamã Sau này có sự thay đổi: một số yếu tố III, IV, VI không tương ứng với một protein riêng biệt nào, đồng thời lại có một số yếu tố khác đƣợc phát hiện thêm nhƣ: prekellicrein, kininogen có trọng lƣợng phân tử cao [21]
Sự hình thành phức hợp prothrombinase theo cơ chế ngoại sinh
Mô bị tổn thương giải phóng thromboplastin (yếu tố III) và phospholipid từ màng tế bào mô Yếu tố X đƣợc hoạt hoá (X h ) nhờ yếu tố III, yếu tố VIIh (yếu tố VII đƣợc hoạt hoá nhờ yếu tố III), ion Ca 2+ và phospholipid Sự hình thành phức hợp prothrombinase từ yếu tố X h có sự tham gia của yếu tố Vh (yếu tố V đƣợc hoạt hoá nhờ thrombin), ion Ca 2+ và phospholipid Yếu tố V h làm tăng hoạt tính của yếu tố X h Phospholipid đóng vai trò là chất nền còn ion Ca 2+ làm cầu nối giữa các yếu tố (Hình 1.1) [20,47,51]
Sự hình thành phức hợp prothrombinase theo cơ chế nội sinh
Máu bị chấn thương, máu tiếp xúc với collagen hoặc bề mặt vật lạ thì làm hoạt hoá yếu tố XII và giải phóng phospholipid tiểu cầu Yếu tố XIIh chuyển yếu tố XI thành yếu tố XI h (có sự tham gia của yếu tố Fletcher và Fitzgerald) Yếu tố XI h hoạt hóa yếu tố IX thành yếu tố IXh (có sự tham gia của yếu tố tiểu cầu) Yếu tố X đƣợc hoạt hoá có sự tham gia của yếu tố VIIIh
(yếu tố VIII đƣợc hoạt hóa nhờ thrombin), yếu tố IX h , ion Ca 2+ và phospholipid Sự hình thành phức hợp prothrombinase từ yếu tố Xh có sự tham gia của phospholipid, yếu tố V h (yếu tố V đƣợc hoạt hoá nhờ thrombin) và ion Ca 2+ Sự hình thành phức hợp prothrombinase theo cơ chế nội sinh chậm hơn rất nhiều (1 - 6 phút) so với cơ chế ngoại sinh (15 giây) (Hình 1.1) [20,47,51]
Prothrombin là α2 - globulin có trong huyết tương, do gan sản xuất, trọng lượng phân tử 68700, nồng độ trong máu bình thường là 15mg/100ml máu [28,36,47] Khi phức hợp prothrombinase hình thành nó sẽ chuyển prothrombin (yếu tố II), một zymogen không hoạt động thành thrombin (yếu tố IIh) [28,37] Giai đoạn này cũng cần sự có mặt của ion Ca 2+ Sự hình thành thrombin từ prothrombin xảy ra trên bề mặt tiểu cầu và diễn ra rất nhanh, đƣợc tính bằng vài giây [11,28,37] Thrombin là enzym trung tâm trong quá trình đông máu [28,37] Số lƣợng thrombin đƣợc hình thành phải đủ lớn để đảm bảo cho quá trình đông máu nhƣng lại không đƣợc gây huyết khối [11,37]
Ngoài vai trò kích hoạt sự hình thành cục máu đông, thrombin đóng một vai trò điều chỉnh quan trọng trong quá trình đông máu Thrombin kết hợp với thrombomodulin hiện diện trên bề mặt tế bào nội bào tạo thành một phức hợp chuyển đổi protein C thành protein C (protein C hoạt hóa) Protein đồng phân protein S và protein Ch làm suy giảm các yếu tố Vh và VIIIh, do đó hạn chế hoạt động của 2 yếu tố này trong chuỗi đông máu [28,37]
Fibrinogen là một protein hòa tan trong huyết tương do gan sản xuất, trọng lượng phân tử 340000, nồng độ trong máu bình thường là 100 - 700mg/100ml máu [36] Bình thường do kích thước phân tử lớn, fibrinogen rất khó vào dịch kẽ Khi thành mạch tăng tính thấm (mô bị viêm) thì fibrinogen vào dịch kẽ và bị đông lại do các yếu tố gây đông máu cùng vào dịch kẽ [25,47,54]
Thrombin sau khi đƣợc hình thành đã chuyển fibrinogen thành fibrin đơn phân Các fibrin đơn phân tự trùng hợp thành fibrin ở dạng sợi Một mạng lưới fibrin đã hình thành và được ổn định nhờ yếu tố XIII (yếu tố XIII tạo liên kết cộng hóa trị giữa các sợi fibrin) [25,36,47] Giai đoạn này cũng có sự tham gia của ion Ca 2+ Khi mạng lưới fibrin phát triển, các tế bào máu được giữ lại trên lưới fibrin và tạo nên cục máu đông Chính mạng lưới này dính vào vị trí tổn thương của thành mạch để ngăn cản sự chảy máu [11,25,36]
Hình 1.2 Mạng lưới fibrin giam giữ hồng cầu [37].
Điều hòa đông máu trong sinh lý
Quá trình đông máu đƣợc điều hoà hết sức nghiêm ngặt và chính xác sao cho chỉ cho một lƣợng rất nhỏ những zymogen - tiền yếu tố đông máu chƣa hoạt động đƣợc chuyển thành dạng hoạt động làm cho nút cầm máu không thể hình thành ở bên ngoài chỗ tổn thương Sự điều hoà này rất quan trọng, vì mỗi 1ml máu có đủ khả năng làm đông toàn bộ fibrinogen trong cơ thể trong vòng 10 đến 15 giây [11]
Tính chất lỏng của máu đƣợc duy trì bởi chính dòng máu chảy, bởi sự hấp thu các yếu tố đông máu lên các bề mặt và do sự có mặt của hàng loạt các chất ức chế đông máu trong huyết tương Antithrombin, protein C, protein S và chất ức chế yếu tố tổ chức TFPI (Tissue factor pathway inhibitor) là những chất ức chế quan trọng nhất Ngoài ra người ta còn nói đến vai trò của serpin trong điều hoà đông máu Một khi thiếu các chất chống đông máu dù chỉ là ở mức độ vừa phải, hoặc do một sự đột biến nào đó đều có thể làm tăng nguy cơ huyết khối tĩnh mạch [11,37].
