Khảo sát và đánh giá nguồn gen cà chua kháng bệnh virus xoăn vàng lá

Khảo sát và đánh giá nguồn gen cà chua kháng bệnh virus xoăn vàng lá

Đ O À N H Ữ U T H A N H K H Ó A L U Ậ N T Ố T N G H I Ệ P H À N Ộ I - 2 0 1 2 TRƯNG ĐI HC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: “Khảo sát và đánh giá nguồn gen cà chua kháng bệnh virus xoăn vàng lá” Sinh viên thực hiện : Đoàn Hữu Thanh Ngành : Công nghệ sinh học Giáo viên hướng dẫn : PGS. TS. Phan Hữu Tôn “ Khóa luận đệ trình khoa CNSH, Trường ĐH Nông nghiệp Hà Nội là một phần yêu cầu của trình độ đại học ngành Công nghệ sinh học” HÀ NỘI – 2012 LI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp, ngoài sự nỗ lực cố gắng của bản thân, tôi đã nhận được sự quan tâm, giúp đỡ rất tận tình của các thầy cô, bạn bè cũng như những người thân trong gia đình. Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết sâu sắc tới PGS.TS Phan Hữu Tôn, người đã tận tình hướng dẫn, định hướng, giúp đỡ tôi về chuyên môn trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cảm ơn KS. Tống Văn Hải và KS. Khúc Ngọc Tuyên, và toàn thể cán bộ, nhân viên Bộ môn Công nghệ sinh học Ứng dụng, Khoa Công nghệ sinh học, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã rất nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong thời gian thực tập tại bộ môn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trường ĐH nông nghiệp Hà Nội đã trang bị cho tôi những kiến thức cần thiết để có thể thực hiện và hoàn thành khóa luận. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong gia đình, anh em, bạn bè đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận này. Hà Nội, ngày 5 tháng 9 năm 2012 Tác giả Đoàn Hữu Thanh ii MỤC LỤC LI CẢM ƠN ii DANH MỤC BẢNG ii Tóm tắt iv PHẦN I. MỞ ĐẦU 1 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3 PHẦN III. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 PHẦN IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 i DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Các loài virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua phát hiện ở Việt Nam 7 Bảng 2. Danh sách các mẫu giống cà chua và nguồn gốc 21 Bảng 3. Các chỉ thị phân tử DNA sử dụng để phát hiện gen Ty-1, Ty-2, Ty-3 kháng virus xoăn vàng lá 25 Bảng 4. Thời gian sinh trưởng của các mẫu giống cà chua 30 Bảng 5. Một số chỉ tiêu về hình thái, cấu trúc cây 32 Bảng 6. Các yếu tố cấu thành năng suất 35 Bảng 7. Một số đặc điểm hình thái quả 37 Bảng 8. Một số đặc điểm về chất lượng quả 40 Bảng 9. Phân tích tương quan một số chỉ tiêu về sinh trưởng của các giống cà chua 40 Bảng 10. Phân tích tương quan một số chỉ tiêu về năng suất và chất lượng quả 41 Bảng 11. Mục tiêu lựa chọn các giống triển vọng vụ đông xuân 2012 42 Bảng 12. Tóm tắt về phần lựa chọn 42 Bảng 13. Các giống cà chua triển vọng vụ đông xuân 2012 43 Bảng 14. Đánh giá tính kháng TYLCV của một số mẫu giống cà chua 43 Hình 5. Ảnh điện di sản phẩm PCR phát hiện gen Ty-2 bằng cặp mồi T0302F/TY-2R1 46 ii DANH MỤC HÌNH Hình 1. Bản đồ khoảng cách di truyền của các gen kháng virus xoăn vàng lá 16 Hình 2: Hình vẽ thể hiện 2 đường hướng phòng thủ của cây 18 Hình 3. Chỉ số