Khảo sát và đánh giá nguồn gen cà chua kháng bệnh virus xoăn vàng lá

Khảo sát và đánh giá nguồn gen cà chua kháng bệnh virus xoăn vàng lá

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

“ Khóa luận đệ trình khoa CNSH, Trường ĐH Nông nghiệp Hà Nội là một phần

yêu cầu của trình độ đại học ngành Công nghệ sinh học ”

HÀ NỘI – 2012

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, ngoài sự nỗ lực cố gắng của bản thân,tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ rất tận tình của các thầy cô, bạn bè cũng nhưnhững người thân trong gia đình

Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết sâu sắc tới PGS.TS Phan Hữu Tôn, người

đã tận tình hướng dẫn, định hướng, giúp đỡ tôi về chuyên môn trong suốt quá trìnhthực hiện khóa luận tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn KS Tống Văn Hải và

KS Khúc Ngọc Tuyên, và toàn thể cán bộ, nhân viên Bộ môn Công nghệ sinh họcỨng dụng, Khoa Công nghệ sinh học, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã rấtnhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong thời gian thực tập tại

bộ môn Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trường ĐH nông nghiệp

Hà Nội đã trang bị cho tôi những kiến thức cần thiết để có thể thực hiện và hoànthành khóa luận

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình,anh em, bạn bè đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóaluận này

Hà Nội, ngày 5 tháng 9 năm 2012

Tác giả

Đoàn Hữu Thanh

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN ii

DANH MỤC BẢNG ii

Tóm tắt iv

PHẦN I MỞ ĐẦU 1

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21

PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28

PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 50

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Các loài virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua phát hiện ở Việt Nam 7

Bảng 2 Danh sách các mẫu giống cà chua và nguồn gốc 21 Bảng 3 Các chỉ thị phân tử DNA sử dụng để phát hiện gen Ty-1, Ty-2, Ty-3 kháng virus

xoăn vàng lá 25 Bảng 4 Thời gian sinh trưởng của các mẫu giống cà chua 30 Bảng 5 Một số chỉ tiêu về hình thái, cấu trúc cây 32 Bảng 6 Các yếu tố cấu thành năng suất 35 Bảng 7 Một số đặc điểm hình thái quả 37 Bảng 8 Một số đặc điểm về chất lượng quả 40 Bảng 9 Phân tích tương quan một số chỉ tiêu về sinh trưởng của các giống cà chua 40 Bảng 10 Phân tích tương quan một số chỉ tiêu về năng suất và chất lượng quả 41 Bảng 11 Mục tiêu lựa chọn các giống triển vọng vụ đông xuân 2012 42

Bảng 12 Tóm tắt về phần lựa chọn 42 Bảng 13 Các giống cà chua triển vọng vụ đông xuân 2012 43 Bảng 14 Đánh giá tính kháng TYLCV của một số mẫu giống cà chua 43

Hình 5 Ảnh điện di sản phẩm PCR phát hiện gen Ty-2 bằng cặp mồi T0302F/TY-2R1

46

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Bản đồ khoảng cách di truyền của các gen kháng virus xoăn vàng lá 16

Hình 2: Hình vẽ thể hiện 2 đường hướng phòng thủ của cây 18

Hình 3 Chỉ số nghiêm trọng bệnh DSI theo thang điểm 0 – 4 của Lapidot và Friedmann

(2002) 26 Hình 4 Ảnh điện di sản phẩm PCR phát hiện gen Ty-1 với cặp mồi JB-1 45 Hình 6 Ảnh điện di sản phẩm PCR phát hiện gen kháng Ty-3 47

Tóm tắt

Cà chua là một loại cây rau ăn quả quan trọng được trồng phổ biến ở Việt Nam

và nhiều nơi trên thế giới Hiện nay, bệnh xoăn vàng lá do TYLCV đã và đang gây thiệt

hại rất lớn trên cây cà chua, có thể làm giảm năng suất cà chua lên tới 100% nếu bịnhiễm sớm Do đó, việc chọn tạo giống cà chua năng suất cao chất lượng tốt và cókhả năng kháng bệnh virus xoăn vàng lá là rất cần thiết Đề tài đã khảo sát các đặcđiểm nông sinh học, năng suất và chất lượng của một số mẫu giống cà chua, đánh

giá khả năng kháng và phát hiện các gen kháng Ty-1, Ty-2 và Ty-3 Kết quả đã chọn

ra được 7 giống triển vọng có năng suất cao, chất lượng tốt cho vụ đông xuân vànhiều mẫu giống có những đặc điểm giá trị như năng suất cao, quả to, sai quả, độbrix cao, thịt quả dày… Kết quả PCR phát hiện gen kháng cho thấy mẫu giống 189

có gen Ty-3b, mẫu giống 190 có gen Ty-1 và Ty-3a, không mẫu giống nào có gen Ty-2 Cả hai mẫu giống này đều thể hiện tính kháng tốt với bệnh xoăn vàng lá trên

đồng ruộng, là nguồn gen quý cho công tác lai tạo giống cà chua năng suất cao,chất lượng tốt và kháng virus

PHẦN I MỞ ĐẦU 1 1 Đặt vấn đề

Cà chua là một loại rau ăn quả có hàm lượng dinh dưỡng cao và được trồng phổbiến ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thế giới Bệnh xoăn vàng lá là một trongnhững bệnh gây thiệt hại lớn nhất, có thể làm giảm năng suất cà chua lên đến 100%nếu bị nhiễm bệnh sớm (Nguyễn Thơ, 1984) Bệnh này gây ra bởi một nhóm

begomovirus thường được gọi chung là Tomato Yellow Leaf Curl Virus (TYLCV) và được lan truyền thông qua bọ phấn Bemisia tabaci Bọ phấn là loài đa thực phát triển

quanh năm trên đồng ruộng, việc phòng trừ bọ phấn truyền bệnh gặp nhiều khókhăn (Ngô Bích Hảo, 2010) Cho đến nay, sử dụng giống kháng là biện pháp hiệu quảnhất để phòng chống bệnh xoăn vàng lá

Các gen kháng TYLCV chỉ được tìm thấy trong cà chua dại, để tạo ra cây trồng kháng tự nhiên các nhà chọn giống đã lai cà chua trồng (Solanum lycopersicum) với

các loài cà chua dại để đưa các gen kháng vào cà chua trồng Hiện nay, đã có 5 gen

kháng được phát hiện: gen Ty-1 có nguồn gốc từ loài cà chua dại Solanum chilense LA

1969 (Zamir và cộng sự, 1994), Ty-2 bắt nguồn từ Solanum habrochaites (Hanson và cộng sự, 2000), gen Ty-3 và Ty-4 được đưa vào cà chua trồng từ Soladium chilense LA2779, LA1932 (Ji và cộng sự, 2007; Ji và cộng sự, 2009), gen Ty-5 phát hiện từ loài Solanum peruvianum và được đưa vào một số giống cà chua trồng (Anbinder và cộng

sự, 2009) Bên cạnh đó, một hệ thống các marker phân tử DNA liên kết với các genkháng đã được phát triển và hỗ trợ đắc lực cho chương trình chọn tạo giống cà chua

kháng bệnh xoăn vàng lá Các chỉ thị phân tử DNA dựa trên PCR cho gen Ty-1 là 1), gen Ty-2 là T0302 và gen Ty-3 là P6-25 đã được nhiều nhà chọn giống trên thế giới

JB-sử dụng để chọn tạo giống cà chua kháng TYLCV.

Việc khảo sát các đặc điểm nông sinh học, năng suất, chất lượng quả, phát hiện

và đánh giá tính kháng TYLCV là một bước quan trọng trong chọn tạo giống cà chua

cho năng suất cao, chất lượng tốt và kháng bệnh xoăn vàng lá Bộ môn Công nghệSinh học Ứng dụng đã thu thập được một tập đoàn các mẫu giống cà chua rất đa dạng,

trong đó một số giống có khả năng mang gen kháng TYLCV Vì vậy, dưới sự hướng

dẫn của PGS.TS Phan Hữu Tôn, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát và

đánh giá nguồn gen cà chua kháng bệnh virus xoăn vàng lá”

1.2 Mục tiêu và yêu cầu của đề tài

1.2.1 Mục tiêu

- Phát hiện được các mẫu giống cà chua mang các gen Ty-1, Ty-2, Ty-3 kháng TYLCV.

- Đánh giá được khả năng kháng TYLCV của các giống cà chua.