Rối loạn đông máu
Rối loạn đông máu là sự gián đoạn trong khả năng của cơ thể để kiểm soát đông máu Các rối loạn đông máu có thể dẫn đến xuất huyết (quá ít cục máu đông làm tăng nguy cơ chảy máu) hoặc huyết khối (đông máu quá nhiều gây tắc nghẽn máu dẫn đến cản trở lưu thông máu) Các rối loạn đông máu này phát triển tùy từng điều kiện [24,26,48]
1.3.1 Rối loạn bẩm sinh 1.3.1.1 Rối loạn do thiếu yếu tố đông máu bẩm sinh (Hemophilia)
Rối loạn đông máu (Hemophilia) là rối loạn gây ra bởi sự thiếu hụt các yếu tố đông máu Nguyên nhân trực tiếp gây bệnh là do đột biến ở gen của các yếu tố đông máu di truyền liên kết với nhiễm sắc thể giới tính X Hầu hết thường gặp ở nam, nhưng có cả ở nữ [24,26,48]
Bệnh đƣợc phân loại dựa trên yếu tố bị thiếu hụt
- Hemophilia A: Là thể bệnh hay gặp nhất, do thiếu yếu tố VIII
- Hemophilia B: Là thể bệnh hay gặp thứ hai do thiếu yếu tố IX
- Hemophilia C: Là thể bệnh do thiếu yếu tố XI, triệu chứng nói chung thường nhẹ hơn Chỉ xuất hiện ở 1% dân số
Triệu chứng Đặc điểm lâm sàng là chảy máu khó cầm ở nhiều bộ phận của cơ thể:
- Máu chảy khó cầm ở vết thương: đứt tay, chân, nhổ răng, bầm tụ máu khi bị ngã
- Khối máu tụ ở khớp, cơ: thường xuất hiện nhiều lần có tính lặp lại ở một cơ, một khớp
- Chảy máu ở niêm mạc: đái máu, đi ngoài ra máu, chảy máu chân răng, chảy máu mũi
Mức độ, độ tuổi bắt đầu xuất hiện chảy máu tùy theo mức độ bệnh gọi là thể nặng nhẹ Căn bệnh này thực sự để lại nhiều hậu quả nặng nề nếu không đƣợc chẩn đoán sớm và điều trị kịp thời Khi bệnh nhân bị chảy máu, đặc biệt trong khớp, trong cơ, hoặc trong các nội tạng thì nhẹ nhất có thể tàn phế, nặng có thể tử vong [24,26] Ngoài ra có thể gặp thiếu yếu tố XII, prekellicrein, kininogen trọng lượng phân tử cao nhưng trường hợp này hiếm gặp và ít biểu hiện lâm sàng [24,26]
Bệnh này đƣợc lấy tên từ một yếu tố đông máu có trong máu gọi là yếu tố von Willebrand Rối loạn này thường là di truyền và gây chảy máu quá nhiều khi hệ số von Willebrand thấp Von Willebrand là một glycoprotein đƣợc tổng hợp chủ yếu ở các tế bào nội mô Chức năng của glycoprotein này là [24,26,48]:
- Làm trung gian dính tiểu cầu vào lớp collagen của nội mạc
- Kích thích ngƣng tập tiểu cầu
- Là protein mang của yếu tố VIII, làm yếu tố VIII bền vững
Lâm sàng thấy chảy máu kéo dài thường là chảy máu niêm mạc ít khi chảy máu trong cơ, khớp Nặng có thể có xuất huyết dưới da [24,26,49]
1.3.1.3 Rối loạn do thiếu yếu tố chống đông máu bẩm sinh
Là bệnh do bất thường về số lượng và chất lượng các yếu tố tham gia vào quá trình ức chế đông máu nhƣ protein C, protein S, antithrombin III Hầu hết là do đột biến gen gây nên [26,48,49]
Lâm sàng thường biểu hiện có các huyết khối và các ổ nhồi máu Định lượng các yếu tố này thấy giảm Đối với những người này, nguy cơ tắc mạch theo họ suốt cuộc đời và thường gặp huyết khối ở tĩnh mạch [26,48,49]
1.3.2 Rối loạn mắc phải 1.3.2.1 Có kháng đông lưu hành
Có thể là kháng đông nội sinh và ngoại sinh Kháng đông lưu hành đường ngoại sinh: Kháng prothrombinase hoặc kháng đặc hiệu yếu tố đông máu Kháng đông lưu hành đường nội sinh: Kháng đặc hiệu yếu tố đông máu hay kháng đông loại lupus [26]
Chất kháng đông lupus là một kháng thể antiphospholipid Các chất kháng đông lupus thường liên quan đến việc làm gia tăng nguy cơ huyết khối và chất kháng đông lưu hành đặc hiệu liên quan đến nguy cơ xuất huyết [24,26]
Xét nghiệm thấy có các bất thường trên các chỉ số PT hoặc APTT Cần tiến hành định lượng các yếu tố đông máu và tìm kháng đông lưu hành
1.3.2.2 Giảm tổng hợp yếu tố đông máu
Hay gặp trong bệnh lý suy giảm chức năng gan, thiếu vitamin K gây giảm tổng hợp các yếu tố đông máu phụ thuộc vitamin K [24,26]
- Vitamin K1 (phytonadion, phulloquinon) có nguồn gốc thực vật
- Vitamin K2 (menaquinon) do vi khuẩn gram âm đường ruột tổng hợp
- Vitamin K3 (menadion) và vitamin K4 có nguồn gốc tổng hợp