nghiêm trọng bệnh DSI theo thang điểm 0 – 4 của Lapidot và Friedmann (2002) 26 Hình 4. Ảnh điện di sản phẩm PCR phát hiện gen Ty-1 với cặp mồi JB-1 45 Hình 6. Ảnh điện di sản phẩm PCR phát hiện gen kháng Ty-3 47 iii Tóm tắt Cà chua là một loại cây rau ăn quả quan trọng được trồng phổ biến ở Việt Nam và nhiều nơi trên thế giới. Hiện nay, bệnh xoăn vàng lá do TYLCV đã và đang gây thiệt hại rất lớn trên cây cà chua, có thể làm giảm năng suất cà chua lên tới 100% nếu bị nhiễm sớm. Do đó, việc chọn tạo giống cà chua năng suất cao chất lượng tốt và có khả năng kháng bệnh virus xoăn vàng lá là rất cần thiết. Đề tài đã khảo sát các đặc điểm nông sinh học, năng suất và chất lượng của một số mẫu giống cà chua, đánh giá khả năng kháng và phát hiện các gen kháng Ty-1, Ty-2 và Ty-3. Kết quả đã chọn ra được 7 giống triển vọng có năng suất cao, chất lượng tốt cho vụ đông xuân và nhiều mẫu giống có những đặc điểm giá trị như năng suất cao, quả to, sai quả, độ brix cao, thịt quả dày… Kết quả PCR phát hiện gen kháng cho thấy mẫu giống 189 có gen Ty-3b, mẫu giống 190 có gen Ty-1 và Ty-3a, không mẫu giống nào có gen Ty-2. Cả hai mẫu giống này đều thể hiện tính kháng tốt với bệnh xoăn vàng lá trên đồng ruộng, là nguồn gen quý cho công tác lai tạo giống cà chua năng suất cao, chất lượng tốt và kháng virus. iv PHẦN I. MỞ ĐẦU  Cà chua là một loại rau ăn quả có hàm lượng dinh dưỡng cao và được trồng phổ biến ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên thế giới. Bệnh xoăn vàng lá là một trong những bệnh gây thiệt hại lớn nhất, có thể làm giảm năng suất cà chua lên đến 100% nếu bị nhiễm bệnh sớm (Nguyễn Thơ, 1984). Bệnh này gây ra bởi một nhóm begomovirus thường được gọi chung là Tomato Yellow Leaf Curl Virus (TYLCV) và được lan truyền thông qua bọ phấn Bemisia tabaci. Bọ phấn là loài đa thực phát triển quanh năm trên đồng ruộng, việc phòng trừ bọ phấn truyền bệnh gặp nhiều khó khăn (Ngô Bích Hảo, 2010). Cho đến nay, sử dụng giống kháng là biện pháp hiệu quả nhất để phòng chống bệnh xoăn vàng lá. Các gen kháng TYLCV chỉ được tìm thấy trong cà chua dại, để tạo ra cây trồng kháng tự nhiên các nhà chọn giống đã lai cà chua trồng (Solanum lycopersicum) với các loài cà chua dại để đưa các gen kháng vào cà chua trồng. Hiện nay, đã có 5 gen kháng được phát hiện: gen Ty-1 có nguồn gốc từ loài cà chua dại Solanum chilense LA 1969 (Zamir và cộng sự, 1994), Ty-2 bắt nguồn từ Solanum habrochaites (Hanson và cộng sự, 2000), gen Ty-3 và Ty-4 được đưa vào cà chua trồng từ Soladium chilense LA2779, LA1932 (Ji và cộng sự, 2007; Ji và cộng sự, 2009), gen Ty-5 phát hiện từ loài Solanum peruvianum và được đưa vào một số giống cà chua trồng (Anbinder và cộng sự, 2009). Bên cạnh đó, một hệ thống các marker phân tử DNA liên kết với các gen kháng đã được phát triển và hỗ trợ đắc lực cho chương trình chọn tạo giống cà chua kháng bệnh xoăn vàng lá. Các chỉ thị phân tử DNA dựa trên PCR cho gen Ty-1 là JB- 1), gen Ty-2 là T0302 và gen Ty-3 là P6-25 đã được nhiều nhà chọn giống trên thế giới sử dụng để chọn tạo giống cà chua kháng TYLCV. Việc khảo sát các đặc điểm nông sinh học, năng suất, chất lượng quả, phát