- Đánh giá và tuyển chọn được một số mẫu giống cà chua triển vọng trong vụđông xuân tại Gia Lâm – Hà Nội

1.2.2 Yêu cầu

- Đánh giá được các đặc điểm nông sinh học, năng suất và chất lượng quả củacác mẫu giống cà chua thu thập

- Sử dụng chỉ thị phân tử DNA phát hiện các gen Ty-1, Ty-2, Ty-3 kháng

virus xoăn vàng lá trong tập đoàn giống cà chua thu thập

- Đánh giá được khả năng kháng bệnh xoăn vàng lá của các giống cà chuamang gen kháng và một số mẫu giống triển vọng bằng phương pháp ghép lây nhiễm

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giá trị của cây cà chua và các yếu tố ảnh hưởng sự sinh trưởng và phát triển của cà chua

2.1.1 Giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế của cây cà chua

Cà chua (Lycopersicon esculentum Mill) thuộc họ cà Solanaceae là loại rau ăn

quả có nguồn gốc từ Nam Mỹ Nhiều nghiên cứu và phân tích thành phần hóa học đãxếp cà chua vào nhóm rau quả dinh dưỡng Trong quả cà chua chín có nhiều đường(glucose, fructose, saccarose), vitamin (A, B1, B2, C), khoáng chất quan trọng (Ca, Fe,

Mg, P…) và các loại axit hữu cơ (citric, malic, galacturolic) Cà chua có thể sử dụng

dễ dàng từ ăn tươi, chế biến, làm nguyên liệu cho sản xuất Về mặt y học cà chua đượccoi là dược liệu chữa bệnh sốt, lao phổi, nhuận tràng Hợp chất tomatin chiết tách từcây cà chua có khả năng kháng khuẩn, diệt nấm và một số sâu bệnh hại Theo Võ VănChi (1997) cà chua có tính mát, vị ngọt giúp tạo năng lượng, tăng sức sống, cân bằng

tế bào, giải nhiệt, điều hòa bài tiết, tăng khả năng tiêu hóa (Trương Văn Nghiệp,2006) Với giá trị dinh dưỡng và giá trị sử dụng cao, cà chua được nhiều người ưachuộng nên nó là loại cây trồng mang lại giá trị kinh tế cao cho người sản xuất Theo

số liệu điều tra năm 2008 của Phòng Nghiên cứu Kinh tế Thị trường (Viện Nghiên cứuRau quả), sản xuất cà chua ở đồng bằng sông Hồng cho thu nhập bình quân 42-64.8triệu/ha/vụ với mức lãi 15-16 triệu/ha, cao gấp nhiều lần so với trồng lúa (Trần TuyếtLan Hương, 2009)

2.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của cây cà chua

- Nhiệt độ: Cà chua ưa thích khí hậu ấm áp, khả năng thích nghi rộng Cà chua

chịu được nhiệt độ cao nhưng lại mẫn cảm ở nhiệt độ thấp Cà chua có thể sinh trưởngphát triển trong phạm vi nhiệt độ 15-350C và sẽ không phát triển ở nhiệt độ quángưỡng hoặc dưới ngưỡng Nhiệt độ tối thích cho cà chua vào ban ngày là 18-270C,đêm từ 12-150C Nhiệt độ ban ngày hạ thấp xuống 10-120C sẽ làm cây ngừng sinhtrưởng, rụng nụ và hoa Theo Tiwari và Choudhury (1993) thì nhiệt độ tối ưu cho hạt

cà chua nảy mầm là 24-250C, nhiều giống nảy mầm nhanh ở nhiệt độ 28-320C Nhiệt

độ quá cao làm hạt mọc chậm, dễ mất sức sống, mầm bị dị dạng

Nhiệt độ còn ảnh hưởng lớn đến ra hoa và đậu quả ở cà chua Trong thời kỳphân hóa mầm hoa, nhiệt độ không khí và nhiệt độ đất ảnh hưởng đến số lượnghoa/chùm Theo Trần Trực (2009) thì số hoa/chùm đạt cao hơn ở 140C Nhiệt độkhông khí trên 300C ngày và 250C đêm làm tăng số đốt dưới chùm hoa đầu, nếu nhiệt

độ ngày tăng hơn và nhiệt độ đất trên 210C làm giảm số hoa/chùm (Kuo và cộng sự,1998) Theo Trần Khắc Thi và cộng sự (1999) nhiệt độ 270C kéo dài cũng hạn chế sinhtrưởng, ra hoa và đậu quả cà chua Các tế bào phôi và hạt phấn sẽ bị hủy hoại khi nhiệt

độ ban ngày trên 380C, nếu nhiệt độ ban đêm trên 210C khả năng đậu quả sẽ giảm.Nhiệt độ trên 300C ngày và 240C đêm có xu hướng làm giảm kích cỡ hoa, trọng lượngnoãn, bao phấn và số ngăn hạt Nhiệt độ cao còn làm giảm số lượng hạt phấn, sức sốnghạt phấn cũng như noãn (Kuo và cộng sự, 1998)

- Ánh sáng: Cà chua là cây ưa ánh sáng nhưng không nhạy cảm với độ dài

chiếu sáng (Trần Khắc Thi, 1995) Tuy nhiên chất lượng ánh sáng ảnh hưởng đến sinhtrưởng phát triển của cây cà chua Ánh sáng đỏ làm tăng tốc độ phát triển của lá, ngănchặn sự phát triển của chồi bên, thúc đẩy quá trình tạo Lycopen và Caroten

Cường độ ánh sáng cũng ảnh hưởng nhiều tới sinh trưởng phát triển cây càchua Cường độ ánh sáng tối thiểu cho cà chua sinh trưởng phát triển là 4000lux (TạThu Cúc, 1985) Cường độ ánh sáng cao làm tăng diện tích lá và tốc độ sinh trưởngcủa cây Theo Mai Phương Anh (1996) thì cường độ ánh sáng cần cho cà chua ra hoa,đậu quả không được thấp hơn 10000lux và khoảng thích hợp là 14000-20000lux Ánhsáng có cường độ thấp sẽ tạo nên những hạt phấn không có sức sống và vòi nhụy vươndài, gây khó khăn cho sự thụ phấn, giảm khả năng thụ tinh dẫn đến năng suất giảm vàquả bị dị hình (Kallo, 1993)

Các quá trình sinh lý cơ bản của cây đều chịu ảnh hưởng của chế độ nước trongcây Cà chua là cây ưa ẩm, chịu hạn nhưng không chịu úng Do có khối lượng thân lálớn, hoa, quả nhiều, năng suất cao nên cây có nhu cầu nước khá lớn Để tạo được 1 tấn

khối lượng khô, cà chua cần 570-600m3 nước, muốn có năng suất 50 tấn/ha cà chuacần 6000m3 nước/ha.

- Nước và độ ẩm: Nhu cầu nước thay đổi theo từng giai đoạn sinh trưởng, phát

triển của cây cà chua Hạt có thể nảy mầm khi lượng nước đạt 325-364% trọng lượng

và độ ẩm đạt 70% Trong quá trình sinh trưởng và phát triển yêu cầu ẩm độ đất là 80% còn độ ẩm không khí là 45-55% Goxhy và Gerad (1971) cho rằng thời kỳ khủnghoảng nước tính từ khi ra hoa đến đậu quả Ở thời kỳ này nếu hạn vừa phải sẽ làmgiảm năng suất nhưng tăng về chất lượng và rút ngắn thời gian chín Nếu giai đoạn nàythiếu nước sẽ gây ra hiện tượng thối đáy quả, quả bị rám do canxi bị giữ ở các bộ phậngià và không được vận chuyển đến bộ phận non Tuy nhiên nếu độ ẩm tăng đột ngột sẽlàm chất lượng quả, dễ gây ra nứt quả

70 Đất và chất dinh dưỡng: Cà chua có thể sinh trưởng, phát triển trên nhiều loại

đất, nhưng cà chua sinh trưởng phát triển thích hợp nhất trên các loại đất nhẹ, tơi xốp,tưới tiêu thuận lợi, độ pH từ 6-6.5 Đặc biệt cần thường xuyên luân canh cà chua vớicác cây trồng họ hòa thảo Tránh trồng liên tục nhiều vụ trên một chân ruộng hoặc trêncác chân ruộng mà cây trồng trước là những cây họ cà (Trần Trực, 2009)