Vitamin K tan trong lipid, nhƣng riêng vitamin K3 ở dạng muối tan trong nước vào cơ thể bị chuyển hóa thành vitamin K2 Vitamin K giúp cho gan tổng hợp các yếu tố đông máu nhƣ prothrombin (II), VII, IX, X [20] Ở những bệnh nhân có chế độ dinh dƣỡng kém, bị bệnh mạn tính, ứ mật hoặc bệnh lý đường ruột gây giảm hấp thu mỡ, uống kháng sinh kéo dài làm mất cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột cũng làm rối loạn hấp thu vitamin
K Ở một số trẻ sơ sinh, khi hệ vi khuẩn chí đường ruột chưa phát triển đầy đủ có thể bị xuất huyết nặng, người ta có thể tiêm vitamin K dự phòng tránh xuất huyết giai đoạn sơ sinh
1.3.2.3 Đông máu nội mạc rải rác
Còn gọi là đông máu nội mạch lan tỏa (Disseminated Intravascular Coagulation - DIC)
DIC đƣợc đặc trƣng bởi sự kích hoạt hệ thống đông máu, hậu quả tạo và lắng đọng fibrin, thành lập huyết khối vi mạch ở nhiều cơ quan trong cơ thể dẫn tới tình trạng nghẽn tắc mạch và xuất huyết do giảm trầm trọng các yếu tố đông máu [24,26,49]
Nguyên nhân khởi phát là tăng quá mức hoạt tính thromboplastin trong máu làm hoạt hóa đông máu, hình thành thrombin, biến đổi fibrinogen thành các fibrin trong các tiểu động mạch Hậu quả là có sự tiệu thụ quá mức fibrinogen, prothrombin, các yếu tố V, VIII, tiểu cầu đồng thời có sự hoạt hóa yếu tố VII, IX, X, XII hơn nữa thường dễ xảy ra tiêu fibrin thứ phát do hệ thống tiêu fibrin bị hoạt hóa, tăng sản sinh fibrinogen và các sản phẩm giáng hóa của fibrin [24,26,49]
Nguyên nhân sản khoa: viêm bể thận do thai nghén, nhiễm khuẩn khi phá thai, thai chết lưu, sản giật, nhiễm độc thai nghén, vỡ tử cung,…
Nguyên nhân ngoại khoa: sốc do chảy máu, sốc chấn thương, bỏng nặng, cấy ghép cơ quan, mổ cắt khối ung thƣ lớn, nạo vét hạch,…
Nguyên nhân nội khoa: nhiễm khuẩn nặng, nhiễm khuẩn máu: nhƣ tụ cầu, mô não cầu, nhất là trực khuẩn gram âm, vi khuẩn yếm khí, nhiễm virus nặng nhất là khi có sốc do nhiễm khuẩn, lao kê, dịch hạch, viêm tụy, xơ gan, suy gan cấp, suy thận cấp,…
DIC sẽ dẫn tới: Đông máu nội mạc → tắc vi mạch → mất nuôi dƣỡng mô → rối loạn chuyển hóa mô → suy tạng → sinh ra cytokin và TF (Tissue factor) → hoạt hóa đông máu Tạo vòng xoắn của sốc, tổn thương vi mạch và đông máu Gây tiêu thụ các yếu tố đông máu, chảy máu thứ phát do cạn kiệt các yếu tố đông máu
Các xét nghiệm đông máu cơ bản
Còn đƣợc gọi là thời gian Quick (Prothrombin Time - PT)
Máu đƣợc chống đông bằng natri citrat sẽ đƣợc phát động quá trình đông máu theo con đường ngoại sinh khi phục hồi calci và có mặt thromboplastin Dựa vào đặc tính này người ta khảo sát thời gian đông máu huyết tương sau khi cho thừa thromboplastin calci để đánh giá yếu tố đông máu đường ngoại sinh (phức hệ prothrombin: II, V, VII, X) [1,5,16]
- 50μL huyết tương được ủ 3 phút trong cuvet ở 37
- Thêm 100μL hóa chất PT vào mỗi ống Đo thời gian PT ở bước sóng 660nm
- Thời gian PT đƣợc xác định bằng khoảng thời gian từ khi cho hóa chất
PT vào hỗn hợp huyết tương tới khi hình thành cục máu đông và được đo bằng máy đông máu (Hình 1.3)
Hình 1.3 Nguyên lý của quy trình xét nghiệm đo thời gian PT [1]
- PT tính theo giây (PTs): Thời gian Qick bình thường khi sử dụng thromboplastin có hoạt tính đầy đủ thường từ 11-13 giây
- PT tính theo phần trăm (PT%): Việc tính tỷ lệ % dựa vào biểu đồ do nhà sản xuất cung cấp hoặc biểu đồ đƣợc lập từ nhiều độ pha loãng khác nhau của huyết tương người bình thường (dung dịch pha loãng:
Michaelis Citrat) Giá trị bình thường trong khoảng 70 - 100%
- Hệ thống ISI/INR: (International Sentivity Index/International Nomalized Ratio) đƣợc tính theo PT bệnh/PT chứng SI là một chỉ số liên quan đến loại hoá chất sử dụng Tỷ số INR không phụ thuộc vào hoá chất sử dụng do đó khách quan hơn [33] Ý nghĩa
Thời gian prothrombin đƣợc gọi là kéo dài khi dài hơn thời gian chứng ít nhất là 2 giây hoặc % tiêu thụ prothrombin giảm dưới 70% hoặc INR > 1.3 với điều kiện là lượng fibrinogen không giảm và huyết tương không chứa heparin
Thời gian Quick kéo dài trong các trường hợp rối loạn đường đông máu ngoại sinh (giảm nồng độ các yếu tố phức hệ prothrombin do: suy chức năng gan hoặc thiếu vitamin K, điều trị chống đông bằng dẫn xuất coumarin)
Xét nghiệm này nhạy nhất với sự thiếu hụt prothrombin
