THỰC HÀNH kỹ THUẬT COLONY PCR

ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP.HCM BỘ MÔN XÉT NGHIỆM PHÂN MÔN: Y SINH HỌC PHÂN TỬ BÁO CÁO THỰC HÀNH SINH HỌC PHÂN TỬ CƠ BẢN BUỔI 1: 10/10/2022 THỰC HÀNH KỸ THUẬT COLONY PCR Mụục đíícch I AI Để xác định xem plasmid vi khuẩn có chèn đoạn DNA mong muốn chuyển nạp hay không Ưu điểm: nhanh dễ thực Chhuuẩẩn bịị Dụng cụ, thiết bị: - Găng tay không bột, tăm vô trùng - Micropipette, đầu côn, máy ly tâm eppendorf, Eppendorf 1,5 ml - Bếp đun, Máy Nanodrop - Hố chất: Petri có khúm khuẩn chuyển nạp III-Dung.Quydịch trìKTS5nhth(TE)ựchiện Colony – PCR Bước 1: Dùng pipette hút 25μl dung dịch KTS5 (TE) cho vào ống eppendorf ghi tên Bước 2: Lấy khúm khuẩn cần định danh tăm vô trùng Bước 3: Cho khúm khuẩn vừa lấy vào eppendorf có chứa 25 μl dung dịch TE, trộn hỗn hợp Bước 4: Đun hỗn hợp dung dịch 90 – 100oC phút Bước 5: Quay ly tâm tốc độ cao 13000 vòng/phút phút Bước 6: Hút 10 μl dung dịch vào eppendorf Bước 7: Hút μl để đo độ tinh máy nanodrop, phần lại thực phản ứng PCR IV Quy trìnình kiểiểm tra độ tinh sạcạch máy Nanodrop Bước 1: Mở máy tính kết nối với máy chọn phần đo acid nucleic Bước 2: Hút μL nước cất nhỏ vào đầu đọc đóng nắp máy nanodrop sau dùng giấy mềm lau Bước 3: Đo blank: hút μL KTS5 (dung dịch vừa pha với khúm khuẩn) cho vào giếng đậy nắp xuống Chọn blank Bước 4: Nhập ID sample Bước 5: Nhỏ μl dung dịch mẫu lên đầu đọc, đậy nắp Bước 6: Bấm Measure để đo Bước 7: Đọc kết V Nhhậận xéét kếết quuảả: - Do máy điện thoạoại em bị hư nên ảnh đồ thị đo máy Nanodrop bị mất, bảng kết em ghi lại dựa hình ảnh chụp từ máy bạn Nồồnng độ DNNA 102.3 ng/ ll - Tỉ lệ 260/280: 1.87, tỷ lệ thể độ tinh khiết mẫu tách chiết, dsDNA tỷ lệ 1.6-1.8 tinh sạch, nên kết 1.87 tin cậy - Tỉ lệ 260/230= 0.11, tỉ lệ 260/230 nên 1.8, mà kết thấp xác định nhiễm hợp chất hữu (phenol, alocohol, cacbohydrates) BUỔI 2: 11/10/2022 TÁCH CHIẾT DNA – HBV BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHENOL CHLOROFORM AccuPid HBV Quantification Kit/Real-time PCR/Q01HBV02.2A I Mụục đíícch Xử lý mẫu huyếyết thananh để thu DNA HBV Chhuuẩẩn bịị Dụng cụ, thiết bị - Vật dụng tiêu hao (găng tay không phấn, ống eppendorf 1,5 ml, đầu tip dùng cho micropipettes có phin lọc) - Micropipettes (10 μl, 200 μl, 1000 μl) - AI - Máy ly tâm cho ống eppendorf (vận tốc tối đa 13.000 - 14.000 vòng/phút) Máy ly tâm ống máu - Máy lắc trộn (vortex) - Bồn ủ nhiệt khô - o - Tủ lạnh C –20 C - o Máy Nanodrop Hóa chất thuốc thử mẫu: - Sử dụng với mẫu huyết không chứa chất chống đông EDTA hay heparin - Bộ hóa chất tách chiết DNA AccuRive pDNA PrepKit – EX-DNA01.1A - Nước cất - Dung dịch sát trùng IIII Thhàànnh phhầần hóóa chhấấtt: Têên hóóa chhấất Dung dịch KTS1 Thhàànnh phhầần Phenol pH 8.0 Guanidine isothyocinate β mercaptopethanol Táác dụụnng Phá vỡ cấu trúc protein màng tế bào người vỏ capsid