Về dinh dưỡng cà chua có nhu cầu với nhiều nguyên tố nhưng quan trọng nhất

là 12 nguyên tố: Nitơ (N), Phốt pho (P), Kali (K), Lưu huỳnh (S), Magiê (Mg), Bo (B),Sắt (Fe), Mangan (Mn), Đồng (Cu), Kẽm (Zn), Molipden (Mo) và Canxi (Ca) Đối vớinhóm nguyên tố đa lượng thì nhu cầu đạm là cao nhất, thứ đến là kali và lân TheoMore (1978) để có 1 tấn cà chua cần 2.9 kg N; 0.4 kg P; 0.4 kg K; 0.45 kg Mg.Becseev cho rằng để tạo 1 tấn quả cà chua cần 3.8 kg N; 0.6 kg P2O5; 7.9 kg K2O(Kiều Thị Thư, 1998) Theo Kuo và cộng sự (1998), lượng phân cần bón cho cà chuasinh trưởng vo hạn là 180 kg N; 80 kg P2O5; 180 kg K2O Các nguyên tố đa lượng khiđược bón nhiều lần sẽ cho năng suất tương đối cao, đồng thời làm tăng hàm lượngđường trong quả Bên cạnh các nguyên tố đa lượng thì việc cung cấp đầy đủ cácnguyên tố vi lượng cũng góp phần nâng cao năng suất, chất lượng của cà chua Đặcbiệt, việc bón thêm Ca sẽ hạn chế bệnh thối đầu quả

Tùy theo từng giai đoạn sinh trưởng, phát triển mà nhu cầu về lượng và loạidinh dưỡng là khác nhau Với cây cà chua, nhu cầu sử dụng dinh dưỡng ở giai đoạncây con là cao hơn so với cây trưởng thành nên cần tập trung bón ngay từ đầu Cácthời kỳ bón phân là: ra nụ, hoa rộ, quả non, quả phát triển và sau thu hái lần 1.

2.2 Bệnh xoăn vàng lá ở cây cà chua

2.2.1 Nguyên nhân, cơ chế gây bệnh và triệu chứng bệnh

Tác nhân gây bệnh xoăn vàng lá cà chua được xem là một phức hợp nhiều

begomovirus khác nhau Mặc dù nhóm geminivirus này bao gồm các loài riêng biệt, nhưng chúng vẫn được gọi chung là virus xoăn vàng lá cà chua - Tomato yellow leaf curl virus (Vidavski, 2007) Begomovirus là chi lớn nhất trong họ Geminivirus, vì thế hình thái phân tử của begomovirus cũng giống như của các geminivirus khác, đều là hình cầu kép Các begomovirus có bộ gen DNA sợi vòng đơn có kích thước 2.6-2.8

kb Chúng có bộ gen kép gồm 2 phân tử DNA gọi là DNA-A và DNA-B hoặc có bộgen đơn tương đương DNA-A (Seal và cộng sự, 2006) Tuy nhiên hầu hết các

begomovirus gây hại phổ biến liên kết với bệnh xoăn vàng lá đều là begomovirus bộ gen đơn (Garcia và cộng sự, 2008) Genome của TYLCV bao gồm các gen mã hóa cho

protein liên quan tới sự tái sinh (Rep), protein tăng cường tái sinh (REn), protein hoạthóa phiên mã (TrAP), protein vỏ (CP), protein C2 và protein C4 Khung đọc mở(ORF) được tổ chức theo 2 chiều ngược nhau Giữa 2 vùng gen mã hóa ngược chiềunhau là một vùng gen không mã hóa IR (intergenic region) chứa các yếu tố quan trọngcho tái sinh và phiên mã của genome virus bao gồm gốc tái sinh

Cơ chế gây bệnh của begomovirus là do tương tác với các yếu tố ký chủ liên quan đến bộ máy tái bản Quá trình tái bản của begomovirus xảy ra trong nhân tế bào,

kể cả ở các tế bào không phân chia Do vậy, sau khi nhiễm vào tế bào, begomovirus

phải khởi động bộ máy tái sinh của tế bào Một trong các protein của tế bào ký chủ

thực vật điều khiển chu kỳ tế bào là pRBR (protein retinoblastoma -related protein) chịu trách nhiệm chuyển chu kỳ tế bào từ pha G1 sang pha S Protein Rep của begomovirus đã được chứng minh tương tác với pRBR của tế bào ký chủ, cho phép

khởi động lại chu kỳ tế bào để tạo điều kiện cho virus tái sinh (Hà Viết Cường, 2008)

Ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới cà chua thường bị bệnh xoăn vàng lá đãlàm giảm đáng kể năng suất quả, có thể mất 100% năng suất nếu cây bị bệnh sớm(Peter Hanson, 2010) Cây cà chua bị nhiễm vi rút xoăn vàng lá sẽ phát triển chậmchạp và trở nên còi cọc hoặc lùn Lá con thường xuất hiện triệu chứng ngay sau khinhiễm, lá cúp xuống và hướng vào trong, lá cứng, mép lá cong hướng lên trên, sau

đó lá vàng đi rõ rệt Khi cây con bị nhiễm chúng cực ít tạo quả thương mại được

(Cohen và cộng sự, 1964).

Hiện nay, trên thế giới bệnh xoăn vàng lá được biết có liên quan tới ít nhất 11

loài và hơn 25 chủng monopartite begomoviruses (Fauquet và cộng sự, 2008) Ở Việt

Nam mới chỉ phát hiện khoảng 6 loài begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá, trong đóđược phát hiện trên cây cà chua ở Hà Nội (Bảng 1) Việc phát triển các cặp mồi đặchiệu để phát hiện loài nào gây bệnh là rất cần thiết Ha và cộng sự, (2008) đã phát triển

2 cặp mồi đặc hiệu phát hiện 2 loài TYLCVNV và ToLCVV.

Bảng 1 Các loài virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua phát hiện ở Việt Nam

STT Tên loài virus phát hiện Địa điểm Tài liệu tham khảo

1 Tomato leaf curl Vietnam virus

2 Tomato yellow leaf curl Vietnam

3 Tomato yellow leaf curl

Kanchanaburi (TYLCKaV) Bình Dương Green và cộng sự, 2001

4 Tomato leaf curl Hainan virus

5 Tomato leaf curl Hanoi virus

6 Tomato leaf curl Dan Xa virus

2.2.2 Vector bọ phấn và sự lan truyền bệnh

Begomovirus lan truyền ngoài tự nhiên nhờ bọ phấn Bemisia tabaci theo kiểu bền vững tuần hoàn (Cohen và Hapaz, 1964) Bọ phấn B tabaci có một số biotypes khác nhau nhưng trong đó có 2 biotypes cho hiệu quả lan truyền TYLCV cao nhất là

biotype B và Q (Brown và cộng sự, 1995) Giai đoạn trưởng thành và ấu trùng 1 tuổi

là 2 giai đoạn duy nhất mà côn trùng có thể thu nạp và truyền TYLCV (Cohen và cộng

sự, 1966; Mehta và cộng sự, 1994) Một bọ phấn cũng có thể thu nạp TYLCV và

truyền sang cây cà chua mặc dù tỷ lệ truyền bệnh không cao, tỉ lệ truyền bệnh đạt100% nếu sử dụng 5 – 15 bọ phấn

Bọ phấn dùng vòi chọc vào mô mạch dẫn để hút dịch cây từ mạch phloem.Virus được hút qua vòi, tới diều, thấm qua màng ruột vào xoang cơ thể, đạt tới tuyếnnước bọt và cuối cùng vào ống nước bọt (Hà viết Cường, 2008) Trong quá trình di

chuyển của begomovirus trong vector bọ phấn, vỏ capsid là cấu trúc tiếp xúc với các

mô của bọ phấn và tương tác với chaperon và các thụ thể của bọ phấn (Morin và cộng

sự, 2000) Tính đặc hiệu vector của geminivirus được quyết định bởi protein capsid

(CP) và không có bằng chứng nào cho thấy có sự liên quan của những protein mã hóa

khác của virus trong sự truyền (Noris và cộng sự, 1998) Hạt begomovirus cần phải

vượt qua thành ruột vào huyết tương trên đường tới tuyến nước bọt Huyết tương trongxoang cơ thể bọ phấn có huyết thanh tiêu hóa protein ngoại, vi sinh vật và mảnh vụn

mô (Chapman, 1991) Do đó vận chuyển virion phải đối mặt với môi trường thù địchđặc biệt Một chất tương đồng GroEL sản sinh bởi vi khuẩn cộng sinh với bọ phấn đượcchỉ ra đóng vai trò quan trọng trong sự lan truyền virus, bảo vệ begomovirus trong huyếttương (Gibbs, 1999) Các bằng chứng cho thấy, GroEL bám vào và bảo vệ begomovirus

khỏi sự suy giảm bởi huyết tương Sự phá vỡ liên kết GroEL-TYLCV dẫn đến sự suy

giảm của virus và sự giảm rõ rệt trong hiệu quả truyền (Morin và cộng sự, 2000)