- Do mẫu huyết tương kiểm tra: đông dây, sai tỷ lệ chống đông (máu lấy quá ít hoặc quá nhiều)
- Do kỹ thuật: tiến hành kỹ thuật sau 4 giờ kể từ khi lấy máu với mẫu máu đƣợc bảo quản ở nhiệt độ phòng
- Do chất lƣợng hóa chất không đảm bảo hoặc hóa chất đã bảo quản quá lâu sau khi chuẩn bị và mang ra sử dụng
1.4.2 Thời gian thromboplastin từng phần hoạt hóa
Còn gọi là thời gian cephalin - kaolin (Activated partical thrombopastin time - APTT)
Thời gian phục hồi calci của huyết tương citrat hóa sau khi ủ với một lƣợng thừa kaolin (hoạt hóa yếu tố tiếp xúc) và cephalin (thay thế yếu tố 3 tiểu cầu) giúp đánh giá chính xác yếu tố khác của đường đông máu nội sinh
Với xét nghiệm này điều kiện hoạt hóa yếu tố tiếp xúc cũng nhƣ số lƣợng, chất lượng tiểu cầu trong mẫu kiểm tra không ảnh hưởng đến kết quả xét nghiệm [2,5,16]
- 50μL huyết tương được ủ 1 phút trong cuvet ở 37
- Thêm 50μL hóa chất APTT vào mỗi ống
- Sau 3 phút, thêm 50μL CaCl2 25 mM vào mỗi ống Đo thời gian APTT ở bước sóng 660nm
- Thời gian APTT đƣợc xác định bằng khoảng thời gian từ khi cho CaCl2 vào hỗn hợp huyết tương và hóa chất APTT tới khi hình thành cục máu đông và đƣợc đo bằng máy đông máu (Hình 1.4)
Hình 1.4 Nguyên lý của quy trình xét nghiệm đo thời gian APTT [2]
- Thời gian thromboplastin từng phần hoạt hóa của huyết tương bình thường thay đổi từ 30-35 giây tùy loại cephalin - kaolin, tùy kỹ thuật, tùy điều kiện kỹ thuật mà từng phòng xét nghiệm sử dụng
- So sánh ATTP bệnh nhân và nhóm chứng ta có tỷ lệ ATTP (rATTP) Ý nghĩa
Nếu rATTP > 1.2 hoặc APTT kéo dài hơn chứng trên 8 giây là biểu hiện giảm đông (giảm yếu tố đông máu nội sinh) Tình trạng này do thiếu hụt yếu tố có thể bẩm sinh (Hemophilia) hay do yếu tố đông máu đã bị tiêu thụ (DIC) hoặc do suy gan nặng không tổng hợp đƣợc yếu tố, cũng có thể do trong máu có chất ức chế đông máu nội sinh, APTT kéo dài khi điều trị bằng heparin.
Nếu rAPTT < 0.8 là biểu hiện tăng đông: Gặp trong DIC giai đoạn đầu do có hiện tƣợng tăng đông
- Do mẫu huyết tương kiểm tra: đông dây, sai tỷ lệ chống đông (máu lấy quá ít hoặc quá nhiều)
- Do kỹ thuật: tiến hành kỹ thuật sau 4 giờ kể từ khi lấy máu với mẫu máu đƣợc bảo quản ở nhiệt độ phòng
- Do chất lƣợng hóa chất không đảm bảo hoặc hóa chất đã bảo quản quá lâu sau khi chuẩn bị và mang ra sử dụng
Cho thrombin vào huyết tương, huyết tương sẽ đông và thời gian đông tuỳ thuộc vào lượng fibrinogen Dựa trên cơ sở đó người ta pha dung dịch fibrinogen chuẩn ở các nồng độ khác nhau rồi cho thêm thrombin Kết quả lần xét nghiệm này sẽ tạo được một đường cong nồng độ fibrinogen - thời gian
Huyết tương bệnh nhân được pha loãng và xét nghiệm thời gian đông với thrombin rồi đối chiếu đường cong chuẩn sẽ biết nồng độ fibrinogen [3,5,16]
- Pha loóng huyết tương: 10àL huyết tương được cho thờm 90àL dung dịch đệm Owren – Koller Ủ ở 37 o C trong 3 phút
- Thờm 50àL húa chất Thrombin, sau đú đo thời gian hỡnh thành fibrin ở bước sóng 660nm
- Thời gian hình thành fibrin đƣợc xác định bằng khoảng thời gian từ khi cho hóa chất Thrombin đến khi xuất hiện những sợi fibrin đầu tiên và đƣợc đo bằng máy đông máu
Khi thời gian đông quá ngắn hay quá dài phải làm lại xét nghiệm và huyết tương được pha loãng 1/20 hoặc 1/5 Tính nồng độ fibrinogen dựa vào biểu đồ mẫu tự làm với huyết tương bình thường hoặc dựa vào biểu đồ chuẩn đƣợc cung cấp kèm theo lô thuốc thử (Hình 1.5)
Hình 1.5 Nguyên lý của quy trình định lƣợng fibrinogen [3]
Kết quả bình thường từ 2 - 4g/l Ý nghĩa
Fibrinogen tăng trong: Các bệnh nhiễm trùng cấp, các bệnh viêm mạn, các bệnh lý khối u, nhồi máu cơ tim cấp,…
Fibrinogen giảm trong: Bệnh lý gan nặng, DIC, tình trạng tiêu fibrin tiên phát hay thứ phát do các bệnh lý huyết khối hay các thuốc tiêu fibrin, không có fibrinogen bẩm sinh,…
- Do mẫu huyết tương kiểm tra: đông dây, sai tỷ lệ chống đông
- Do kỹ thuật: tiến hành kỹ thuật sau 4 giờ kể từ khi lấy máu với mẫu máu đƣợc bảo quản ở nhiệt độ phòng
- Do chất lƣợng hóa chất không đảm bảo hoặc hóa chất đã bảo quản quá lâu sau khi chuẩn bị và mang ra sử dụng.
