(TIỂU LUẬN) báo cáo THỰC HÀNH môn CÔNG NGHỆ lên MEN MODULE 1 sản PHẨM TRAO đổi CHẤT bậc 1 lên MEN SINH TỔNG hợp ACID LACTIC

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH KHOA SINH HỌC VÀ MƠI TRƯỜNG  BÁO CÁO THỰC HÀNH MÔN: CÔNG NGHỆ LÊN MEN GVHD: ĐỖ THỊ HỒNG TUYẾN NHĨM: LÊ THỊ THÙY DUNG MSSV: 2008190316 TRẦN THỊ KIỀU VĨ MSSV: 2008190496 LÊ THỊ HẰNG MSSV: 2008190334 TRẦN NGUYỄN HỒNG LAN MSSV: 2008190364 TP HỒ CHÍ MINH, THÁNG NĂM 2022 MODULE SẢN PHẨM TRAO ĐỔI CHẤT BẬC LÊN MEN SINH TỔNG HỢP ACID LACTIC Cơ sở lý thuyết 1.1 Mục tiêu - Xác định điều kiện, môi trường cần thiết để lên men thu acid lactid - Thực thao tác chuẩn bị môi trường, cấy giống vi sinh vật ni cấy - Phân tích thay đổi thông số canh trường nuôi cấy vi khuẩn lactid - Thực thao tác thu nhận sản phẩm acid lactid 1.2 Lên men lactic - Acid lactic loại acid hữu tự nhiên sử dụng nhiều cơng nghiệp hóa chất, dệt, thực phẩm dược phẩm Được sản xuất thương mại nhờ lên men cacbohydrate - vi khuẩn lactic Lên men lactic loại hình lên men phát triển tự nhiên - Lên men lactic trình trao đỏi lượng Các phân tử ATP hình thành trình chuyển hóa chất (lactose) vi khuẩn giữ kaij tế bào để phục vụ cho trình trao đổi sinh trưởng vi sinh vật Ngược lại, sản phẩm acid lactic, ethanol, CO2 vi khuẩn thải vào môi trường lên men Kết hàm lượng acid tích lũy mơi trường lên men ngày làm giảm pH môi trường kéo theo biến đổi hóa lý khác - Lên men lactic đồng hình: trình lên men mà lượng acid lactic tạo thành chiếm 90%, lượng nhỏ pyruvate huyến hóa thành acid acetic,ethanol, CO2,acetoin - Các chủng vi khuẩn lactic lên men đồng hình như: Lactobacillus casei, Lactobacillus cremoris, L bulgaricus, L delbrueckii - Lên men lactic dị hình: có khoảng 50% lượng đường tạo thành acid lactic, ngồi cịn có sản phẩm phụ tương tác với tạo thành ester có mùi thơm Acid lactic tạo thành chiếm 40%, rươu ethylic 10%, acid lactic 10%, loại khí 20% 1.3 Vi khuẩn lactic - Vi khuẩn lactic thuộc họ Lactobacilliaceae Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn Gram (+) không di động, thuộc nhóm yếm khí, khơng chứa cytochrome enzyme catalase, có khả sinh tổng hợp enzyme peroxidase mạnh - Vi khuẩn lactic có đa dạng, tế bào hình cầu hình que 1.4 Cơ chế trình lên men acid lactic Acid lactic tạo thành qua trình lên men đồng sau: Glucose Glucose - - phosphate Fuctose - - phosphate Fuctose - 1,6 - diphosphate Phosphoglyceraldehyde Phosphate dioxyacetone Acid - 1,3 - diphosphoglyceric Acid pyruvic Acid lactic 1.5 Nguyên liệu Vi khuẩn lactic sử dụng nhiều nguồn đường lactose, glucose, galactose, maltose, dextrin, chí L delbrueckii có khả đồng hóa tinh bột Trong sản xuất công nghiệp người ta sử dụng mật rỉ đường để lên men rẻ tiền, dễ kiếm Trước tiên mật rỉ cần xử lí để tẩy màu tách chất keo mật rỉ Xử lí màu người ta dùng than hoạt tính Mật rỉ pha lỗng tỉ lệ 1:3, sau cho chảy qua cột than hoạt tính Than hoạt tính hấp thụ chất màu Sau làm lỗng mật rỉ đến nồng độ chất khô 15% dùng H 