Thời gian chích nạp và chích truyền tối thiểu là khoảng 10-20 phút Tỷ lệ truyềntăng lên với thời gian chích nạp và chích truyền virus lâu hơn Một khoảng thời gian

tối thiểu 8h từ lúc bắt đầu chích nạp là cần thiết để cho bọ phấn B.tabaci có thể lây

nhiễm sang cây cà chua DNA virus có thể được phát hiện trong bọ phấn bởi PCR sauchích nạp 5 phút và trong cây cà chua chưa đầy 5 phút sau chích truyền (Atzmon vàcộng sự, 1998) Bọ phấn cái truyền virus hiệu quả hơn bọ phấn đực, thí nghiệm lâynhiễm 1 bọ phấn /1 cây cho thấy bọ phấn cái có hiệu quả lây nhiễm cao hơn con đực(Martin, 1987) Hiệu quả truyền tốt nhất khi bọ phấn trưởng thành ở 1-2 tuần tuổi và

giảm dần theo thời gian sinh trưởng của bọ phấn Hiệu quả truyền virus giảm theo tuổithọ là do lượng virus được chích nạp giảm (Czosnek và cộng sự, 2002) Sự truyền

của một begomovirus bởi một côn trùng từ cùng một vùng địa lý giống nhau là hiệu

quả hơn trong trường hợp virus và côn trùng từ 2 vùng khác biệt (McGrath vàHarrison, 1995)

TYLCV tồn tại trong toàn bộ vòng đời của vector bọ phấn Bọ phấn xuất hiện

trong suốt 24h và được cho ăn trên cây không phải là ký chủ thì sau 24h chích nạp vẫn

giữ TYLCV trong toàn bộ vòng đời 35-40 ngày của chúng (Rubinstein và Czosnek,

1997) Trong giai đoạn này tỷ lệ truyền giảm từ 100% xuống tới 15% DNA virusđược phát hiện trong toàn bộ vòng đời của bọ phấn, ngược lại protein vỏ capsid chỉ tồn

tại trong bọ phấn trong 12 ngày Sự liên kết của TYLCV với vector bọ phấn càng lâu

dẫn đến giảm 20% tuổi thọ và 50% số lượng trứng của bọ phấn (Rubinstein vàCzosnek, 1997)

Từ trước năm 1998 người ta vẫn cho rằng bọ phấn không có khả năng truyềnvirus sang thế hệ sau, chỉ có ấu trùng và bọ phấn trưởng thành có thể thu nạp virus

Tuy nhiên, trong năm 1998 đã có tuyên bố là TYLCV-MLD có thể được truyền thông

qua trứng ít nhất 2 thế hệ (Ghanim và cộng sự, 1998) Ghanim (2000) đã báo cáo

TYLCV-MLD có thể được truyền thông qua giao phối giữa bọ phấn cái và bọ phấn đực Một báo cáo khác (Bosco và cộng sự, 2004) đã chỉ ra đối với chủng virus TYLCV

Israeli rằng không có DNA virus hay sự lây nhiễm liên kết với thế hệ con cháu của bọ

phấn chứa virus Cách thức TYLCV xâm nhập vào hệ thống sinh sản của bọ phấn chưa

được biết Có khả năng trong quá trình thành thục của trứng trong buồng trứng, các hạtvirus thâm nhập vào trứng cùng với các vi khuẩn cộng sinh thông qua kẽ hở ở màng tếbào trứng (Costa và cộng sự, 1995) Bọ phấn ăn trên mạch phloem của cây, vì thế sựlây nhiễm virus tăng nhanh chóng trong toàn bộ cây (Caciagli và cộng sự, 1995)

2.3 Các nguồn cà chua kháng bệnh xoăn vàng

Trong các loài cà chua dại thì S pimpinellifolium là thích hợp nhất cho việc sử

dụng trong chương trình tạo giống kháng bởi không có sự cách ly lai giữa 2 loài và

kích thước quả được phục hồi sau vài lần lai backcross (Esquinas-Alcazar và Nuez,1995) Chương trình chọn tạo giống kháng khởi đầu ở Israel sử dụng mẫu giống

LA121 của S pimpinellifolium như một nguồn kháng (Pilowsky và Cohen, 1974) Sau

đó các vật liệu mới của S pimpinellifolium được tìm thấy INRA, LA1478, PI407543

và PI407544 với các mức độ kháng khác nhau (Kasrawi, 1989; Ji và cộng sự, 2007)

Tính kháng TYLCV bắt nguồn từ S pimpinellifolium- INRA được chứng minh là do

một gen trội đơn Mẫu giống lai L102 bắt nguồn từ vật liệu kháng UPV-16991 sở hữu

một tính kháng cao với TYLCV (Pérez và cộng sự, 2007) Phân tích lai giữa giống lai

Hirsute - INRA với giống mẫn cảm S Harmony của Pháp bằng phương pháp BSA với

4 chỉ thị RAPD (random amplified polymorphic DNA) đã phát hiện tính kháng liênkết với một locus tính trạng số lượng (QTL) chịu trách nhiệm 27.7% khả kháng Cácchỉ thị này định vị trong cùng nhóm liên kết trong khoảng cách 17.3 cM được lập bản

đồ trên nhiễm sắc thể số 6 trên bản đồ đa hình độ dài đoạn cắt giới hạn (RFLP)(Chagué và cộng sự, 1997) Một trong chỉ thị RAPD được lập bản đồ giữa 2 marker

TG153 (33 cM) và CT83 (34 cM) ở gần locus Ty-3 một locus gen kháng khác được

lập bản đồ trên nhiễm sắc thể số 6 gần đây (Ji và cộng sự, 2007) Mặc dù nguồn gen

kháng được tìm thấy trong S pimpinellifolium nhưng nó không phải là nguồn tạo

giống kháng chính trong chương trình chọn tạo giống hiện nay vì tính trạng kháng của

nó không liên tục, tính kháng của S pimpinellifolium không có hiệu quả ở một số

vùng Vì thế các nguồn kháng khác được nghiên cứu nhiều hơn

Vật liệu chống chịu S.peruvianum PI-126935 được tìm ra và tính chống chịu

này là một tính trạng lặn kiểm soát bởi 5 yếu tố di truyền (Pilowsky và Cohen, 1990).Vào năm 1988, giống lai kháng thương mại đầu tiên TY 20 mang tính kháng bắt

nguồn từ S peruvianum (mẫu giống PI 126935) được tung ra trên thị trường (Pilowsky

và Cohen, 1990) Tính kháng trong TY-20 cảm ứng một sự trì hoãn phát triển triệu

chứng bệnh sau lây nhiễm và cây nhiễm cho năng suất có thể chấp nhận được Sau đó,

các nhà chọn giống ở Israel sử dụng các mẫu giống của S.peruvianum PI26926, PI26930, PI390681 và LA441 để chọn tạo các dòng cà chua có tính kháng cao TY-

172, TY-198, TY-536 và TY-197 (Friedmann và cộng sự, 1998; Lapidot và cộng sự, 1997) Tính kháng trong TY-172 là trội một phần và có ít nhất 3 gen giải thích cho tính

kháng này (Friedmann và cộng sự, 1998) Sự đánh giá so sánh tính kháng giữa các

mẫu giống 8484, 3761, Fiona, Tyking, 172 và 197 chỉ ra rằng cây cà chua

TY-172 và TY-197 bị mất năng suất tương đối ít và có mức DNA virus tích lũy trong cây ít nhất (Lapidot và cộng sự, 1997) Tính kháng của TY-172 được bắt nguồn từ 4 mẫu giống S peruvianum khác nhau (Friedmann và cộng sự, 1998) Tính kháng được kiểm

soát bởi một QTL chính chưa biết trước có nguồn gốc từ dòng kháng và 4 QTL phụ

thêm vào QTL chính gọi là Ty-5 lập bản đồ trên nhiễm sắc thể số 4 và kiểm soát

39.7-40% mức độ nghiêm trọng của triệu chứng ở trong các cây phân ly Các QTL phụnguồn gốc từ bố mẹ kháng hoặc mẫn cảm được lập bản đồ trên nhiễm sắc thể số 1, 7,9

và 11 góp vào 12% mức độ biến động triệu chứng (Ilana và cộng sự, 2009)

S chilense sở hữu một tính kháng cao với TYLCV, tuy nhiên ban đầu những hạn

chế trong khả năng lai với cây cà chua trồng nên khó có thể dùng làm nguồn khángtrong chọn tạo giống Về sau, người ta đã vượt qua các rào cản này nhờ sử dụng kỹthuật hỗn phấn, khắc phục di truyền và nuôi cấy phôi Hai gen kháng chính đã đượclập bản đồ và thiết lập các chỉ thị phân tử (Laterrot, 1983; Esquinas-Alcazar và Nuez

1995; Ji và Scott, 2006; Ji và cộng sự, 2007) Bằng việc sử dụng các mẫu giống của S chilense và kỹ thuật hỗn hợp hạt phấn, một số dòng giống cải tiến (UPV Ty 1, 3, 6, 9,

17 và 53) thể hiện mức tính kháng cao với TYLCV-Sardinia (Picó và cộng sự, 1999).