HBV Hoạt động biến tính protein chất làm bất hoạt enzyme phân hủy DNA có hỗn hợp DNA sau giải phóng di chuyển vào pha nước Dung dịch KTS2 Chloroform Dung dịch KTS3 Iso-propanol, G Dung dịch KTS4 70% Ethanol Dung dịch KTS5 Lưu ý: DEPC Những hóa chất độc hại nên để hóa chất gần nơi thực tách chiết, sau lấy hóa chất phải đóng nắp lại + + Cần trộn dung dịch trước sử dụng IV Quuy trrììnnh thhựực hiiệện Bước 1: Chuẩn bị số lượng eppendorf 1,5 ml có đánh số tương ứng với số lượng mẫu Bật bồn ủ nhiệt khô 60°C Bước 2: Vortex kỹ ống DNA-IC Cho vào eppendorf µl dung dịch DNA-IC Bước 3: Cho tiếp vào eppendorf 900 µl KTS1 Bước 4: Cho 100 µl huyết vào ống Vortex mạnh eppendorf giây cho tan hồn tồn protein biến tính Để yên 10 phút Bước 5: Cho 200 µl KTS2 Lắc trộn thật kỹ Bước 6: Ly tâm 13.000 vòng/phút 10 phút nhiệt độ phòng Bước 7: Chuẩn bị số lượng eppendorf 1,5 ml có đánh số tương ứng với số lượng mẫu Bước 8: Chuyển 600 µl dịch sang eppendorf 1,5 ml Lưu ý: Chỉ thu dịch nổi, tránh chạm vào lớp dung dịch đục (protein biến tính) hai pha nước (trên) chloroform (dưới) Bước 9: Thêm 600 µl KTS3 Bước 10: Vortex nhẹ để trộn Để yên 10 phút Bước 11: Ly tâm 13.000 vòng/phút 10 phút nhiệt độ phòng Bước 12: Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, giữ lại cặn Lưu ý: Tránh chạm đến phần cặn có màu xanh Bước 13: Thêm 900 µl KTS4 Bước 14: Ly tâm 13.000 vòng/phút phút nhiệt độ phòng Bước 15: Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, giữ lại cặn Lưu ý: Tránh chạm đến phần cặn có màu xanh Bước 16: Làm khô cặn 10 phút 60°C bồn ủ nhiệt khơ Bước 17: Hịa cặn 20 µl KTS5 Nếu khơng tiến hành phản ứng PCR ngày, bảo quản DNA tách chiết 2-8°C vòng 2-3 ngày, -20°C vịng tháng Quy trình kiểm tra độ tinh máy Nanodrop (với bước tương thực hành buổi 1) - VI Nhhậận xéét kếết q uảả: - Nồng độ: 115.2 ng/µ/µl - A226600: 2,,33003 - A228800: 0885 - Tỉ lệ 260/280: 2.12, tỷ lệ thể độ tinh khiết mẫu tách chiết, dsDNA tỷ lệ 1.6-1.8 tinh Nhưng trường hợp đồ thị không đạt đỉnh 260 nm, nên dù tỉ lệ 1.8 mẫu có khả cao có hiệncủa chất hữu - Tỉ lệ 260/230= 0.11, tỉ lệ 260/230 nên 1.8, mà kết thấp xác định nhiễm hợp chất hữu (phenol, alocohol, cacbohydrates) Độ tinh vật liệu di truyền thấp, việc đọc kết PCR điện di không đáng tin cậy Cần phải tách chiết lại BUỔI 3: 12/10/2022 CHẠY PCR MẪU DNA HBV Ở BUỔI I - Mụục đíícch Khuếch đại đoạn DNA tách chiết buổi để tạo nhiều Dùng để phát xem có DNA HBV tách chiết - Kiểm tra kỹ thuật làm có hay khơng - AI Chhuuẩẩn bịị Dụng cụ, thiết bị: Vật dụng tiêu hao (găng tay không phấn, ống eppendorf 0,2 ml/0,1 ml, đầu tip dùng cho micropipettes có phin lọc) - Máy Real-time PCR (đọc màu FAM, HEX) + hệ thống máy vi tính Máy ly tâm cho ống eppendorf (vận tốc tối đa 13.000 - 14.000 vòng/phút) Micropipettes - Máy lắc trộn (vortex) - Hóa chất thuốc thử mẫu: Mẫu DNA tách chiết từ buổi - Hóa chất PCR AccuPid HBV Quantification Kit– Q01HBV02.2A CI Thhàànnh phhầần hóóa chhấất - Thhuuốốc thhử DNA IC MasterMix Q01HBV02.2A-MM PrimobeMix Q01HBV02.2A-PM Chứng dương E3 (Positive control E3) Q01HBV02-PC3 Chứng dương E5 (Positive control E5) Q01HBV02- PC5 Chứng dương E7 (Positive control E7) Q01HBV02- PC7 Eppendorf 0,2 ml/0,1 ml (tùy loại máy realtime sử dụng) IV- Quy trình thực Quy trình chuẩn bị chạy PCR Bước 1: Rã đông ống MasterMix, PrimobeMix Chứng dương hoàn toàn cách đặt nhiệt độ phịng tối đa 30 phút Sau ly tâm nhẹ (3.000-4.000 rpm) đặt vào rack lạnh Lưu ý: Thao tác Chứng dương tách biệt với ống MasterMix PrimobeMix để hạn chế nguy nhiễm Bước 2: Vortex mạnh ống PrimobeMix hút 200 µl chuyển vào ống MasterMix Lưu ý: : Tránh làm văng dung dịch lên nắp ống PrimobeMix trình vortex, dẫn đến việc khơng đủ thể tích hút Bước 3: Trộn hỗn hợp có ống MasterMix micropipette Hút 20 µl hỗn hợp cho vào eppendorf 0,2 ml ghi sẵn tên mẫu Lưu ý: Không trộn ống MasterMix máy vortex Sử dụng eppendorf 0,2 ml phù hợp với máy Real-time PCR Bước 4: Vortex nhẹ dung dịch DNA xét nghiệm, dung dịch Chứng âm tách chiết, dung dịch Chứng dương Bước 5: Cho µl dung dịch DNA xét nghiệm, dung dịch Chứng âm tách chiết, dung dịch Chứng dương nước cất lần vào ống eppendorf 0,2 ml riêng lẻ chuẩn bị Bước Phản ứng Real-time PCR phải đặt vào máy chạy vòng sau bổ sung dịch DNA Đun nóng hỗn hợp lị vi sóng phút cơng suất lớn khuấy Mất khoảng15 phút để nhiệt độ gel nguội đến 50oC Thỉnh thoảng xoáy agarose nguội Làm khay đựng gel cách dán kín hai đầu khay nhựa Kiểm tra để xem có bị rị rỉ khơng sử dụng nước Đổ bớt nước lau khô khay khăn lau Kimpes Đặt lược vào khe đầu khay 10 12 Thêm μl ethidium bromide (Ecodye) vào gel agarose lắc Đổ gel vào khay để gel ngấm 30 phút Lấy lược khỏi gel Tháo dấu đầu 13 14 Đặt khay vào buồng điện di cho hai đầu gel mở ngăn hai bên buồng Trong ống ly tâm siêu nhỏ, trộn 10 μl PCR với μl chất nhuộm màu 16 Pipet μl mẫu DNA vào giếng gel bạn 17 Ghi lại thứ tự mẫu bạn vào sổ tay 18 Gắn hai điện cực vào hai cực buồng Đảm bảo điện cực màu đen phù hợp với cực (âm) gần giếng gel 15 19 Kết nối dây dẫn dương âm vào lỗ thích hợp nguồn điện 20 Bật nguồn điện chạy gel 100 Volts thuốc nhuộm di chuyển đến 2/3 gel cực dương (khoảng 20 phút) 21 Tắt nguồn điện 22 Xem dải DNA UV hình ảnh chúng 23 Vứt bỏ gel V KẾẾT QUUẢ BUỔI 5: 24/10/2022 TÁCH CHIẾT DNA H.PYLORI BẰNG PHƯƠNG PHÁP CỘT AccuPid H.pylori Detection Kit/Real-time PCR/Q01HPY01.2A Mụục đíícch I Tách chiết DNA Helicobacter pylori gây viêm loét ung thư dày, tá tràng từ mẫu sinh thiết dày AI Chhuuẩẩn bịị Dụng cụ, thiết bị: - Vật dụng tiêu hao (găng tay không phấn, ống eppendorf 1,5 ml, đầu tip dùng cho micropipettes có phin lọc) - Micropipettes (10 μl, 200 μl, 1000 μl) - - Máy ly tâm cho ống eppendorf (vận tốc tối đa 13.000 - 14.000 vòng/phút) Máy