hiện và đánh giá tính kháng TYLCV là một bước quan trọng trong chọn tạo giống cà chua cho năng suất cao, chất lượng tốt và kháng bệnh xoăn vàng lá. Bộ môn Công nghệ Sinh học Ứng dụng đã thu thập được một tập đoàn các mẫu giống cà chua rất đa dạng, 1 trong đó một số giống có khả năng mang gen kháng TYLCV. Vì vậy, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Phan Hữu Tôn, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Khảo sát và đánh giá nguồn gen cà chua kháng bệnh virus xoăn vàng lá”.    - Phát hiện được các mẫu giống cà chua mang các gen Ty-1, Ty-2, Ty-3 kháng TYLCV. - Đánh giá được khả năng kháng TYLCV của các giống cà chua. - Đánh giá và tuyển chọn được một số mẫu giống cà chua triển vọng trong vụ đông xuân tại Gia Lâm – Hà Nội.   - Đánh giá được các đặc điểm nông sinh học, năng suất và chất lượng quả của các mẫu giống cà chua thu thập. - Sử dụng chỉ thị phân tử DNA phát hiện các gen Ty-1, Ty-2, Ty-3 kháng virus xoăn vàng lá trong tập đoàn giống cà chua thu thập. - Đánh giá được khả năng kháng bệnh xoăn vàng lá của các giống cà chua mang gen kháng và một số mẫu giống triển vọng bằng phương pháp ghép lây nhiễm. 2 PHẦN II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU  !"#$%&'&#$%()  **#+%%,  Cà chua (Lycopersicon esculentum Mill) thuộc họ cà Solanaceae là loại rau ăn quả có nguồn gốc từ Nam Mỹ. Nhiều nghiên cứu và phân tích thành phần hóa học đã xếp cà chua vào nhóm rau quả dinh dưỡng. Trong quả cà chua chín có nhiều đường (glucose, fructose, saccarose), vitamin (A, B1, B2, C), khoáng chất quan trọng (Ca, Fe, Mg, P…) và các loại axit hữu cơ (citric, malic, galacturolic). Cà chua có thể sử dụng dễ dàng từ ăn tươi, chế biến, làm nguyên liệu cho sản xuất. Về mặt y học cà chua được coi là dược liệu chữa bệnh sốt, lao phổi, nhuận tràng. Hợp chất tomatin chiết tách từ cây cà chua có khả năng kháng khuẩn, diệt nấm và một số sâu bệnh hại. Theo Võ Văn Chi (1997) cà chua có tính mát, vị ngọt giúp tạo năng lượng, tăng sức sống, cân bằng tế bào, giải nhiệt, điều hòa bài tiết, tăng khả năng tiêu hóa (Trương Văn Nghiệp, 2006). Với giá trị dinh dưỡng và giá trị sử dụng cao, cà chua được nhiều người ưa chuộng nên nó là loại cây trồng mang lại giá trị kinh tế cao cho người sản xuất. Theo số liệu điều tra năm 2008 của Phòng Nghiên cứu Kinh tế Thị trường (Viện Nghiên cứu Rau quả), sản xuất cà chua ở đồng bằng sông Hồng cho thu nhập bình quân 42-64.8 triệu/ha/vụ với mức lãi 15-16 triệu/ha, cao gấp nhiều lần so với trồng lúa (Trần Tuyết Lan Hương, 2009). - !"#$% &'&#$%() - Nhiệt độ: Cà chua ưa thích khí hậu ấm áp, khả năng thích nghi rộng. Cà chua chịu được nhiệt độ cao nhưng lại mẫn cảm ở nhiệt độ thấp. Cà chua có thể sinh trưởng phát triển trong phạm vi nhiệt độ 15-35 0 C và sẽ không phát triển ở nhiệt độ quá ngưỡng hoặc dưới ngưỡng. Nhiệt độ tối thích cho cà chua vào ban ngày là 18-27 0 C, đêm từ 12-15 0 C. Nhiệt độ ban ngày hạ thấp xuống 10-12 0 C sẽ làm cây ngừng sinh trưởng, rụng nụ và hoa. Theo Tiwari và Choudhury (1993) thì nhiệt độ tối ưu cho hạt 3 cà chua nảy mầm là 24-25 0 C, nhiều giống nảy mầm nhanh ở nhiệt độ 28-32 0 C. Nhiệt độ quá cao làm hạt mọc