Hiện nay, hầu hết tính kháng của cây cà chua thương mại với bệnh xoăn vàng lá đều

có gen Ty-1(Pérez và cộng sự, 2007) Gen Ty-1 được tìm thấy đầu tiên ở S chilense

mẫu giống LA1969 là một gen trội kiểm soát một phần tính trạng kháng cùng với ít

nhất 2 gen phụ (Zamir và cộng sự, 1994) Gen Ty-1 được lập bản đồ trên nhiễm sắc thể

số 6 nằm giữa marker TG297 (4 cM) và marker TG97 (9 cM) và trên nhiễm sắc thể số

3 giữa marker TG66 và TG33 (Zamir và cộng sự, 1994)

Ba mẫu giống từ S chilense LA1932, LA2779 và LA1938 được tìm ra có tính kháng với Tomato mottle virus (ToMoV) ngoài TYLCV (Agrama và Scott, 2006) Việc

đưa vào dòng mẫn cảm, nghiên cứu di truyền học và lập bản đồ QTL đã tiết lộ 3 vùng

trên nhiễm sắc thể số 6 góp phần vào tính kháng cả TYLCV và ToMoV (Agramavà

Scott, 2006) Trong nghiên cứu gần đây, nhiều chỉ thị được sử dụng để định vị sựchuyển tính kháng vào trong dòng giống cải tiến bắt nguồn từ LA2779 Một gen trội

một phần gọi là Ty-3 được lập bản đồ trên nhiễm sắc thể số 6 giữa 2 marker

cLEG-31-P-16 và T1079 (Ji và Scott, 2006; Ji và cộng sự, 2007a) Sự chuyển tính kháng bắt

nguồn từ LA2779 được phát hiện cũng chứa gen kháng Ty-1 đề xuất một liên kết di truyền giữa Ty-1 và Ty-3 (Ji và cộng sự, 2007a) Gần đây, việc sử dụng các dòng giống cải tiến bắt nguồn từ 3 mẫu giống của S chilense đã đề cập ở trên đã đưa đến một locus mới kháng TYLCV gọi là Ty-4 được lập bản đồ trên nhánh dài của nhiễm sắc thể

số 3 (Ji và cộng sự, 2008)

Các mẫu giống của S.habrochaites LA0386, LA1252, LA1295, LA1352, LA1393, LA 1624 và LA1691 có tính kháng rất cao với TYLCV (Hassan và cộng sự, 1982) Đó là tính kháng trội Trong một số mẫu giống của S.habrochaites, tính chống chịu TYLCV có tác dụng gián tiếp để ngăn cản sự ăn của vector bởi các rào cản vật lý

như là lông lá hoặc bởi sự tiết ra một loại chất hóa học nào đó ngăn cản sự ăn của bọphấn (Muniyappa và cộng sự, 1991a; Channarayappa và cộng sự, 1992) Tính kháng

TYLCV được đưa vào từ 2 mẫu giống của S.habrochaites (LA1777 và LA0386) Hai

dòng cà chua BC1F4 gọi là 902 và 908 được bắt nguồn từ sự đưa vào tính kháng này(Vidavsky và Czosnek, 1998)

Phân tích sự phân ly chỉ ra rằng 2 đến 3 gen lặn thêm vào kiểm soát tính kháng

TYLCV trong dòng Ih902 trong khi ở trong dòng Ih908 tính kháng kiểm soát bởi 1 gen

trội chính (Vidavsky và Czosnek, 1998) Một dòng kháng cao Ih902 được sử dụngrộng rãi trong chương trình chọn tạo giống ở Guatemala (Mejía và cộng sự, 2005) và

các nước Trung Đông khác (Maruthi và cộng sự, 2003) Ở Ấn Độ, S.habrochiates f glabratum B6013 đã chỉ ra 2 gen trội kiểm soát tính kháng Tomato leaf curl viruses

(ToLCV) (Banerjee và Kalloo, 1987) Sau đó, dòng chọn giống H24 được phát triển từmẫu giống này (Kalloo và Banerjee, 1990) Hanson và cộng sự (2000) đã sử dụng 3

isolate khác nhau của TYLCV để phân tích H24 sàng lọc cây kháng Locus kháng này

được lập bản đồ trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể số 11 giữa marker TG393 và TG36

và là tính kháng trội (Hanson và cộng sự, 2000) Tuy nhiên các nghiên cứu về sau chỉ

ra rằng các isolate virus này thực tế là ToLCV chứ không phải TYLCV Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng locus kháng nằm gần marker TG36 hơn và được đề cử là Ty-2

(Hanson và cộng sự, 2006) H24 phản ứng với sự lây nhiễm TYLCV khác nhau, độ

nhạy cảm phụ thuộc vào chủng (Ji và cộng sự, 2007b) Ở Trung tâm Phát triển và

Nghiên cứu Rau Châu Á, tính kháng Ty-2 là nguồn kháng khởi đầu của sử dụng trong

chương trình chọn giống cà chua và được khai thác rộng rãi bởi một số công ty giống

ở Châu Á và ở những nơi khác (Ji và cộng sự, 2007b) Kết quả sơ bộ cho thấy sự hiện

diện của Ty-3 trong dòng 902, tuy nhiên những tác động của nó trên tính kháng trong

dòng cà chua vẫn còn được đánh giá (Ji và cộng sự, 2007b)

Tính kháng của S.cheesmaniae là lặn và đa gen (Hassan và cộng sự, 1984) Ở

Ai Cập, việc đưa gen kháng từ S.cheesmaniae vào cà chua trồng thương mại đã tạo ra

dòng mới, tạo giống kháng vừa phải (dòng 44) (Hassan và cộng sự, 1984) Loài càchua này không phải là một nguồn kháng có ý nghĩa trong cà chua trồng thương mạihiện nay

Từ các nghiên cứu ở trên cho thấy các loài cà chua dại S chilense, S habrochaites, và S peruvianum cung cấp khả năng kháng tốt và đã được sử dụng rộng

rãi trong chương trình tạo giống để phát triển các giống cà chua thương mại kháng

TYLCV.

2.4 Ứng dụng chỉ thị DNA phân tử trong nghiên cứu các gen kháng TYLCV

Nhờ những thành tựu thu được trong công nghệ sinh học, các nhà khoa học đãtìm được vị trí các gen được định vị trên từng nhiễm sắc thể, cũng như các chỉ thị phân

tử ADN liên kết với các gen đó, tạo ra các bản đồ di truyền liên kết gen Dựa vào cácchỉ chị này, chúng ta có thể phát hiện được sự có mặt của một gen bất kỳ, nếu biếtđược một hoặc nhiều chỉ thị liên kết chặt với gen đó

Zamir và cộng sự (1994) đã lập bản đồ gen Ty-1 nằm trên nhiễm sắc thể số 6 và

là gen kháng trội bắt nguồn từ loài cà chua dại Soladium chilense LA 1969 Gen này

định vị giữa 2 marker TG297 (6.0 cM) và TG97 (8.6 cM) nằm trong “vùng nóng”

chứa nhiều gen kháng như gen Am kháng Alfalfa mosaic virus (Parrella và cộng sự, 2004), gen Ol-1 kháng bệnh mốc sương (Huang và cộng sự, 2000), gen Cf-4 kháng nấm Cladosporium fulvum (Thomas và cộng sự, 1997), và gen Mi-1 kháng tuyến trùng

(Sean và cộng sự, 2007) Trong đó vùng chứa gen Mi-1 và Ty-1 thường rất ngắn nên

rất có khả năng hạn chế tái tổ hợp xảy ra giữa 2 gen này khi chuyển gen kháng vào cà

chua trồng Vì vậy, các marker liên kết với gen Mi-1 có thể sử dụng cho gen Ty-1: Pe

´rez de Castro và cộng sự (2007) đã lập bản đồ 6 marker ở vùng gen Mi-1 và Ty-1 và

chỉ ra rằng SCAP marker JB1 cho thấy sự đa hình giữa các mẫu giống kiểm tra và liên

kết chặt với gen Ty-1 Để phát hiện locus Ty-1 thì 4 chỉ thị sau được phát triển: Chỉ thị

SCAP TG97 (8 cM), chỉ thị SCAR đồng trội P6-6 (6 cM), chỉ thị CAPS sử dụng

marker SCAR đồng trội Mi23 đối với locus Mi-1 (6 cM), chỉ thị CAPS JB-1 (8 cM)

(Mejía và cộng sự., 2005; Garcia và cộng sự, 2007; Pérez và cộng sự, 2007) Hầu hết

các cây trồng thương mại kháng bệnh xoăn lá đều có gen Ty-1.