2SO4 5% theo khối lượng dịch để acid hóa mơi trường H2SO4 có saccharose thành đường nghich đảo giúp trình lên men sau tốt Trong giai đoạn người ta đun dung dịch 90-95⁰C Hóa chất, dụng cụ, thiết bị 2.1 Hóa chất HĨA CHÂT STT TÊN HÓA CHÂT Glucose MT MRS Cao nấm men NaOH HCL Tím kết tinh Lugol Fuchsin Phenolphtalein 10 Nước cất 11 Cồn 12 Xanh methylene 13 K2HPO4 14 MgSO4 15 ZnSO4.7H20 16 (NH4)2SO4 17 Ca(OH)2 18 Bông không thấm nước 19 Bông thấm nước 2.2 Dụng cụ DỤNG CỤ STT Tên dụng cụ Ống nghiệm Hộp petri Ống hút Quả bóp Bình tia Que cấy vịng Que cấy móc Lame + lamelle Đèn cồn 10 Cốc thủy tinh 11 Cốc thủy tinh 12 Cốc thủy tinh 13 Giá ống nghiệm 14 Phễu thủy tinh 15 Gía thủy tinh 16 Buret 17 Màng bọc PVC 18 Giấy báo 19 Thung buộc 20 Ống ly tâm 21 Gía pipet 22 Eppendorf 23 Đầu típ 24 Đầu típ 25 Hộp đựng đầu típ lớn ( hấp được) 26 Hộp đựng đầu típ nhỏ ( hấp được) Đũa thủy tinh Dài Tổ STT 10 11 12 13 Q u y t r ì n h c n g n h g i h ệ ệ n G i ố n g Q u y t v i r k h u ẩ n ì n h n l a c t i c u ô i c ấ Xác định hàm lượn g acid lactic y Môi trường lên men cid Khửlacti trùngc thô Lên men Các bướ Canh trường c T thự c 4.1 Lập đường chuẩn acid lactic Bước Pha ml acid lactic chuẩn ml nước cất để stock nồng độ 120 g/L (khối lượng riêng acid lactic 1,2g/ml) Bước Pha loãng stock để dãy nồng độ acid lactic gồm 0,1; 0,5; 1; 2; 5; 10 (g/L) Bước Hút 50µl dung dịch acid lactic nồng độ khác cho vào ống nghiệm Bước Cho thêm 2ml FeCl3 0,3% vào ống nghiệm Bước Lắc đo OD390 (dung dịch FeCl3 0,3% dùng trắng mẫu), điển kết vào bảng Bang Xây dựng đường chuẩn acid lactic Nồng độ acid lactic (g/L) Bước Vẽ đường tương quan giá trị OD 390 nồng độ acid lactic tương ứng 4.2 Lên men thu nhận acid lactic Bước Pha chế môi trường nhân giống, môi trường lên men acid lactic dung dịch điều chỉnh pH Vi khuẩn lactic nhân giống môi trường MRS Bang Thành phần môi trường MRS Tên chất Protease Peptone Cao thịt bò Cao nấm men Dextrose Polysorbate 80 Ammonium citrate Natri acetate MgSO4 MnSO4 K2HPO4 Agar Nước Bang Môi trường lên men acid lactic Tên chất Glucose Cao nấm men Natri acetate K2HPO4 Nước cất pH cuối 6,5 Mỗi lớp pha: − 1000 mL môi trường lên men đưa vào fermenter − 250 mL NaOH 2M − 250 mL H2SO4 2M Bước Bao gói giấy bịt nắp dụng cụ mơi trường Bao gói pipet 10mL, dụng cụ chứa mơi trường, đầu típ Bước Hấp khử trùng môi trường nuôi cấy dụng cụ 1210C, 20 phút Bước Vệ sinh khu vực thao tác cồn 700 lấy môi trường để nguội Bước Kiểm tra giống Lactobacillus acidophillus (*) Kiểm tra trạng thái tế bào, xác định mật độ phương pháp đo độ đục ( giống Lactobacillus acidophillus cần nhân giống môi trường lỏng MRS trước 24 Bước Cấy giống Lactobacillus acidophillus từ môi trường MRS fermenter với tỷ lệ 5% Bước Cài nhiệt độ lên men 35oC, pH =6 Cài đặt tốc độ bơm acid base 0,5 ml/s Bước Kiểm tra thông số (2h lần, điểm cuối 46h) : nồng độ sinh khối,hàm lượng acid lactic(g/L) Xác định nồng độ acid lactic phương pháp quang phổ Nguyên tắc: Phản ứng sắt (III) chloride với acid lactic môi trường dung dịch tạo thành sắt (III) lactate có màu xanh vàng, hấp thụ cực đại bước sóng 390 nm Cách tiến hành: − Cho 50 µl mẫu cần xác định nồng độ acid lactic vào ống nghiệm (đối với mẫu canh trường cần lọc bỏ sinh khối trước) − Bổ sung ml dung dịch FeCl3 0,3 % vào ống nghiệm chứa mẫu, lắc Nồng độ Gibberellin theo 0.1 0.09 0.08 0.07 N n g 0.06 đ ọ 0.05 G A 0.04 0.03 ( g / l ) 0.02 0.01 40 Hinh Nồng độ GA3 theo  Xác định GA3 mẫu: Hinh Dung dịch sau cho thuốc thử phosphor molybdic  Kết đo OD: 22 Từ giá trị OD ghi nhận được, tính ∆OD theo cơng thức: ∆OD = ODx - ODo Trong đó: ODx giá trị ghi nhận tương ứng với mẫu canh trường sau trích ly ODo giá trị ghi nhận tương ứng với mẫu đối chứng ∆OD1 = 0,198 - 0,004 = 0,194 ∆OD2 = 0,192 - 0,004 = 0,188 Từ giá trị ∆OD tính được, xét giá trị ∆OD nằm giới hạn đường chuẩn GA3 0,01 - 0,1 g/l hay đường chuẩn GA3 0,1 - 0,5 g/l, thay giá trị ∆OD biến số x phương trình đường chuẩn dạng y = ax + b tính nồng độ GA3 mẫu Ta có phương trình đường chuẩn y = 3.0991x - 0.0014 Nồng độ GA3 mẫu 1: y = 0,6 g/l Nồng độ GA3 mẫu 2: y = 0,581 g/l 23 MODULE CHỦ ĐỘNG KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA TỶ LỆ CƠ CHẤT CẢM ỨNG (CASEIN) ĐẾN SỰ SINH TỔNG HỢP ENZYME PROTEASE CỦA ASPERGILLUS NIGER ĐẶT VẤN ĐỀ Protease (cịn gọi proteinase peptidase) nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide (-CO-NH-) chuỗi polypeptide Protease chiếm khoảng 60% thị trường enzyme cơng nghiệp Trong đó, protease từ vi sinh vật chiếm khoảng 40% tổng số enzyme bán toàn giới Nghiên cứu tổng hợp protease từ vi sinh vật Aspergillus niger vi sinh vật quan trọng sử dụng công nghệ sinh học Nó sử dụng nhiều thập kỷ để sản xuất enzyme ngoại bào (thức ăn) axit citric Aspergillus niger dòng nấm sợi phân bố rộng rãi nhiều loại chất tự nhiên sản phẩm nông nghiệp, biết đến với khả sinh tổng hợp nhiều loại enzyme, có protease Từ định hướng trên, chúng tơi xác định mục đích nghiên cứu đề tài để xác định khả sinh tổng hợp enzyme protease từ chủng nấm mốc Aspergillus niger tác động yếu tố ảnh hưởng nồng độ chất (casein) CƠ SỞ LÝ THUYẾT 2.1 Quá trình lên men Protease ngoại bào sản xuất theo phương pháp lên men chìm lên men bán rắn Phương pháp lên men bán rắn đặc biệt thích hợp cho phát triển nấm chúng yêu cầu độ ẩm thấp so với vi khuẩn Ngoài ra, phương pháp lên men tương đối đơn giản, rẻ tiền mang lại hiệu suất sinh tổng hợp enzyme cao Với thành phần môi trường lên men gồm cám, trấu, casein Casein nguồn chất tổng hợp protease cao môi trường bán rắn 2.2 Đối tượng vi sinh vật Aspergillus niger loại nấm sợi đơn, bào tử dính dài trơn khơng màu hay nâu, thể bình đáy, túi nấm trịn đầu xịe Aspergillus niger sinh sản hình thức bào tử dính khơng túi bao bọc Cơ thể dạng sợi, gọi khuẩn ty hay sợi nấm (hypha), nhiều sợi (lypha), hợp lại thành hệ sợi nấm (mycelium) Khuẩn ty nấm tăng trưởng có vách ngăn 24 Aspergillus niger đồng hóa tốt loại đường glucose, fructose, saccharose, mannose Đối với đường sorbose, galactose, Aspergillus niger đồng hóa mức tốt, cịn đường lactose đồng hóa mức trung bình Aspergillus niger có khả sinh enzyme amylase, protease, pectinase, α– amylase, glucoamylase 2.3 Sản phẩm protease Protease enzyme thuộc nhóm hydrolase, xúc tác cho trình thủy phân liên kết peptit ( -CO-NH-) phân tử protein peptit thành enzyme tự Enzyme protease enzyme thủy phân liên kết pectid (-CO-NH-) phân tử protein giải phóng acid amin, pepton dittripepton HÓA CHẤT- DỤNG CỤ- THIẾT BỊ 3.1 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị STT 10 11 12 13 14 15 25 10 11 12 13 14 15 16 26 Máy lắc Máy ly tâm Máy đo pH 3.2 Pha hóa chất - Pha dung dịch TCA 5%: cân 5g pha với nước cất thành 100ml - Pha dung dịch tyrosin 1/400N: cân 0,045g tyrosin (cân số lẻ), hịa tan hồn tồn 100ml HCl 0,2N - Pha dung dịch casein 1%: cho 1,9g casein + 20 - 30ml dd NaOH 0,5N vào cốc 250ml Đặt lên máy khuấy từ, gia nhiệt (50 - 60 oC) khuấy cho casein tan hết, tiếp tục khuấy không gia nhiệt Sau nhỏ từ từ HCl 0,5N để pH đạt 7,5 - 8,0 Cuối dùng đệm Na2HPO4 pH = định mức đến 200ml - Pha dung dịch NaOH 0,5N: Pha 10g 500ml nước cất - Pha thuốc thử Folin 1/3N: từ Floin 1N pha loãng lần nước cất 3.3 Chuẩn bị môi trường Bảng Thành phần khống bổ sung mơi trường lên men Thành phần NaNO3 K2HPO4 MgSO4 KCl FeSO4 Nước cất 3.4 Quy trình ni cấy Quy trình ni cấy Aspergillus niger để thu nhận enzyme protease khái quát thông qua sơ đồ sau 27 Aspergillus niger Nhân giống Lên men Khảo sát yếu tố ảnh hưởng Thu nhận sản phẩm thô (1) H o thô protease t t í n h e n z y m e ( ) Hình 3.4 Sơ đồ quy trình ni cấy thu nhận enzyme protease (1): Thu nhận sản phẩm thô cách tạo dịch bào tử (2): Dùng phương pháp Ansson cải tiến để xác định hoạt tính enzyme protease Thực nghiệm thức 2%, 4%, 6% 3.5 Chuẩn bị giống Aspergillus niger giữ giống thạch nghiêng PDA (Potato dextrose agar) 4°C Cấy chuyển giống sang ống thạch nghiêng PDA khác, để nhiệt độ 34 - 35˚C 72 đến 96 Lấy mL nước cất vô trùng đánh tan bào tử Aspergillus niger chuyển sang bình tam giác chứa mơi trường PDA, để nhiệt độ 34-35˚C 72 đến 96 Mật độ bào tử xác định cách đếm buồng đếm hồng cầu đạt 107 bào tử/mL NỘI DUNG THỰC HIỆN 28 4.1 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ casein đến trình sinh tổng hợp enzyme protease Aspergillus niger Mục đích: Chọn tỷ lệ casein thích hợp cho nấm mốc để thu enzyme protease có hoạt tính cao Cách tiến hành: _ Nhân giống : Trong môi trường PDA đĩa thạch Nuôi cấy 72 đến 96 _ Lên men (nhân sinh khối): Chuẩn bị môi trường bình tam giác 500ml chứa 10g mơi trường bán rắn với tỷ lệ cám : trấu (7:3), bổ sung khống (bảng 3.3) tạo độ ẩm cho mơi trường với độ ẩm khoảng 45% Sau bổ sung chất vào bình với tỷ lệ bảng 4.1 Đem hấp khử trùng 20 phút, để nguội Sau cho vào bình lát thạch chứa bào tử nấm mốc để lên men Bảng 4.