Tổng quan về Sâm vũ diệp và Tam thất hoang
Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) thuộc bộ Apiales, họ Ngũ gia bì - Araliace, chi Nhân sâm - Panax L, hay còn gọi là vũ diệp tam thất, tam thất lá xẻ, trúc tiết nhân sâm [4,8,17,22] Đặc điểm thực vật
Cây thân thảo, cao từ 30 - 50 cm, có thân rễ mập, nằm ngang và thường nổi trên mặt đất, phân nhiều đốt, đường kính 1,5 -3,5cm Thân khí sinh mảnh, có vạch dọc, thường đơn độc, mọc thẳng và rỗng giữa, đường kính thân từ 0,3
- 0,6cm Lá kép chân vịt gồm 2 - 3 lá mọc vòng Lá chét từ 3 - 5, thuôn, dài từ 2,5 - 14 cm, rộng từ 1,5 - 4 cm Lá chét xẻ thùy hình lông chim rõ rệt, mép khía răng Cụm hoa tán đơn, mọc ở ngọn, cuống cụm hoa từ 5 - 10cm, mang từ 20 - 90 hoa, cuống hoa mảnh, dài 1 - 1,5 cm Hoa màu vàng xanh, 5 lá đài nhỏ, 5 cánh hoa; 5 nhị Bầu 2 ô; đầu vòi nhụy chẻ đôi Quả hình cầu đến hình cầu dẹt, đường kính 0,6 - 1,2 cm, khi chín màu đỏ Hạt 2, hạt gần hình cầu hoặc gần giống hạt đậu, màu xám trắng, vỏ cứng, có rốn hạt Mùa hoa tháng 4
Hình 1.6 Sâm vũ diệp ( Panax bipinnatifidus Seem.)
Thân rễ cây Sâm vũ diệp - Rhizoma Panax bipinnatifidus Seem
Nơi sống và thu hái
Có ở Ấn Độ, Nêpan, Trung Quốc và Việt Nam [7,50] Ở Việt Nam loài này phân bố chủ yếu ở dãy Hoàng Liên Sơn và Phía Tây Bắc Việt Nam nhƣ ở
Bát Xát (xã Trung Lèng Hồ), tỉnh Lào Cai [6,22] ở độ cao 1900 - 2400m, trong rừng ẩm Thu hoạch thân rễ ở những cây lâu năm Phơi hoặc sấy khô
Thành phần hóa học của lá và rễ cây SVD đƣợc phát hiện có nhiều saponin khung dammaran và oleanan Năm 1989, nhóm nghiên cứu Trung Quốc công bố phân lập 13 saponin khung dammaran từ lá của cây này ở Trung Quốc trong đó bao gồm một số ginseng saponin đặc trƣng nhƣ ginsenoside F1, F2, F3, Rg2, Rb, Rd, Re và Rb3 [56] Gần đây, năm 2011, nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc phân lập một nhóm 10 saponin khung oleanan (1-10, hình 1.7), trong đó có 3 chất mới bifinoside A-C (1-3), là thành phần chính của rễ cây SVD đƣợc thu hái ở núi Hoàng Liên Sơn, Việt Nam [50] Nhƣ vậy, tổng cộng có 23 hợp chất saponin đã đƣợc xác định từ các phần của cây SVD
Hình 1.7 Hợp chất saponin khung oleanan từ rễ của cây SVD [44]
Năm 2015, nhóm tác giả Viện Dược liệu đã bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của SVD kết quả đã phân lập đƣợc một hỗn hợp saponin (11) bao gồm stigmasterol-3-O-β-D-glucopyranosid (11A) và β-sitosterol-3-O-β- D-glucopyranosid (11B), glycosphingolipid: 1-O-(β-D-glucopyranosyl)-N- (1,3,4-trihydroxytridec-8-en-2-yl) heptacosanamid (12), dichaccarid: saccharose (13) từ phân đoạn chiết ethyl acetat rễ SVD Đây là lần đầu tiên một số hợp chất trên đƣợc công bố phân lập từ cây này [9]
Ngoài ra, trong SVD có sự hiện diện của các hợp chất triterpenoid, tinh dầu, acid amin, acid hữu cơ, đường khử, polyuronic và những nguyên tố vi lƣợng [12,13] Lần đầu tiên hợp chất polyacetylen đƣợc nhận diện trong SVD và TTH [13] Đây là nhóm hợp chất thường có trong phân đoạn ít phân cực của loài thuộc chi Panax nói riêng và của họ Nhân sâm nói chung Chúng đƣợc xem là hợp chất có tác dụng chống ung thƣ [30,41,43,55]
Liên quan đến tác dụng sinh học, một số hợp chất đước xác định là thành phần của SVD có tác dụng sinh học bao gồm kháng viêm, chống oxi hóa, chống ung thư, bảo vệ tim mạch, chống tiểu đường, bảo vệ tế bào thần kinh,…có thể phần nào giải thích cho lợi ích về mặt dƣợc học trong việc sử dụng SVD trong y học truyền thống [27]
Hoạt huyết khứ ứ, tiêu đờm, giảm đau, thủng trướng tích tụ, đau gân cốt, rắn độc cắn, tâm vị khí thống, thổ huyết, đổ máu mũi, xuất huyết dạ dày
Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng) thuộc bộ Apiales, họ Ngũ gia bì - Araliace, chi Nhân sâm - Panax L, hay còn gọi là tam thất rừng, sâm tam thất [4,8,17,22] Đặc điểm thực vật
Cây thảo sống nhiều năm, cao 25 - 75 cm Thân rễ mập, nằm ngang, có nhiều chỗ lõm do vết thân để lại; ít khi phân nhánh; đường kính 1,5 - 3 cm
Mỗi khóm thường có 1 thân mang lá Thân mọc thẳng, nhẵn; đường kính 0,3 - 0,6 cm Lá kép chân vịt, gồm 1 - 3 cái, mọc vòng ở ngọn; có cuống dài 5 - 10 cm Lá chét 5; có cuống ngắn, hình thuôn hay mác thuôn, nhọn 2 đầu, dài 5 - 13cm, rộng 2 - 4 cm; mép có răng cƣa, hoặc ở một số ít cây non có thể gặp dạng xẻ lông chim nông, mép của thuỳ nông cũng khía răng cƣa Cụm hoa tán đơn, mọc ở ngọn, cuống cụm hoa dài 5 - 10cm Số hoa trên một tán gồm 30 -