Hanson và cộng sự (2000) đã lập bản đồ gen Ty-2 bắt nguồn từ Solanum habrochaites trên nhánh dài của nhiễm sắc thể số 11, nằm giữa marker TG36 (84 cM)

và TG393 (103 cM) ở dòng cà chua lai H24 Cây ở trạng thái đồng hợp tử trội pháttriển triệu chứng vàng nhẹ dọc theo mép lá với tỷ lệ nhiễm bệnh sau 11 tuần lây nhiễm

là 17- 36%, cây ở trạng thái dị hợp tử có tỷ lệ nhiễm bệnh 20- 46% (Hanson và cộng

sự, 2000) SCAR marker T0302 được sử dụng để phát hiện gen Ty-2 (Garcia, 2007 ) Hai cặp mồi T0302F/T0302R và T0302F/TY-2R1 đều nhận biết hiệu quả 2 kiểu gen Ty-2/Ty-2 và Ty-2/Ty-2 nhưng cặp mồi T0302F/TY-2R1 cho vạch băng của kiểu gen dị

hợp tử rõ ràng hơn cặp mồi T0302F/T0302R (Garcia, 2007)

Gen Ty-3 bắt nguồn từ Solanium chilense được định vị trên nhánh dài của

nhiễm sắc thế số 6 giữa 2 marker cLEG-31-P16 (20 cM) và T1079 (27 cM) cách gen

Ty-1 khoảng 15cM Ji và cộng sự (2007a) đã dùng SCAR marker P6-25 để phát hiện gen kháng Ty-3 Hiện nay chưa có thêm marker nào liên kết chặt hơn với gen này Locus này chiếm 65% độ biến động trong tính kháng TYLCV, có ảnh hưởng trội và

ảnh hưởng thêm vào gần bằng nhau, vì thế đây là locus kháng chính (Ji và cộng sự,

2007a) Gen Ty-3 khác với gen Ty-1 và Ty-2 ở hai mặt Đầu tiên, Ty-3 có thể có hiệu quả kháng với cả TYLCV và begomovirus bộ gen kép ToMoV trong khi Ty-1 và Ty-2 chỉ kháng được begomovirus bộ gen đơn TYLCV Ngoài ra, Gen Ty-1 và Ty-2 biểu hiện gần như trội hoàn toàn trong khi Ty-3 có biểu hiện cộng vào (additive) nhiều hơn Gen Ty-3 là gen kháng chính được giải thích bởi mức độ biến thiên kiểu hình cao ở 2 mẫu

giống nhưng các gen kháng khác cần được đưa vào để tăng tính kháng (Ji và cộng sự,2009).

Gen Ty-4 được tìm thấy ở cà chua dại Soladium chilense nằm trên nhánh dài

của nhiễm sắc thể số 3 giữa hai marker C2_At4g17300 (81 cM) và C2_At5g60160

(83.3 cM) Trong khi khoảng 60% mức độ biến động trong tính kháng TYLCV trong quần thể phân ly được giải thích bởi locus gen Ty-3 thì Ty-4 chỉ chiếm 16%, vì thế được coi là locus kháng phụ so với Ty-3 Các cây lai từ cây có kiểu gen Ty-3 và Ty-4

có tính kháng tốt hơn đối với cả begomovirus bộ gen đơn và bộ gen kép cho thấy Ty-4

cũng có hiệu quả kháng với begomovirus bộ gen kép (Ji và cộng sự, 2009)

Anbinder và cộng sự, (2009) đã phát hiện gen kháng Ty-5 từ Solanum peruvianum trên cà chua lai TY-172, nằm ở vùng gần marker SlNAC1 trên nhiễm sắc

thể số 4 Độ biến động của triệu chứng của locus này đo được khoảng 39.7–46.6% ởcác cây phân ly, do đó là gen kháng chính Đây là gen kháng chính phổ rộng với

TYLCV và ToMoV và nhiều begomovirus bộ gen kép khác (Hutton và cộng sự, 2011).

Gen Ty-1 nằm trên NST số 3 Gen Ty-2 nằm trên NST số 11

Gen Ty-3 nằm trên NST số 6 Gen Ty-4 nằm trên trên NST số 3

Gen Ty-5 nằm trên NST số 4

Hình 1 Bản đồ khoảng cách di truyền của các gen kháng virus xoăn vàng lá

2.3.3 Cơ chế kháng của cây cà chua đối với TYLCV

Các nghiên cứu di truyền học đã chỉ ra rằng một vài gen như các locus tínhtrạng số lượng cung cấp kiểu hình kháng bệnh xoăn vàng lá Một số locus tính trạng sốlượng được định vị trên nhiễm sắc thể cà chua nhờ sử dụng các marker đa hình DNA

Tuy nhiên cơ sở phân tử của tính kháng TYLCV vẫn còn chưa được hiểu biết đầy đủ.

Để giải thích cái gì làm cho một cây cà chua kháng TYLCV trong khi các cây khác mẫn

cảm, Gorovits và Czonek (2007) đã coi virus là trường hợp đặc biệt của stress và tínhkháng cũng là trường hợp đặc biệt của phản ứng thành công với stress Một phản ứngstress được khởi động khi cây nhận ra stress ở mức độ tế bào, hoạt hóa các đườngtruyền tín hiệu để truyền thông tin bên trong các tế bào và toàn cây, dẫn đến thay đổitrong sự biểu hiện của nhiều mạng lưới gen Do đó, cây phản ứng với các stress bằngcách hoạt hóa 2 đường hướng kháng: phản ứng kháng thông qua gen R (Resistance) vàphản ứng phòng thủ thông qua vận chuyển tín hiệu

Đường hướng phản ứng stress của cây có liên quan đến sự hoạt hóa của protein

R và kết quả là dẫn đến phản ứng siêu nhạy (Hypersensitive Response - HR) và miễn

dịch của cây Khi TYLCV xâm nhiễm vào tế bào cây, các yếu tố của virus bị nhận biết

bởi gen của tế bào cây ký chủ thì lập tức xảy ra phản ứng siêu nhạy tích lũy H2O2 ở vịtrí xâm nhiễm và cảm ứng nhanh chóng quá trình chết tế bào theo chương trình(Programmed cell death - PCD) tác động đến các tế bào ở gần vị trí nhiễm (Bolwell,1999) Các tổn thương nhận biết bởi DAB (3,3’diaminobenzidine) đều giống nhau ởcây kháng R (Resistance) và cây mẫn cảm S (Sensitivity) ở bước đầu của phản ứngthông qua gen kháng R Mức độ nhuộm tăng lên trong cây S khi kéo dài thời gian saulây nhiễm tương ứng với triệu chứng bệnh được cảm ứng bởi virus (Czonek và cộng

sự, 2007) Giai đoạn thứ 2 của tính kháng thông qua gen R là tính kháng tập nhiễm hệthống (Systematic Acquired Resistance - SAR) SAR xảy ra ở những mô xa vị trí bịstress khởi đầu và được đặc trưng bởi sự tăng biểu hiện của một số gen mã hóa raprotein liên quan đến sự gây bệnh (Pathogenesis-related protein - PR) Protein PR baogồm ít nhất 11 họ, trong đó có β-1,3-glucanases, chitinases, và peroxidases Cronek

(2007) đã theo dõi hoạt động của cả 3 enzyme này trong cây sau khi lây nhiễm TYLCV

và kết quả theo dõi cho thấy đều tăng biểu hiện ở cả cây mẫn cảm và cây kháng so vớicây không lây nhiễm Sau khoảng 7-8 tuần lây nhiễm, có sự suy giảm mức độ của cả 3enzyme này nhưng sự suy giảm ở cây kháng R ít rõ rệt hơn trong cây mẫn cảm.