ly tâm ống máu - Máy lắc trộn (vortex) - Bồn ủ nhiệt khô o o - Tủ lạnh C –20 C - Máy Nanodrop Hóa chất thuốc thử mẫu: - Mẫu (khơng thực hành): - Thu mẫu: Bấm mẫu sinh thiết dày thiết bị nội soi phẫu thuật chuyển vào eppendorf 1,5ml chứa sẵn 400 μl KTL2 + Vận chuyển: Mẫu cần vận chuyển điều kiện 2-4 oC lạnh phịng thí nghiệm để tiến hành xử lý phân tích +Bảo quản: Mẫuo giữ nhiệt độ 2-4oC ngày hay đông lạnh -20 C tuần + Xử lý mẫu (không thực hành): + Chuẩn bị loạt eppendorf 1,5 ml có đánh số tương ứng với số lượng mẫu thêm mẫu Chứng âm tách chiết Cho vào eppendorf 200 μl KTL2 + 50 μl KTL3 + 10 μl KTL4 Cho mẫu sinh thiết vào eppendorf tương ứng Cắt nhuyễn kéo vô trùng Lưu ý: mẫu chứng âm không cho thêm gì, cần lắc đảo nhẹ nhàng eppendorf Ủ 550C qua đêm 700C Mỗi lắc đảo nhẹ nhàng khoảng giây Dịch sau đồng hóa phải suốt - Hóa chất: + Hóa chất xử lý mẫu AccuRive HP ProcSample Kit - EX-PRO02.1A Hóa chất tách chiết DNA AccuRive sDNA Prep Kit, EX-DNA02.1F IIII Thhàànnh phhầần hóóa chhấấtt: + Hóa chất xử lý mẫu AccuRive HP ProcSample Kit - EX-PRO02.1A Dung dịch KTL2 x 36 ml Nhiệt độ phịng + Dung dịch KTL3 Dung dịch KTL4 + Hóa chất tách chiết DNA AccuRive sDNA Prep Kit, EX-DNA02.1F KTC1 KTC2 KTC3 KTC4 lọ x 30 ml KTS5 KTL2 lọ x ml lọ x ml KTL4 ống x 500 µl Cột silica 50 cột Eppendorf 2,0 ml 100 Eppendorf 1,5 ml 100 IV Nhiệt độ phòng Nhiệt độ phòng Nhiệt độ phòng 2-8oC Nhiệt độ phòng Nhiệt độ phòng Nhiệt độ phòng Quuy trrììnnh thhựực hiiệện Tách chiết DNA Chuẩn bị loạt eppendorf 1,5 ml có đánh số tương ứng với số lượng mẫu thêm eppendorf cho Chứng âm tách chiết Cho tiếp µl DNA IC (DNA IC cung cấp theo kit) Cho 200 µl dung dịch KTC1 vào loạt eppendorf Cho tiếp 200 µl dịch sinh thiết xử lý vào eppendorf tương ứng Trộn ủ 700C 20 phút Thêm vào 100 µl dung dịch KTC2 trộn Đưa hỗn hợp bước vào cột Ly tâm 8000 vòng / phút phút Chuẩn bị loạt eppendorf 2,0 ml có đánh số tương ứng với số lượng mẫu Dùng kéo vô trùng cắt bỏ nắp eppendorf (nếu eppendorf có nắp) Chuyển cột sang eppendorf 2,0 ml Cho vào cột 600µl dung dịch KTC3 Ly tâm 8.000 vòng / phút phút 10 Chuyển cột sang eppendorf 2,0 ml Cho vào cột 600µl dung dịch KTC4 Ly tâm 8.000 vòng / phút phút Đổ bỏ dịch lọc 11 Ly tâm 13.000 vòng / phút phút để loại bỏ hết tất dấu vết dung dịch KTC4 Chuẩn bị loạt eppendorf 1,5 ml tương tự bước Chuyển cột sang eppendorf 1,5 ml Cho vào 20 µl KTL2 Ủ nhiệt độ 70 0C 20 phút 12 13 Ly tâm 13.000 vòng / phút phút để thu DNA Lưu mẫu sau tách chiết -20oC (tối đa tháng) không thực phản ứng PCR V NHHẬẬN XÉÉT KẾẾT QUUẢ - Một nhóm bạn, thực hành theo nhóm, bạn làm mẫu - bạn Thu Hà, Minh Anh, Vân Anh làm chung mẫu 287 Nồng độ DNA: 342.4 ng/ l 260/280=1.55, kết thấp 1.6-1.8, độ tinh không cao 260/230=1.06, kết thấp 1.8 => ngoại nhiễm hợp chất hữu Kết tách chiết DNA không tin cậy, nên thực tách chiết lại BUỔI 7: 26/10/2022 