NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SỐNG SĨT VÀ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA NẤM MEN BÁNH MÌ SACCHAROMYCES CEREVISIAE VÀ ACETOBACTER XYLINUM KHI BẢO QUẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG KHÔ

Trần Thị Xô, Ngô Thị Minh Phương* 58 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SỐNG SĨT VÀ ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA NẤM MEN BÁNH MÌ SACCHAROMYCES CEREVISIAE VÀ ACETOBACTER XYLINUM KHI BẢO QUẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP ĐÔNG KHÔ VIABILITY AND BIOLOGICAL PROPERTIES OF BAKER'S YEAST SACCHAROMYCES CEREVISIAE AND ACETOBACTER XYLINUM WHEN PRESERVED BY LYOPHILIZATION Trần Thị Xô1, Ngô Thị Minh Phương2 Trường Đại học Bách khoa, Đại học Đà Nẵng Trường Cao đẳng Công nghệ, Đại học Đà Nẵng Tóm tắt - Đơng khơ phương pháp bảo quản phổ biến việc lưu giữ sưu tập chủng vi sinh vật Phương pháp tiện lợi cho việc bảo quản vận chuyển giữ cho vi sinh vật sống sót thời gian dài Trong báo này, tiến hành nghiên cứu số điều kiện để cải thiện phương pháp đơng khơ chủng nấm men bánh mì Saccharomyces cerevisiae vi khuẩn lên men tạo cellulose Acetobacter xylinum Trong trình bảo quản, định kì kiểm khả sống sót đặc tính sinh học chúng kết cho thấy rằng: Sau đông khô, tỉ lệ sống sót vi khuẩn 12%, nấm men 2,96%, sau thời gian bảo quản năm tỉ lệ sống sót vi khuẩn cịn mức cao 3*106CFU/ml nấm men 106CFU/ml Đặc tính sinh học hai chủng có giảm khơng đáng kể Chất bảo vệ có hiệu q trình đơng khơ sữa gầy Abstract - Freeze-drying is a common method of preservation in the storage collection of microorganisms This method is very convenient for storage and transport and it helps the microorganisms survive in the long-term period In this paper, we studied some conditions to improve the method of freeze-dried on yeast’s baker Saccaromyces cerevisae and bacteria fermented cellulose Acetobacter xylinum During storage, evaluating viability and their biological properties, the results showed that after freezedrying, the survival rate of bacteria is 12 %, yeast is 2,96 %, after years of storage, the survival of bacteria remained at high rate 3*106CFU/ml and yeast is 106CFU/ml Biological characteristics of two strains have decreased but not at a considerable rate The most efficient protectant of freeze-drying is skim milk Từ khóa - Saccharomyces cerevisiae; Acetobacter xylinum; chất bảo vệ; sống só Key words - lyophilization; Saccharomyces Acetobacter xylinum; cryoprotectants; survival Đặt vấn đề: Chủng nấm men S.cerevisiae tác nhân quan trọng để làm nở bột nhào sản xuất bánh mì Vi khuẩn A.xylinum có khả lên men tạo cellulose lựa chọn cho q trình lên men sản phẩm thạch dừa Chúng tơi chọn hai chủng để nghiên cứu chúng có ý nghĩa lớn tầm quan trọng công nghệ thực phẩm - sinh học Nếu bảo quản chủng giống phương pháp thơng thường thời gian bảo quản ngắn, giống dễ bị thối hóa theo thời gian, việc tìm phương pháp bảo quản tốt việc cần thiết Đông khơ q trình sử dụng rộng rãi để bảo quản lưu giữ lâu dài sưu tập vi sinh vật Nhiều chủng vi sinh vật đông khô gởi đến lưu giữ vi sinh vật sáng chế quốc tế (IPOD) kiểm tra định kì đến 20 năm Vi sinh vật lưu giữ phương pháp đơng khơ có nhiều ưu điểm: khả sống sót cao, tiện cho việc sử dụng lưu chuyển Tuy nhiên q trình đơng khô tế bào phải chịu điều kiện khắc nghiệt nhiệt độ hoạt độ nước thấp làm ảnh hưởng cấu trúc sinh lý tế bào, kết làm khả sống sót chúng Để ngăn chặn giảm thiểu tác động không mong muốn này, người ta phải thêm vào chất bảo vệ trước lạnh đông [6] Với lí trên, mục đích nghiên cứu chúng tơi đánh giá khả sống sót đặc tính sinh học hai chủng S.cerevisiae A.xylinum với chất bảo vệ khác thời gian bảo quản năm tìm chất bảo vệ thích hợp cho q trình đơng khơ hai chủng