chậm, dễ mất sức sống, mầm bị dị dạng. Nhiệt độ còn ảnh hưởng lớn đến ra hoa và đậu quả ở cà chua. Trong thời kỳ phân hóa mầm hoa, nhiệt độ không khí và nhiệt độ đất ảnh hưởng đến số lượng hoa/chùm. Theo Trần Trực (2009) thì số hoa/chùm đạt cao hơn ở 14 0 C. Nhiệt độ không khí trên 30 0 C ngày và 25 0 C đêm làm tăng số đốt dưới chùm hoa đầu, nếu nhiệt độ ngày tăng hơn và nhiệt độ đất trên 21 0 C làm giảm số hoa/chùm (Kuo và cộng sự, 1998). Theo Trần Khắc Thi và cộng sự (1999) nhiệt độ 27 0 C kéo dài cũng hạn chế sinh trưởng, ra hoa và đậu quả cà chua. Các tế bào phôi và hạt phấn sẽ bị hủy hoại khi nhiệt độ ban ngày trên 38 0 C, nếu nhiệt độ ban đêm trên 21 0 C khả năng đậu quả sẽ giảm. Nhiệt độ trên 30 0 C ngày và 24 0 C đêm có xu hướng làm giảm kích cỡ hoa, trọng lượng noãn, bao phấn và số ngăn hạt. Nhiệt độ cao còn làm giảm số lượng hạt phấn, sức sống hạt phấn cũng như noãn (Kuo và cộng sự, 1998). - Ánh sáng: Cà chua là cây ưa ánh sáng nhưng không nhạy cảm với độ dài chiếu sáng (Trần Khắc Thi, 1995). Tuy nhiên chất lượng ánh sáng ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển của cây cà chua. Ánh sáng đỏ làm tăng tốc độ phát triển của lá, ngăn chặn sự phát triển của chồi bên, thúc đẩy quá trình tạo Lycopen và Caroten. Cường độ ánh sáng cũng ảnh hưởng nhiều tới sinh trưởng phát triển cây cà chua. Cường độ ánh sáng tối thiểu cho cà chua sinh trưởng phát triển là 4000lux (Tạ Thu Cúc, 1985). Cường độ ánh sáng cao làm tăng diện tích lá và tốc độ sinh trưởng của cây. Theo Mai Phương Anh (1996) thì cường độ ánh sáng cần cho cà chua ra hoa, đậu quả không được thấp hơn 10000lux và khoảng thích hợp là 14000-20000lux. Ánh sáng có cường độ thấp sẽ tạo nên những hạt phấn không có sức sống và vòi nhụy vươn dài, gây khó khăn cho sự thụ phấn, giảm khả năng thụ tinh dẫn đến năng suất giảm và quả bị dị hình (Kallo, 1993). Các quá trình sinh lý cơ bản của cây đều chịu ảnh hưởng của chế độ nước trong cây. Cà chua là cây ưa ẩm, chịu hạn nhưng không chịu úng. Do có khối lượng thân lá lớn, hoa, quả nhiều, năng suất cao nên cây có nhu cầu nước khá lớn. Để tạo được 1 tấn 4 [...]... Bệnh xoăn vàng lá ở cây cà chua 2.2.1 Nguyên nhân, cơ chế gây bệnh và triệu chứng bệnh Tác nhân gây bệnh xoăn vàng lá cà chua được xem là một phức hợp nhiều begomovirus khác nhau Mặc dù nhóm geminivirus này bao gồm các loài riêng biệt, nhưng chúng vẫn được gọi chung là virus xoăn vàng lá cà chua - Tomato yellow leaf curl virus (Vidavski, 2007) Begomovirus là chi lớn nhất trong họ Geminivirus, vì thế... ly, do đó là gen kháng chính Đây là gen kháng chính phổ rộng với TYLCV và ToMoV và nhiều begomovirus bộ gen kép khác (Hutton và cộng sự, 2011) Gen Ty-1 nằm trên NST số 3 Gen Ty-2 nằm trên NST số 11 15 Gen Ty-3 nằm trên NST số 6 Gen Ty-4 nằm trên trên NST số 3 Gen Ty-5 nằm trên NST số 4 Hình 1 Bản đồ khoảng cách di truyền của các gen kháng virus xoăn vàng lá 16 2.3.3 Cơ chế kháng của cây cà chua đối với... DSI theo thang điểm 0 – 4 của Lapidot và Friedmann (2002) Trong đó: [0] = không có triệu chứng bệnh (kháng cao); [1] = hơi vàng ở mép các lá chét ở phần ngọn (kháng) ; [2] = hơi biến vàng và đỉnh lá chét