80 cái màu vàng xanh,cuống hoa mảnh, dài 1- 1,5 cm Hoa màu vàng xanh, 5 lá đài nhỏ; 5 cánh hoa; 5 nhị; bầu 2 ô, đầu nhụy thường chẻ đôi Quả mọng, gần hình cầu dẹt, đường kính 0,6 - 1,2 cm, khi chín màu đỏ Hạt 1 hoặc 2, gần giống hạt đậu tròn, màu xám trắng, vỏ cứng, có rốn hạt Mùa hoa tháng 4 - 5, quả tháng 5 - 9 [6,18]
Hình 1.8 Tam thất hoang ( Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng)
Thân rễ cây Tam thất hoang - Rhizoma Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng
Nơi sống và thu hái
Có ở Trung Quốc và Việt Nam Loài có phân bố hẹp ở Việt Nam Xuất hiện ở huyện Sa Pa (núi Hàm Rồng - thị trấn Sa Pa và xã Tả Phìn) và huyện Bát Xát (xã Trung Lèng Hồ), tỉnh Lào Cai Thu hoạch thân rễ ở những cây lâu năm Phơi hoặc sấy khô [7,18,22]
Các kết quả nghiên cứu phân tích và tách chiết thành phần hóa học của cây TTH chỉ ra rằng phần rễ của cây này có chứa nhiều saponin khung oleanan với hàm lượng tương đối cao cùng một số saponin khung dammaran với nồng độ thấp Năm 1985, nhóm nghiên cứu Trung Quốc phân lập 2 saponin khung oleanan, stipuleanoside R1 và R2, từ dịch chiết methanol của rễ cây này [57] Năm 2002, trên cơ sở phân tích bằng HPLC-MS/MS, nhóm nghiên cứu ở Đại học Toyama (Toyama, Nhật Bản) phát hiện thêm thành phần saponin khung dammaran bao gồm các ginsenoside Rb1, Rc, Rb3 và Rd với hàm lƣợng nhỏ từ dich chiết ethanol của cây TTH đƣợc thu hái ở Trung Quốc [58] Gần đây, năm 2010, đặc biệt từ rễ của cây TTH ở Việt Nam, nhóm nghiên cứu Việt Nam - Hàn Quốc công bố xác định 15 hợp chất saponin (1-
15, hình 1.9) khung oleanan trong đó có một chất mới là spinasaponin A methyl ester (1), 3 hợp chất polyyne (16-18), một sesquitecpen (19) và một acid béo (20) [46]
Hình 1.9 Thành phần hóa học của cây TTH
Ngoài ra TTH cũng chứa các thành phần nhƣ triterpenoid, tinh dầu, đường khử tự do, acid amin, acid hữu cơ, đường khử, các nguyên tố vi lượng, và polyuronic [12,13] Các thành phần hóa học chủ yếu của tinh dầu ở cả 2 loài SVD và TTH cũng tương tự nhau (như: β-farnesen, germacren D, spatulenol) [22]
Trong các saponin của TTH, hợp chất saponin 1, saponin 2, polyyne 16 và polyyen 17 thể hiện hoạt tính ức chế tế bào ung thƣ máu (HL - 60) và ruột kết (HCT-116) với giá trị IC50 từ 0,13 đến 41,45 μM theo cơ chế gây chết tự nhiên của tế bào - apoptosis qua phân tích hình thái tế bào, phân mảnh DNA và biểu hiện trên protein kích thích quá trình apoptosis Trong một công bố khác về hoạt tính sinh học, các hợp chất saponin 6-11 biểu hiện ức chế nhân tố sao chép NF - κB với giá trị IC 50 từ 3,1 đến 18,9 μM trên dòng tế bào HepG2 liên quan đến khả năng chống ung thƣ và kháng viêm [45] Ở trong nước, năm 2002, Trần Công Luận và cộng sự đã khảo sát: Cao thân rễ và rễ củ TTH thể hiện độc tính cấp đường uống với liều chết LD50 8,8 g/kg Cao saponin toàn phần của TTH thể hiện tác dụng chống oxy hóa, ức chế sự hình thành malonyl diandehyd ở nồng độ 25, 50, 100μg/ml [12]
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Khía cạnh đạo đức trong nghiên cứu
Để thực hiện đƣợc nghiên cứu in vitro, đề tài cần tiến hành lấy mẫu máu của người tình nguyện khỏe mạnh Do đó, cần tuân thủ theo hiệp ước Helsinki và hướng dẫn quốc gia về khía cạnh đạo đức trong nghiên cứu y sinh học trên đối tượng nghiên cứu là con người, đề tài được thực hiện sau khi Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh học Khoa Y - Dƣợc thông qua
Những khía cạnh đạo đức chính liên quan đến quyền lợi của tình nguyện viên tham gia nghiên cứu:
Mô tả nghiên cứu và quy trình lấy mẫu máu Đề tài tuyển người tình nguyện là các sinh viên của khoa Y- Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội (ĐHQGHN) đạt tiêu chuẩn để tham gia vào nghiên cứu Các tình nguyện viên đƣợc lấy 3ml máu lúc đói, và đo các chỉ số huyết học Quá trình lấy máu đƣợc thực hiện bởi bác sỹ hoặc y tá có chuyên môn Địa điểm lấy máu: Khoa Xét nghiệm Huyết Học, Bệnh viện 19.8 - Bộ Công An
Lợi ích và nguy cơ đối với đối tượng nghiên cứu
Lƣợng máu lấy ở mỗi tình nguyện viên là 3ml Điều này không gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe của người cho máu Việc tham gia cho máu của người tình nguyện sẽ được ghi nhận trong lời cảm ơn tại các báo cáo
Cam kết chấp thuận tình nguyện tham gia nghiên cứu
Người tình nguyện chỉ tham gia vào nghiên cứu khi đủ tiêu chuẩn, đƣợc giải thích và hiểu rõ các lợi ích, nguy cơ của việc tham gia nghiên cứu
Người tình nguyện có quyền từ chối tham gia và rút lui khỏi nghiên cứu mà không chịu sự ràng buộc nào
Sự bảo mật thông tin
Những thông tin cá nhân của tình nguyện viên tham gia nghiên cứu chỉ nhằm mục đích phục vụ cho nghiên cứu, không đƣợc sử dụng cho bất kỳ mục đích nào khác.