Theo Gorovits và Czonek (2007)

Hình 2: Hình vẽ thể hiện 2 đường hướng phòng thủ của cây

Ngoài đường hướng phòng thủ thông qua gen kháng R, cơ chế phòng thủ của câycòn thông qua các yếu tố vận chuyển tín hiệu như MAPKs, HSPs Tầng protein hoạthóa mitogen (MAPK) tham gia vận chuyển tín hiệu dẫn tới hoạt hóa phản ứng phòngthủ PCD và SAR của cây chống lại bệnh xâm nhiễm (Nuhse và cộng sự, 2000;Desikan và cộng sự, 2001) Protein sốc nhiệt HSP hỗ trợ trong việc hồi phục tế bào từstress bằng cách sửa chữa protein hư hại hoặc phân hủy chúng phục hồi tính nội cânbằng protein và thúc đẩy tế bào sống sót ( Pareek và cộng sự, 1995; Katiyar-Agarwal

và cộng sự, 2003) HSPs bao gồm chaperone và proteases Chaperone giúp proteingấp, lắp ráp chính xác và sửa chữa trong khi thành phần proteases phân hủy cácprotein hư hại có nguy cơ tiềm ẩn (Parsell và Lindquist, 1993) Czonek (2007) báo cáorằng MAPK, HSP70, Clp protease và FtsH protease lúc đầu đều tăng biểu hiện trong

cả cây kháng và cây mẫn cảm nhưng về sau các yếu tố này bị suy giảm mạnh trongcây mẫn cảm.

Như vậy một thời gian ngắn sau khi lây nhiễm TYLCV, cơ chế phòng thủ của cây

S và R được hoạt hóa Sau đó, phòng thủ này bị lấn át trong cây S và những hư hạixuất hiện trên lá đã xử lý Trái lại, cây R chỉ ra một sự suy giảm nhẹ trong biểu hiệnprotein phản ứng stress, tiếp theo là một mức độ phục hồi nhất định Do đó có thể kếtluận rằng khả năng tái thiết lập sự cân bằng nội tế bào cao hơn trong phản ứng vớistress đã làm cho cà chua R kháng được bệnh virus xoăn vàng lá

2.3 Lây nhiễm nhân tạo để đánh giá tính kháng

Để đánh giá tính kháng của các giống cà chua thì việc thử nghiệm bệnh là rất

cần thiết Vì thế, cần phải có một phương pháp lây nhiễm nhân tạo TYLCV sang cây cà chua để kiểm tra TYLCV không lan truyền thông qua cọ sát nên không thể lây nhiễm bằng tiếp xúc cơ học Có 3 phương pháp lây nhiễm TYLCV cho hiệu quả cao đó là:

- Lây bằng cách ghép: sử dụng một đoạn cành, đoạn chồi hoặc ngọn của câybệnh ghép với cây bệnh, phương pháp này cho hiệu quả lan truyền rất cao (AbouJawdah và cộng sự, 1995; Fargette và cộng sự, 1996; Kasrawi và cộng sự, 1988)

- Lây nhiễm qua bọ phấn: phương pháp này sử dụng bọ phấn để lây bệnh từ cây

bông Bởi vì cây bông không phải là cây kí chủ cho bệnh TYLCV và các virus khác lan

truyền thông qua bọ phấn, duy trì khá dễ và có thể chống chịu số lượng lớn bộ phấn

mà không bị sụp đổ Tập đoàn bọ phấn được nuôi trên cây bông sinh trưởng trong lồngbọc vải mỏng để duy trì trong nhà kính ngăn chặn côn trùng Bọ phấn trưởng thành

được cho chích nạp trong 48h trên cây nguồn bệnh nhiễm TYLCV, sau đó chúng được

cho chích truyền trong 48h trên cây cà chua 3 tuần tuổi với số lượng bọ phấn là 20con/cây Sau khi chích truyền, bọ phấn được loại trừ bởi xử lý cây với thuốc diệtcôn trùng pyrethroid Cây được chăm sóc trong nhà kính chặn côn trùng khoảng 3-4tuần ở 26-320C trước khi chuyển ra ngoài ruộng để đánh giá (Lapidot và cộng sự,2001; Inoue-Nagata và cộng sự, 2007) Phương pháp này cho hiệu quả lây nhiễm100% tuy nhiên thường gặp khó khăn trong việc nuôi bọ phấn

15 Lây nhiễm qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens: phương pháp này sử dụng

A tumefaciens để đưa DNA đã nhân dòng của virus vào tế bào kí chủ (Grimsley và cộng sự., 1986,1987) Một đoạn lặp liên tục của genome virus TYLCV được nhân dòng vào vùng T-DNA của Ti pladmid của A tumefaciens, sau đó được đưa vào cây bằng

cách phun vào cây Kết quả là, DNA virus được hình thành và tái sinh, lan truyền hệthống trong cây và cảm ứng triệu chứng bệnh (Stenger và cộng sự, 1991) Tuy nhiên,

việc đưa vào cây DNA đã nhân dòng của TYLCV bởi lây nhiễm vi khuẩn có thể làm

cho virus thoát khỏi tính kháng tự nhiên của cà chua dại

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu nghiên cứu

Vật liệu nghiên cứu gồm 26 mẫu giống cà chua nhập nội và 1 giống đối chứngSavior của công ty Syngenta có năng suất cao và chất lượng quả tốt, khối lượng quảtrung bình lớn, cây sinh trưởng vô hạn

Bảng 2 Danh sách các mẫu giống cà chua và nguồn gốc

STT Ký hiệu Nguồn gốc STT Ký hiệu Nguồn gốc

3.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ Sinh học Phân

tử và Ứng dụng - khoa Công nghệ Sinh học và Trung tâm Bảo tồn và Phát triển Nguồngen Cây trồng Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội, Trâu Quỳ - Gia Lâm – Hà Nộitrong thời gian từ ngày 15/11/2011 đến ngày 31/08/2012

3.3 Nội dung nghiên cứu

- Thí nghiệm 1: Đánh giá một số đặc điểm nông sinh học, năng suất và chấtlượng quả của các mẫu giống trong vụ đông xuân 2011

- Thí nghiệm 2: Sử dụng chỉ thị phân tử DNA (PCR) phát hiện gen kháng Ty-1, Ty-2, Ty-3 trong các mẫu giống cà chua.

- Thí nghiệm 3: Đánh giá khả năng kháng của các mẫu giống mang gen 1,

Ty-2, Ty-3 và một số mẫu giống triển vọng bằng phương pháp ghép lây nhiễm trong vụ

xuân hè 2012

3.4 Phương pháp nghiên cứu

3.4.1 Phương pháp đánh giá một số đặc điểm nông sinh học, năng suất và chất lượng quả của các mẫu giống

Các chỉ tiêu đánh giá đặc điểm nông sinh học, năng suất và chất lượng quả được áp dụng theo hướng dẫn trong tiêu chuẩn ngành 10TCN219: 2006 (Bộ NN và PTNT, 2006) và 10TCN557-2002 (Bộ NN và PTNT, 2002)

- Một số đặc điểm nông sinh học:

+ Thời gian từ trồng đến ra hoa: 50% số cây trong ô thí nghiệm có hoa đầu tiên.+ Thời gian từ trồng đến thu quả đợt 1: 50% số cây theo dõi có quả chín

+ Thời gian từ trồng đến kết thúc thu hoạch: tính đến ngày thu hết quảthương phẩm

+ Dạng cây: thấp, tán gọn; thấp, tán rộng; cao, tán gọn; cao, tán rộng

+ Kiểu hình sinh trưởng: quan sát đặc tính ra hoa và sinh trưởng của cây vào giaiđoạn ra hoa: kiểu hữu hạn, khi cây ra hoa rộ thân chính ngừng sinh trưởng; kiểuvôhạn, cây ra hoa thân chính vẫn tiếp tục sinh trưởng và kiểu bán hữu hạn là trung giangiữa hai kiểu trên

+ Chiều cao cây: đo từ cổ rễ đến đỉnh sinh trưởng, giai đoạn kết thúc thu hoạch

- Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất:

+ Tỷ lệ đậu quả: đếm số quả đậu của 5 chùm hoa đầu tiên của 3 cây vào thời kỳkết thúc đậu quả để xác định tỷ lệ đậu quả trên từng chùm và tỷ lệ đậu quả trung bình,gồm các mức: rất thấp (dưới 10%), thấp (10 - 20%), trung bình (20- 40%), cao (40 -60%) và rất cao (trên 60%)

+ Số quả/cây: tổng số quả các lần thu/cây, theo dõi 5 cây, lấy trung bình

+ Khối lượng trung bình 1 quả (nhóm quả thương mại): tổng khối lượng của sốquả điều tra/số quả

+ Năng suất cá thể (khối lượng quả/cây): tổng khối lượng quả thu được/cây, theodõi 5 cây, tính trung bình Gồm năng suất thương phẩm và năng suất phi thương phẩm.