PHÂN TÍCH KẾT QUẢ PCR H.PYLORI - Thực đọc kết phần mềm Quantstudio: + Cả kênh màu lên tín hiệu => hợp lệ Tín hiệu huỳnh quang chứng âm tách chiết có Ct = 30 1.65, kết nhóm đo 30.185 => Đạt + Tín hiệu huỳnh quang chứng nội mẫu xét nghiệm có Ct = 30 1.65, kết nhóm 31.482 => đạt + + Mẫu xét nghiệm có giá trị Ct xác định => Dương tính với DNA H.pylori BUỔI 8: 27/10/2022 GIẢI TRÌNH TỰ GENE HBV ĐỊNH DANH hbv-1 - 1st_BASE_1681077_313_M13_FP hbv-1 - 1st_BASE_1681078_313_M13R_pUC 26 hbv-1 - 1st_BASE_1681079_320_M13_FP.ab1 hbv-1 - 1st_BASE_1681080_320_M13R_pUC 26 hbv-2 - 1st_BASE_1681081_335_M13_FP.ab1 hbv-2 - 1st_BASE_1681082_335_M13R_pUC 26 hbv-2 - 1st_BASE_1681083_336_M13_FP.ab1 hbv-2 - 1st_BASE_1681084_336_M13R_pUC 26.ab1 hbv-3 - 1st_BASE_1681085_342_M13_FP hbv-3 - 1st_BASE_1681086_342_M13R_pUC 26 hbv-3 - 1st_BASE_1681087_345_M13_FP hbv-3 - 1st_BASE_1681088_345_M13R_pUC 26 hbv-4 - 1st_BASE_1681089_347_M13_FP hbv-4 - 1st_BASE_1681090_347_M13R_pUC 26 hbv-4 - 1st_BASE_1681091_348_M13_FP hbv-4 - 1st_BASE_1681092_348_M13R_pUC 26.ab1 hbv-5 - 1st_BASE_1681093_395_M13_FP hbv-5 - 1st_BASE_1681094_395_M13R_pUC 26 hbv-5 - 1st_BASE_1681095_764_M13_FP hbv-5 - 1st_BASE_1681096_764_M13R_pUC 26 hbv-6 - 1st_BASE_1681097_768_M13_FP hbv-6 - 1st_BASE_1681098_768_M13R_pUC 26 hbv-6 - 1st_BASE_1681099_770_M13_FP hbv-6 - 1st_BASE_1681100_770_M13R_pUC 26 hbv-7 - 1st_BASE_1681101_771_M13_FP hbv-7 - 1st_BASE_1681102_771_M13R_pUC 26.ab1 hbv-7 - 1st_BASE_1681103_772_M13_FP hbv-7 - 1st_BASE_1681104_772_M13R_pUC 26.ab1 hbv-8 - 1st_BASE_1681105_775_M13_FP.ab1 hbv-8 - 1st_BASE_1681106_775_M13R_pUC 26 hbv-8 - 1st_BASE_1681107_776_M13_FP.ab1 hbv-8 - 1st_BASE_1681108_776_M13R_pUC 26 hbv-9 - 1st_BASE_1681109_781_M13_FP hbv-9 - 1st_BASE_1681110_781_M13R_pUC 26 hbv-9 - 1st_BASE_1681111_782_M13_FP hbv-9 - 1st_BASE_1681112_782_M13R_pUC 26 hbv-10 - 1st_BASE_1681114_783_M13R_pUC 26 hbv-11 - 1st_BASE_1681115_786_M13_FP hbv-11 - 1st_BASE_1681116_786_M13R_pUC 26 hbv-11 - 1st_BASE_1681117_787_M13_FP.ab1 hbv-11 - 1st_BASE_1681118_787_M13R_pUC 26 genotype mồi xuôi ngược khác nhau, lộn vị trí B B B B hbv-12 - 1st_BASE_1681119_790_M13_FP hbv-12 - 1st_BASE_1681120_790_M13R_pUC 26 hbv-12 - 1st_BASE_1681121_791_M13_FP.ab1 hbv-12 - 1st_BASE_1681122_791_M13R_pUC 26 hbv-13 - 1st_BASE_1681123_792_M13_FP.ab1 hbv-13 - 1st_BASE_1681124_792_M13R_pUC 26 hbv-13 - 1st_BASE_1681125_796_M13_FP hbv-13 - 1st_BASE_1681126_796_M13R_pUC 26 hbv-14 - 1st_BASE_1681127_797_M13_FP.ab1 hbv-14 - 1st_BASE_1681128_797_M13R_pUC 26.ab1 hbv-14 - 1st_BASE_1681129_799_M13_FP hbv-14 - 1st_BASE_1681130_799_M13R_pUC 26 hbv-15 - 1st_BASE_1681131_801_M13_FP hbv-15 - 1st_BASE_1681132_801_M13R_pUC 26.ab1 B hbv-15 - 1st_BASE_1681133_3879_M13_FP hbv-15 - 1st_BASE_1681134_3879_M13R_pUC 26 hbv-16 - 1st_BASE_1681135_4675_M13_FP hbv-16 - 1st_BASE_1681136_4675_M13R_pUC 26 