Đối tƣợng nghiên cứu
SVD các phân đoạn: cao tổng chiết bằng dung môi ethanol 70%, phân đoạn cao chiết bằng dung môi n - butanol, phân đoạn cao chiết bằng dung môi ethyl acetat và phân đoạn cao chiết bằng dung môi ete Mẫu nghiên cứu thân rễ SVD (Panax bipinnatifidus Seem.) đƣợc thu hái ở Sapa, Lào Cai vào tháng
3 - 2016 và đƣợc giám định thực vật học bởi chuyên gia thực vật học, Khoa Tài nguyên Dƣợc liệu, Viện Dƣợc liệu Mẫu tiêu bản (PB - 001/2016) đƣợc lưu giữ tại Khoa Y - Dược, ĐHQGHN
Hình 2.1 Sơ đồ chiết thu các phân đoạn SVD
TTH các phân đoạn: cao tổng chiết bằng dung môi ethanol 70%, phân đoạn cao chiết bằng dung môi n-butanol, phân đoạn cao chiết bằng dung môi n-hexan và phân đoạn cao chiết bằng dung môi nước.Thân rễ TTH được thu hái tự nhiên ở sườn đông bắc dãy Hoàng Liên Sơn và một vài nhánh phụ cận kề, thuộc địa phận của 6 xã thuộc huyện Bát Xát và Sa Pa của tỉnh Lào Cai
Mẫu đƣợc giám định tên khoa học là TTH - Panax stipuleanatus H T Tsai et
1 Ngâm cồn 70%, nhiệt độ phòng
2 Chiết cồn 70%, 3h/lần; DL/DM: 1/7, (70 o C)
3 Thu hồi dung môi dưới áp suât giảm
2 Chiết lần lƣợt với các dung môi ete, ethyl acetat, n-butanol (3 lần x 500ml/lần)
3 Thu hồi dung môi dưới áp suất giảm
K M Feng bởi chuyên gia thực vật học, Khoa Tài nguyên Dƣợc liệu, Viện Dƣợc liệu
Hình 2.2 Sơ đồ chiết thu các phân đoạn TTH
Dƣợc liệu SVD và TTH sau khi sơ chế, làm khô, ngâm cồn 70% trong
3 ngày - 2 tuần ở nhiệt độ phòng Chiết hồi lưu bằng cồn 70% 3 lần, mỗi lần 3h, tỷ lệ 1: 7 (dƣợc liệu: dung môi) đối với SVD và tỷ lệ 1:8 (dƣợc liệu: dung môi) đối với TTH, ở nhiệt độ 70 o C Dịch chiết đƣợc gom lại và lọc qua giấy lọc Cô quay dưới áp suất giảm đến kiệt thu được cao tổng SVD (ký hiệu:
PBT), cao tổng TTH (ký hiệu PST) Cho cao tổng dƣợc liệu khuếch tán vào nước cất Chiết phân bố lần lượt với từng loại dung môi là ete, ethyl acetat và n-butanol (3 lần) đối với SVD và n-hexan, n-butanol, nước (3 lần) đối với
1 Ngâm cồn 70%, 2 tuần, nhiệt độ phòng
2 Chiết cồn 70%, 3h/lần; DL/DM: 1/8, (70 o C)
3 Thu hồi dung môi dưới áp suất giảm
2 Chiết lần lƣợt với các dung môi n-hexan, n- butanol, nước
3 Thu hồi dung môi dưới áp suất giảm n -hexan
Nước (397,8 g, 39,8%): không xác đinh độ ẩm
Nước (397,8 g, 39,8%): không xác định độ ẩm
TTH Các dịch chiết mỗi phân đoạn được gom lại, cô quay dưới áp suất giảm để loại dung môi đến khối lƣợng không đổi thu đƣợc các phân đoạn cao chiết tương ứng
Các phân đoạn tương ứng của SVD là phân đoạn cao chiết bằng dung môi ete (ký hiệu: PBEt), phân đoạn cao chiết bằng dung môi ethyl acetat (ký hiệu: PBEA) và phân đoạn cao chiết bằng dung môi n-butanol (ký hiệu:
PBBt) Các phân đoạn cao chiết SVD đƣợc tiến hành tại khoa Y- Dƣợc, ĐHQGHN, do TS Nguyễn Hữu Tùng cung cấp (Hình 2.1)
Các phân đoạn tương ứng của TTH là phân đoạn cao chiết bằng dung môi n-hexan (ký hiệu: PSnH), phân đoạn cao chiết bằng dung môi n- butanol (ký hiệu: PSBt), phân đoạn chiết với nước tiếp tục chạy sắc kí Diaion và rửa giải bằng nước để thu phân đoạn cao chiết bằng dung môi nước (ký hiệu:
PSW) Các phân đoạn dịch chiết TTH đƣợc tiến hành tại khoa Hóa thực vật viện Dƣợc liệu, do PGS.TS Đỗ Thị Hà cung cấp (Hình 2.2).