- Đặc điểm hình thái, độ chắc và chất lượng quả:

+ Chỉ số hình dạng quả: I = H/ D (Chiều cao quả/Đường kính quả) Từ đó phâncác dạng: quả dẹt (I < 0.6), tròn dẹt (0.6 < I < 0.9), tròn (0.9 < I < 1.1), tròn dài (1,3 > I

+ Khẩu vị (*): đánh giá cảm quan theo các mức: chua, chua dịu, nhạt, ngọt dịu,ngọt, ngọt đậm

+ Độ ướt thịt quả (*): dùng dao sắc cắt ngang quả và phân biệt: ướt - mặt thịtquả ướt, có dịch quả chảy ra; khô nhẹ - mặt thịt quả lấm tấm dịch quả; khô - mặt thịtquả ráo nước

(*): theo hướng dẫn của trung tâm nghiên cứu và phát triển giống rau chất lượngcao, Đại học Nông nghiệp Hà Nội

3.4.2 Phương pháp PCR phát hiện các gen kháng TYLCV

3.4.2.1 Tách chiết DNA cà chua

DNA được chiết xuất theo phương pháp CTAB (Doyle và Doyle, 1990)

- Hóa chất và đệm:

+ DEB (DNA Extraction Buffer): 4 % CTAB (w/v), 1,5 M NaCl, 100mM HCl, 20 mM EDTA, 2% PVP (w/v), 2% β - Mercaptoethanol Hòa tan CTAB và các

Tris-hóa chất khác trong nước cất 2 lần bằng cách ủ trong waterbath ở 65oC Thêm 2 % β-Mercaptoethanol ngay trước khi sử dụng.

+ TE buffer: 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0

+ Hóa chất khác: Phenol : Chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1), Chloroform:isoamyl alcohol (24:1), 100 % ethanol, 76 % ethanol

- Qui trình chiết xuất DNA:

+ Thu các lá non vào buổi sáng, đặt trên đá lạnh và đưa về phòng thí nghiệmcàng sớm càng tốt

+ Cắt khoảng 100 mg mô lá vào cối sứ, nghiền nhuyễn mẫu với 400 µl DEB,tiếp tục thêm 400 µl DEB và trộn đều trước khi chuyển hỗn hợp vào tuble 1,5 ml.Đưa ngay các tube vào ủ ở 65oC trước khi chuyển sang nghiền mẫu khác

+ Ủ mẫu ở 65ºC trong 1 giờ hoặc hơn Ủ lâu hơn kết quả năng suất DNA pelletcao hơn, sạch hơn, trắng hơn

+ Chiết xuất với cùng thể tích 25:24:1 (1:1) và trộn nhẹ nhàng bằng cách đảongược các ống trong 5 phút, sau đó ly tâm mẫu 5 phút ở nhiệt độ phòng, 12000 rpm

để phân tách các pha, chuyển pha lỏng phía trên sang một tube 1,5 ml mới Từ bướcnày tránh vortex, hút đi hút lại đặc biệt qua các đầu pipet thể tích nhỏ, và bất cứ thaotác nào gây ra lực cơ học để tránh gây đứt gẫy DNA

+ Chiết với cùng thể tích 24:1, trộn nhẹ nhàng bằng cách lật úp rồi lật ngửa(inverting) tubes trong 3 phút, ly tâm mẫu 5 phút ở nhiệt độ phòng, 12000 rpm,chuyển pha lỏng phía trên sang 1 tube mới

+ Tủa DNA với 2 - 2,5 lần thể ethanol lạnh 100 % sao cho nồng độ làm việckhoảng 70%, nếu không thấy xuất hiện tủa trắng thì đặt mẫu ở -20C trong khoảng 20’đến 2 tiếng hoặc qua đêm nếu thấy cần thiết

+ Ly tâm thu tủa DNA ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, tốc độ 12000 rpm

+ Đổ bỏ cồn, rửa pellet hai lần với ethanol 70% nhằm loại bỏ NaCl và CTAB.CTAB đã được hòa tan trong ethanol, số còn lại được loại bỏ trong bước này(Aldrich và Cullis, 1993) Làm khô pellet trong không khí khoảng 1h và hòa tantrong 50 µl TE

+ Kiểm tra chất lượng và nồng độ DNA bằng điện di trên gel agarose 1% ở hiệu

điện thế 100V trong khoảng 15 phút Độ gọn và sáng của băng DNA cho biết mức độđứt gãy và nồng độ DNA tổng số.

3.4.2.2 Phương pháp sử dụng PCR phát hiện gen Ty-1, Ty-2, Ty-3

Các chỉ thị sử dụng trong nghiên cứu được trình bày ở bảng 3:

Bảng 3 Các chỉ thị phân tử DNA sử dụng để phát hiện gen Ty-1, Ty-2, Ty-3

kháng virus xoăn vàng lá

liên kết

Sản phẩm PCR (bp)

Tài liệu tham khảo

(Ji và cs, 2007)

Chú thích: “S”: alen mẫn cảm; “R”: alen kháng

- Thành phần phản ứng: thể tích 1 phản ứng 20µl gồm: 2 µl Taq Buffer 10X;1.5µl MgCl2 25mM; 1 µl mỗi mồi 10µM; 0.16 µl dNTPs mix 10mM; 0.1µl(0.5U)Taqpolymerase; 15.3 µl H2O và 1 µl DNA

Riêng đối với sản phẩm PCR của JB-1 được cắt bởi enzyme giới hạn Taq I, lấy 10µl sản phẩm PCR ủ với 5 U Taq I trong đệm được cung cấp bởi nhà sản xuất ở 650C

để qua đêm

3.3.3 Phương pháp ghép lây nhiễm TYLCV

Cây cà chua mang nguồn bệnh xoăn vàng lá được thu trên đồng ruộng có triệutrứng bệnh đặc trưng và được khẳng định nhiễm virus xoăn vàng lá bằng phản ứng

PCR với cặp mồi chung (universal/degenerate primers) phát hiện Begomovirus là BegoAFor1 / BegoARev1 (Ha và cộng sự, 2008) Các mẫu cây bệnh này được duy trì

và nhân lên trên giống cà chua Savior bằng phương pháp ghép

Để đánh giá tính kháng, 10 cây cà chua 21 ngày tuổi của mỗi giống được ghépvới một đoạn chồi từ cây bệnh, 30 ngày tuổi thì được trồng vào một nhà lưới cách lycôn trùng tại Trung tâm Bảo tồn và Phát triển Nguồn gen Cây trồng Sau khi lây nhiễmkhoảng 40 ngày, tiến hành đánh giá tỷ lệ ghép thành công và mức độ nghiêm trọngtriệu trứng bệnh theo chỉ số DSI - Disease severity index (Lapidot và Friedmann,2002) với thang điểm từ 0 đến 4 (hình 3) và so sánh với 5 cây đối chứng cùng giốngkhông lây nhiễm

Hình 3 Chỉ số nghiêm trọng bệnh DSI theo thang điểm 0 – 4 của Lapidot và

Friedmann (2002)

Trong đó: [0] = không có triệu chứng bệnh (kháng cao); [1] = hơi vàng ở mépcác lá chét ở phần ngọn (kháng); [2] = hơi biến vàng và đỉnh lá chét cuốn nhẹ (khángvừa); [3] = một loạt các lá vàng, xoăn, và cong hình thìa, cây vẫn tiếp tục phát triển

(nhiễm vừa); [4] = cây còi cọc rất nặng, lá vàng, xoăn, và cong hình thìa rất rõ, câyngừng phát triển (nhiễm nặng)