hbv-16 - 1st_BASE_1681137_5835_M13_FP hbv-16 - 1st_BASE_1681138_5835_M13R_pUC 26 hbv-17 - 1st_BASE_1682335_783_M13_FP.ab1 - Tỷ lệ genotype B= 24/31= 77.4% Tỷ lệ genotype C= 7/31 = 22.6% Xác định kiểu gene HBV trang web: https://www.geno2pheno.org/ BUỔI 9: 31/10/2022 THỰC HÀNH TÁCH CHIẾT RNA HCV BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHENOL CHLOROFORM AccuPid HCV Quantification Kit/Real-time RT-PCR/Q01HCV02.1A Mụục đíícch I - Xử lý mẫu huyết để thu RNA HCV II Chhuuẩẩn bịị Dụng cụ, thiết bị: - Vật dụng tiêu hao (găng tay không phấn, ống eppendorf 1,5 ml, đầu tip dùng cho micropipettes có phin lọc) - Micropipettes (10 μl, 200 μl, 1000 μl) - Máy ly tâm cho ống eppendorf (vận tốc tối đa 13.000 - 14.000 vòng/phút) Máy ly tâm ống máu - Máy lắc trộn (vortex) - Bồn ủ nhiệt khô o o - Tủ lạnh C –20 C - Máy đo Nanodrop Hóa chất thuốc thử mẫu: - Sử dụng với mẫu huyết không chứa chất chống đông EDTA hay heparin - - Bộ hóa chất tách chiết tủa RNA AccuRive pRNA Prep Kit, EX-RNA01.1A Nước cất - Dung dịch sát trùng - CI Thhàànnh phhầần hóóa chhấất Hóóa chhấất Thhàànnh phhầần Phenol pH 4.0, Dung dịch KTS1-R Guanidine isothiocyanate, β-mercaptoethanol Dung dịch KTS2 Chloroform Dung dịch KTS3 Iso-propanol Dung dịch KTS4 70% Ethanol Táác dụụnng Phá vỡ cấu trúc protein màng tế bào người vỏ capsid HCV Ngồi ra, hoạt động biến tính protein chất làm bất hoạt enzyme phân hủy RNA có hỗn hợp Thu hút hồn tồn phenol khỏi pha nước giúp phân tách pha nước pha hữu (phenolchloroform) trở nên rõ ràng Chuyển RNA pha nước sang trạngLoại bỏtháicáckhônggốc isopropanoltan khỏi Dung dịch KTS5 IV DEPC tủa RNA đảm bảo việc làm RNA giữ RNA trạng thái khơng tan Hịa tan tủa RNA, bất hoạt RNAse, DNase Quuy trrììnnh thhựực hiiệệnn: Tách chiết RNA - Lưu ý:Huyết phải bảo quản theo quy định từ thu đến thực phản ứng Lưu ý: Nên làm thêm mẫu chứng âm tách chiết cách dùng 100 l nước cất dung dịch KTS5 (trong phần thực hành không làm Chứng âm) Chuẩn bị số lượng eppendorf 1,5 ml có đánh số tương ứng với số lượng mẫu thêm eppendorf cho Chứng âm tách chiết Bật bồn ủ nhiệt khô 600C Cho vào eppendorf 900 l KTS1R Cho 100 l huyết vào ống, 100 l nước cất lần dung dịch KTS5 Chứng âm tách chiết Vortex mạnh eppendorf giây cho tan hồn tồn protein biến tính Để n 10 phút Cho 200 l KTS2 Lắc trộn thật kỹ Ly tâm 13.000 vòng/phút 10 phút nhiệt độ phòng Chuẩn bị số lượng eppendorf 1,5 ml có đánh số tương ứng với số lượng mẫu Chuyển 600 l dịch sang eppendorf 1,5 ml Lưu ý: Chỉ thu dịch nổi, tránh chạm vào lớp dung dịch đục (protein biến tính) hai pha nước (trên) chloroform (dưới) Thêm 600 l KTS3 Lưu ý: Dung dịch KTS3 cần trộn trước sử dụng Vortex nhẹ để trộn Để yên 10 phút 10 11 Ly tâm 13.000 vòng/phút 10 phút nhiệt độ phòng Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, giữ lại cặn Lưu ý: Tránh chạm đến phần cặn có màu xanh Nhẹ nhàng thêm vào 900 l KTS4 13 Ly tâm 13.000 vòng/phút phút nhiệt độ phòng 14 Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, giữ lại cặn 15 Làm khô cặn 10 phút 60 C bồn ủ nhiệt khơ 16 Hịa cặn 50 l KTS5 (thực tế cho 20 l KTS5 cô đặc RNA) Thực phản ứng phiên mã ngược RT 12 V Nhhậận xéét kếết quuả - Nồồnng độ RNNA = -2.7 ngg/ l - - Các giá trị đo âm, thực tế trình hút nhỏ mẫu bị lỗi: bấm pippette khơng đủ thể tích => không đủ lượng mẫu để đo nên dẫn đến sai sót Nhưng lượng thể tích mẫu cịn lại để chạy PCR điện di nên tiến hành đo lần BUỔI 10: 2/11/2022 THỰC HÀNH KỸ THUẬT RT RNA HCV THU ĐƯỢC Ở BUỔI AccuPid H.pylori Detection Kit/Real-time PCR/Q01HPY01.2A Mụục đíícchh: I - AI Taq DNA polymerase phản ứng PCR không sử dụng RNA làm mạch khn cho q trình nhân Vì vậy, để phản ứng PCR xảy ra, RNA HCV cần phải chuyển thành cDNA thông qua phản ứng phiên mã ngược Chhuuẩẩn bịị:: Dụng cụ, thiết bị: Vật dụng tiêu hao (găng tay không phấn, ống eppendorf 0,2 ml/0,1 ml, đầu tip dùng cho micropipettes có phin lọc) - - Máy Real-time PCR (đọc màu FAM, HEX) + hệ thống máy vi tính Máy ly tâm cho ống eppendorf (vận tốc tối đa 13.000 - 14.000 vòng/phút) - Micropipettes - Máy lắc trộn (vortex) Hóa chất thuốc thử mẫu: - Mẫu RNA tách chiết từ buổi - Hóa chất PCR AccuPid HBV Quantification Kit– Q01HBV02.2A IIII Quuy trrììnnh thhựực hiiệệnn: - A Tách chiết RNA: Chuẩn bị số lượng eppendorf 1,5 ml có đánh số tương ứng với số lượng mẫu thêm 1eppendorf cho Chứng âm tách chiết Bật bồn ủ nhiệt khô 600C Cho vào eppendorf 900 l KTS1-R Cho 100 l huyết vào ống, 100 l nước cất lần dung dịch KTS5 Chứng âm tách chiết Vortex mạnh eppendorf giây cho tan hồn tồn protein biến tính Để n 10 phút Cho 200 l KTS2 Lắc trộn thật kỹ Ly tâm 13.000 vòng/phút 10 phút nhiệt độ phòng Chuẩn bị số lượng eppendorf 1,5 ml có đánh số tương ứng với số lượng mẫu Chuyển 600 l dịch sang eppendorf 1,5 ml Lưu ý Chỉ thu dịch nổi, tránh chạm vào lớp dung dịch đục (protein biến tính) hai pha nước (trên) chloroform (dưới) : Thêm 600 l KTS3 Lưu ý Dung dịch KTS3 cần trộn trước sử dụng Vortex nhẹ để trộn Để yên 10 phút : 10 11 Ly tâm 13.000 vòng/phút 10 phút nhiệt độ phòng Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, giữ lại cặn Lưu ý Tránh chạm đến phần cặn có màu xanh 12 Nhẹ nhàng thêm vào 900 l KTS4 : Ly tâm 13.000 vòng/phút phút nhiệt độ phòng 14 Cẩn thận đổ bỏ dịch nổi, giữ lại cặn 15 Làm khô cặn 10 phút 60 C bồn ủ nhiệt khô 16 Hòa cặn 50 l KTS5 Thực phản ứng phiên mã ngược RT B Thực phản ứng RT Cho l dung dịch Buffer RT vào eppendorf 0,2 ml chứa Mix RT 13 Cho 15 l dịch RNA tách chiết vào eppendorf 0,2 ml chứa l hỗn hợp phản ứng RT Phản ứng tiến hành rack lạnh Các ống eppendorf đặt vào máy luân nhiệt Chạy chương trình “RT HCV” sau: chu kì 25oC – phút chu kì 42oC – 30 phút chu kì 85oC – phút Giữ mẫu 4oC Nếu khơng tiến hành phản ứng PCR