Phương pháp
Thời gian đông máu in vitro đƣợc đo bằng máy ACL TOP500 theo nguyên lý đo quang (phương thức phát hiện ánh sáng tán xạ), dựa theo mô hình của (Li C.,et al 2013) [44]
- Xây dựng mô hình đánh giá tác dụng chống đông máu trên in vitro
- Nghiên cứu tác dụng chống đông máu trên in vitro của các phân đoạn dịch chiết SVD và TTH thông qua các chỉ số PT và APTT
Huyết tương từ người tình nguyện khỏe mạnh Mẫu máu toàn phần được thu thập từ người tình nguyện khỏe mạnh có độ tuổi từ 20-25 Lấy khoảng 3ml máu toàn phần từ tĩnh mạch người tình nguyện khỏe mạnh cho vào ống chống đông chứa sodium citrat 3,8% (1:9, v/v) Ly tâm 3000 vòng/ phút trong
15 phút Sau đó đo các giá trị PT và APTT
Nước (397,8 g, 39,8%): không xác đinh độ ẩm
Nước (397,8 g, 39,8%): không xác đinh độ ẩm
Nước (397,8 g, 39,8%): không xác đinh độ ẩm
Tiêu chuẩn lựa chọn: Người có các chỉ số PT và APTT bình thường, không hút thuốc lá, không có tiền sử các bệnh về máu, không đang sử dụng các thuốc tác dụng trên quá trình đông máu, tiêu fibrin
Tiêu chuẩn loại trừ: Mẫu máu thu nhận bị vỡ hồng cầu, người mới cho máu với lượng > 450ml trong vòng 28 ngày trước
Việc lấy máu đƣợc thực hiện vào buổi sáng Các tình nguyện viên cần nhịn ăn 12h trước khi lấy máu
Dung dịch DMSO nguyên chất, heparin, nước cất Các phân đoạn cao chiết của SVD: Cao tổng chiết bằng dung môi ethanol 70%, phân đoạn cao chiết bằng dung môi n-butanol, phân đoạn cao chiết bằng dung môi ethyl acetat, phân đoạn cao chiết bằng dung môi ete
Các phân đoạn cao chiết của TTH: Cao tổng chiết bằng dung môi ethanol 70%, phân đoạn cao chiết bằng dung môi n- butanol, phân đoạn cao chiết bằng dung môi n- hexan, phân đoạn cao chiết bằng dung môi nước
Cao chiết SVD và TTH ở các phân đoạn đƣợc hoà tan trong dung môi DMSO 1%, sử dụng nồng độ nghiên cứu: 0,5; 1; 2; 5mg/ml Dùng DMSO 0,1% làm chứng âm, heparin 0,2UI/ml (HP 0,2UI/ml) làm chứng dương Mẫu trắng là nước cất
Dụng cụ: Ống đựng máu không chứa chất chống đông và giá để ống đựng máu Ống falcon và giá để ống falcon Ống eppendorf thể tích 1,5ml và giá để ống eppendorf Pipet đơn kênh thể tớch 1-10,0àl, 20-200àl, 100-1000àl; đầu cụn tương ứng và giỏ để pipet
Bút dạ, giấy parafilm, găng tay, khẩu trang y tế Cốc đựng đầu côn bẩn
Máy đo thời gian PT và APTT: Máy ACL TOP500 của hãng IL (Instrumentation Laboratory - Mỹ)
Hình 2.4 Máy ACL TOP500 và nguyên lý đo quang của máy ACL TOP 500 Tiến hành
Thu huyết tương vào ống falcon vụ khuẩn Chia 450àl huyết tương vào mỗi ống mỏu đó đƣợc loại sạch chất chống đụng Thờm 50àl húa chất gồm nước cất, DMSO 0,1%, heparin 0,2UI/ml, các nồng độ dịch chiết dược liệu các phân đoạn (0,5, 1, 2, 5mg/ml) vào mỗi ống theo thứ tự sau và ủ trong 2-3 phút
- Ống 1: Nước cất (mẫu trắng)
- Ống 2: Dung dịch DMSO 0,1% (chứng âm)
- Ống 3: Dung dịch Heparin 0,2UI/ml (chứng dương)
- Ống 4: Dịch chiết SVD hoặc TTH nồng độ 0,5mg/ml
- Ống 5: Dịch chiết SVD hoặc TTH nồng độ 1mg/ml
- Ống 6: Dịch chiết SVD hoặc TTH nồng độ 2mg/ml
- Ống 7: Dịch chiết SVD hoặc TTH nồng độ 5mg/ml
Tiến hành đo chỉ số PT và APTT bằng máy ACL TOP500 Lặp lại thí nghiệm 5 lần ứng với mỗi phân đoạn
Phương pháp phân tích số liệu:
So sánh giữa các nhóm đƣợc thực hiện bằng cách sử dụng phân tích phương sai one - way ANOVA sau đó là Tukey hoặc Dunnet T3 bằng phần mềm SPSS 16.0 Dữ liệu đƣợc biểu diễn ở dạng giá trị trung bình ± SE, đƣợc xem xét có ý nghĩa thống kê khi các giá trị p 0,05