cuốn nhẹ (kháng vừa); [3] = một loạt các lá vàng, xoăn, và cong hình thìa, cây vẫn tiếp tục phát triển 26 (nhiễm vừa); [4] = cây còi cọc rất nặng, lá vàng, xoăn, và cong hình thìa rất rõ, cây ngừng phát... bào cao hơn trong phản ứng với stress đã làm cho cà chua R kháng được bệnh virus xoăn vàng lá 2.3 Lây nhiễm nhân tạo để đánh giá tính kháng Để đánh giá tính kháng của các giống cà chua thì việc thử nghiệm bệnh là rất cần thiết Vì thế, cần phải có một phương pháp lây nhiễm nhân tạo TYLCV sang cây cà chua để kiểm tra TYLCV không lan truyền thông qua cọ sát nên không thể lây nhiễm bằng tiếp xúc cơ học... gen Ol-1 kháng bệnh mốc sương (Huang và cộng sự, 2000), gen Cf-4 kháng nấm Cladosporium fulvum (Thomas và cộng sự, 1997), và gen Mi-1 kháng tuyến trùng 13 (Sean và cộng sự, 2007) Trong đó vùng chứa gen Mi-1 và Ty-1 thường rất ngắn nên rất có khả năng hạn chế tái tổ hợp xảy ra giữa 2 gen này khi chuyển gen kháng vào cà chua trồng Vì vậy, các marker liên kết với gen Mi-1 có thể sử dụng cho gen Ty-1:... khoảng 6 loài begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá, trong đó được phát hiện trên cây cà chua ở Hà Nội (Bảng 1) Việc phát triển các cặp mồi đặc hiệu để phát hiện loài nào gây bệnh là rất cần thiết Ha và cộng sự, (2008) đã phát triển 2 cặp mồi đặc hiệu phát hiện 2 loài TYLCVNV và ToLCVV Bảng 1 Các loài virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua phát hiện ở Việt Nam STT 1 Tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV) Tomato... một gen bất kỳ, nếu biết được một hoặc nhiều chỉ thị liên kết chặt với gen đó Zamir và cộng sự (1994) đã lập bản đồ gen Ty-1 nằm trên nhiễm sắc thể số 6 và là gen kháng trội bắt nguồn từ loài cà chua dại Soladium chilense LA 1969 Gen này định vị giữa 2 marker TG297 (6.0 cM) và TG97 (8.6 cM) nằm trong “vùng nóng” chứa nhiều gen kháng như gen Am kháng Alfalfa mosaic virus (Parrella và cộng sự, 2004), gen. .. PI390681 và LA441 để chọn tạo các dòng cà chua có tính kháng cao TY172, TY-198, TY-536 và TY-197 (Friedmann và cộng sự, 1998; Lapidot và cộng sự, 1997) Tính kháng trong TY-172 là trội một phần và có ít nhất 3 gen giải thích cho tính 10 kháng này (Friedmann và cộng sự, 1998) Sự đánh giá so sánh tính kháng giữa các mẫu giống 8484, 3761, Fiona, Tyking, TY-172 và TY-197 chỉ ra rằng cây cà chua TY172 và TY-197... bệnh đặc trưng và được khẳng định nhiễm virus xoăn vàng lá bằng phản ứng PCR với cặp mồi chung (universal/degenerate primers) phát hiện Begomovirus là BegoAFor1 / BegoARev1 (Ha và cộng sự, 2008) Các mẫu cây bệnh này được duy trì và nhân lên trên giống cà chua Savior bằng phương pháp ghép Để đánh giá tính kháng, 10 cây cà chua 21 ngày tuổi của mỗi giống được ghép với một đoạn chồi từ cây bệnh, 30 ngày... thế đây là locus kháng chính (Ji và cộng sự, 2007a) Gen Ty-3 khác với gen Ty-1 và Ty-2 ở hai mặt Đầu tiên, Ty-3 có thể có hiệu quả kháng với cả TYLCV và begomovirus bộ gen kép ToMoV trong khi Ty-1 và Ty-2 chỉ kháng được begomovirus bộ gen đơn TYLCV Ngoài ra, Gen Ty-1 và Ty-2 biểu hiện gần như trội hoàn toàn trong khi Ty-3 có biểu hiện cộng vào (additive) nhiều hơn Gen Ty-3 là gen kháng chính được giải