ngya ngày, bảo quản cDNA 2-8 oC vòng 2-3 ngày, -20 oC tháng IV Nhhậận xéét kếết quuả Các bạn nhóm đem mẫu qua bên trường để chạy PCR Buổi 11: 7/11/2022 GIẢI TRÌNH TỰ GENE HCV Địịnnh daannh hcv - 1st_BASE_1870467_T11_C11_M13_FP hcv - 1st_BASE_1870468_T19_D11_M13_FP hcv - 1st_BASE_1870469_T46_E11_M13_FP hcv - 1st_BASE_1870470_T48_F11_M13_FP - 1st_BASE_1870471_T53_G11_M13_FP - 1st_BASE_1870472_T89_H11_M13_FP 21st_BASE_1870475_T11_C12_M13R_pUC 26 21st_BASE_1870476_T19_D12_M13R_pUC 31st_BASE_1870477_T46_E12_M13R_pUC 26 31st_BASE_1870478_T48_F12_M13R_pUC 26 bt02-1 - 1st_BASE_1883314_T05_M13_FP.ab1 bt02-1 1st_BASE_1883315_T05_M13R_pUC 26.ab1 bt02-1 - 1st_BASE_1883316_T09_M13_FP.ab1 bt02-1 - 1st_BASE_1883318_T16_M13_FP.ab1 bt02-2 1st_BASE_1883319_T16_M13R_pUC 26.ab1 bt02-2 - 1st_BASE_1883320_T20_M13_FP.ab1 bt02-2 1st_BASE_1883321_T20_M13R_pUC 26.ab1 bt02-2 - 1st_BASE_1883322_T21_M13_FP.ab1 bt02-3 1st_BASE_1886763_T09_M13R_pUC 26 bt03-1 1st_BASE_1883325_T22_M13R_pUC 26.ab1 bt03-1 - 1st_BASE_1883326_T67_M13_FP.ab1 bt03-1 1st_BASE_1883327_T67_M13R_pUC 26.ab1 bt03-1 - 1st_BASE_1883328_T78_M13_FP.ab1 bt03-2 1st_BASE_1883329_T78_M13R_pUC 26.ab1 bt03-2 - 1st_BASE_1883330_T81_M13_FP.ab1 1st_BASE_1883331_T81_M13R_pUC 26.ab1 bt03-2 - 1st_BASE_1883332_T82_M13_FP.ab1 bt03-2 1st_BASE_1883333_T82_M13R_pUC 26.ab1 bt03-3 - 1st_BASE_1883334_T85_M13_FP.ab1 bt04-1 1st_BASE_1870479_T53_G12_M13R_pUC bt04-1 - 1st_BASE_1883324_T22_M13_FP.ab1 bt04-1 1st_BASE_1883335_T85_M13R_pUC 26.ab1 bt04-1 - 1st_BASE_1883336_T86_M13_FP bt04-2 1st_BASE_1883337_T86_M13R_pUC 26 bt04-2 - 1st_BASE_1939762_T1_HC3F bt04-2 - 1st_BASE_1939763_T1_HC3R bt04-2 - 1st_BASE_1939764_T3_HC3F bt04-3 - 1st_BASE_1939765_T3_HC3R 43 F bt06-1 - 1st_BASE_1939767_T8_HC3R - bt06-1 - 1st_BASE_1939768_T23_HC3F bt06-1 - 1st_BASE_1939769_T23_HC3R bt06-1 - 1st_BASE_1939770_T31_HC3F bt06-2 - 1st_BASE_1939771_T31_HC3R bt06-2 - 1st_BASE_1939772_T45_HC3F bt06-2 - 1st_BASE_1939773_T45_HC3R bt06-2 - 1st_BASE_1939774_T63_HC3F bt06-3 - 1st_BASE_1939775_T63_HC3R bt06-3 - 1st_BASE_1939776_T65_HC3F Tỷ lệ genotype = 13/27= 48% Tỷ lệ genotype = 5/27= 18.5 % - Tỷ lệ genotype = 9/27 = 33.3% - Không phát đề khánáng khánáng thuốc - Xác định genotype HCV trang web: https://www.geno2pheno.org/ ...BUỔI 1: 10/10/2022 THỰC HÀNH KỸ THUẬT COLONY PCR Mụục đíícch I AI Để xác định xem plasmid vi khuẩn có chèn đoạn DNA mong muốn chuyển nạp hay không Ưu điểm: nhanh dễ thực Chhuuẩẩn bịị Dụng... tích mẫu cịn lại để chạy PCR điện di nên tiến hành đo lần BUỔI 10: 2/11/2022 THỰC HÀNH KỸ THUẬT RT RNA HCV THU ĐƯỢC Ở BUỔI AccuPid H.pylori Detection Kit/Real-time PCR/ Q01HPY01.2A Mụục đíícchh:... PCR Thứ tự chuẩn bị phản ứng phải là: Chứng âm PCR Chứng âm tách chiết Mẫu xét nghiệm chứng dương Bước 6: Đậy nắp eppendorf 0,2 ml thật kỹ, ly tâm nhẹ (3.0004.000 rpm) đặt vào máy Real-time PCR