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỉ lệ chất casein tới khả sinh enzyme protease Yếu tố theo dõi: hoạt tính enzyme protease Kết thu được, điền vào bảng sau: 4.2 Phương pháp phân tích (phương pháp xác định hoạt tính enzyme protease) 4.2.1 Thu sản phẩm thô (enzyme protease thô) 29 Sau lên men, sử dụng 100 mL dung dịch đệm phosphate pH = 7,6 cho vào môi trường lên men, dùng đũa khuấy để mơi trường bình trộn với dung môi 15 phút Lọc lấy dịch qua lọc thu lấy dịch enzyme thô 4.2.2 Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Ansson cải tiến Nguyên tắc: Khả thủy phân enzyme protease thực với chất protein (hemoglobin, casein, albumin) tạo sản phẩm tan dung dịch TCA peptide có chứa tyrosin Việc định lượng tyrosin phản ứng màu với thuốc thử Folin – Ciocalteu cho biết hoạt động thủy phân enzyme xác định hoạt tính enzyme Các bước tiến hành: Chuẩn bị ống nghiệm theo bảng Bảng 6.Chuẩn bị ống nghiệm đo hoạt tính protease Hóa chất Dung dịch Casein 1% TCA5% HCl 0,2N Tyrosin 1/400N Dịch E protease TCA 5% Dịch E protease DD lọc NaOH 0,5N 30 Thuốc thử Folin 1/3 1,0 ml Lắc để yên 15 phút Đo OD 59 5n m  T í n h k ế t q u ả : H T = x ∆ O D M × × X ∆ O D T X Trong : HT: hoạt tính enzyme protease (UI/ml) X1 : thể tích dung dịch tyrosin chuẩn (ml) X2: Thể tích dung dịch chứa enzyme (ml) Hinh Lên men nấm mốc bổ sung chất casein tỷ lệ 5.2 Th u nh ận enz ym e pro tea se thô ∆ODT = ODT – ODC, ∆ ODM = ODM - ODC Kết 5.1 Lên men nấm mốc Aspigi llus niger Hinh 10 Thu nhận enzyme thô tỷ lệ casein 2% 4% 6% 31 5.3 Xác định hoạt tính enzyme protease theo phương pháp Ansson cải tiến Hinh 11 Dung dịch sau cho thuốc thử folin 1/3N  Kết đo OD: Các Ca ống nghiệ m OD 595 nm Ta có: ΔODT = ΔODM = ODM - ODC Enzyme protease tỉ lệ chất casein 2%: ΔODT = 0,400 – 0, 269 = 0,131 ΔODM = 0,300 – 0,269 = 0,031 Enzyme protease tỉ lệ chất casein 4%: ΔODT = 0,438 – 0,293 = 0,145 ΔODM = 0,365 – 0,293 = 0,072 Enzyme protease tỉ lệ chất casein 6%: ΔODT = 0,463 – 0,319 = 0,144 ΔODM = 0,387 – 0,319 = 0,068  Hoạt tính enzyme protease 32 Enzyme protease tỉ lệ chất casein 2%: X 450×∆OD M × × = 450 ×0,031 × × 0,5 =10,649¿ HT= ∆ODT 10 X2 0,131 10 0,5 Enzyme protease nồng tỉ lệ chất độ casein 4%: X 450×∆OD M × × = 450 ×0,072 × × 0,5 =22,345 ¿ HT= ∆ODT 10 X2 0,145 10 0,5 Enzyme protease tỉ lệ chất casein 6%: 450×∆O HT= ∆OD  Nhận xét: Hoạt tính enzyme protease đạt giá trị lớn tỉ lệ chất casein 4% (22,245 UI/mL) đạt giá trị nhỏ tỉ lệ chất casein 2% (10,649 UI/mL) 33 .. .MODULE SẢN PHẨM TRAO ĐỔI CHẤT BẬC LÊN MEN SINH TỔNG HỢP ACID LACTIC Cơ sở lý thuyết 1. 1 Mục tiêu - Xác định điều kiện, môi trường cần thiết để lên men thu acid lactid - Thực thao tác... thiết bị STT 10 11 12 13 14 15 25 10 11 12 13 14 15 16 26 Máy lắc Máy ly tâm Máy đo pH 3.2 Pha hóa chất - Pha dung dịch TCA 5%: cân 5g pha với nước cất thành 10 0ml - Pha dung dịch tyrosin 1/ 400N:... nhiều công nghiệp hóa chất, dệt, thực phẩm dược phẩm Được sản xuất thương mại nhờ lên men cacbohydrate - vi khuẩn lactic Lên men lactic loại hình lên men phát triển tự nhiên - Lên men lactic