nghiên cứu Đối tượng phương pháp nghiên cứu: 2.1 Đối tượng nghiên cứu - Vi khuẩn A.xylinum hoạt hóa lại từ mẫu giống viện Cơng nghệ sinh học TP HCM, nấm men bánh mì S.cerevisae phân lập từ bánh men ướt để sản xuất bánh mì - Môi trường HS PDA 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp vi sinh Xác định gián tiếp số lượng tế bào cách đếm số lượng khuẩn lạc phát triển môi trường thạch Số lượng tế bào vi sinh vật 1ml mẫu tính theo cơng thức sau: n.D Số tế bào/ml mẫu = V Trong đó: n: Số khuẩn lạc trung bình đĩa Petri độ pha loãng định V: Thể tích dịch mẫu đem cấy (bằng 0,1ml phương pháp cấy gạt 1ml phương pháp đổ đĩa) D: hệ số pha loãng 2.2.2 Phương pháp vật lí a Đánh giá sinh trưởng phát triển vi sinh vật Tiến hành đo độ đục máy UV-Vis bước sóng 600nm q trình xác định khả sinh trưởng phát triển nấm men S.cerevisiae vi khuẩn A xylinum Số lượng tế bào biểu kiến/ml tính thơng qua mật độ quang học OD phương trình sau: cerevisiae; ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, SỐ 11(84).2014, QUYỂN X 2,5x10 cells / ml = OD 0,3 Trong đó: 4.0 X: số lượng tế bào/ml 3.5 OD: giá trị mật độ quang học đo bước sóng 600nm [7] - Chuẩn bị bột mì nhào trộn với 1% nấm men dạng paste Cho khối bột nhào (khoảng 50g) vào cốc 100ml có chia vạch ml Đọc xác thể tích lúc sau 30 phút tiến hành đo thể tích khối bột nhào lần 3.0 OD (600nm) b Xác định hoạt lực làm nở nấm men bánh mì Saccharomyces cerevisiae [1] 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 c Xác định khả tạo khối đông thạch dừa Acetobacter xylinum Lấy 10ml nước dừa già, bổ sung 1g đường saccarose, 0,05g (NH4)2HPO4, 0,08ml axit acetic 40% băng Dùng axit acetic 40% để điều chỉnh pH môi trường đến pH = Thanh trùng môi trường cách đun sôi nhẹ thời gian 15 – 20 phút Để nguội cấy vi khuẩn Acetobacter xylinum vào với tỉ lệ giống 10%, để lên men nhiệt độ 300C giữ ngày Sau cân để biết khối lượng thạch dừa lên men 20 40 60 80 T, 100 120 140 160 Hình1 Đồ thị biểu diễn sinh trưởng phát triển A.xylinum Như lấy mẫu bảo quản, lấy mẫu sau bắt đầu nuôi cấy 72 thời điểm đó, tế bào vi khuẩn giai đoạn phát triển với tốc độ cao, tế bào non trẻ phù hợp để mang bảo quản Khả sinh trưởng phát triển S.cerevisiae biểu diễn đồ thị Hình2 2.0 2.2.3 Phương pháp đông khô Chuẩn bị mẫu đông khô sau: Nấm men vi khuẩn điều chỉnh để có mật độ xác số lượng tế bào/ml ban đầu Sau cho dịch huyền phù tế bào trộn với dịch bảo vệ trùng theo tỉ l:1, cho vào ống nghiệm kích thước Ø45mm 0,2ml dung dịch mẫu sau làm lạnh sâu -200C Sau mẫu đưa vào đông khô 400C Sau đơng khơ, mẫu hàn kín parafin bảo quản 40C Bảng Dung dịch nồng độ chất bảo vệ đông khô Nồng độ, % 10 + 0,75 10 + 0,5 10 30 1.5 OD - 600nm Nuôi vi sinh vật môi trường thích hợp cuối giai đoạn logarit, thu tế bào trộn chất bảo vệ Bảng 1, dùng pipet vô trùng phân 0,2ml huyền phù vi sinh vật vào ống đông khô chuyên dùng Sau tiến hành đơng khơ mẫu [4] Chất bảo vệ Saccarose + cao nấm men Saccarose + pepton Sữa gầy Tinh bột 59 Nhận xét: Qua đồ thị Hình1 ta thấy rằng: Lượng sinh khối đạt cao sau 120 nuôi cấy số ODmax = 2,89 1.0 0.5 0.0 Để xác định khả sinh trưởng phát triển chủng vi khuẩn Acetobacter xylinum, tiến hành nuôi cấy giống vi khuẩn Acetobacter xylinum môi trường HS với tỉ lệ giống 10% Các mẻ cấy vi khuẩn nuôi 300C ngày Cứ sau lấy mẫu đo OD600nm máy UV-Vis thu kết đồ thị Hình 30 40 50 60 Hình2 Đồ thị biểu diễn sinh trưởng phát triển nấm men bánh mì Nhận xét: Qua đồ thị Hình2 ta nhận thấy: Tốc độ sinh trưởng phát triển nấm men đạt cực đại sau 39 giờ, giá trị ODmax = 1,612 Ta chọn thời điểm thích hợp để lấy mẫu đem bảo quản trước 39 3.1.2 Khảo sát đặc tính sinh học hai chủng vi sinh vật nghiên cứu - Ta đánh giá chất lượng nấm men bánh mì S cerevisiae thơng qua khả làm nở bột nhào chúng - Tiến hành chuẩn bị mẫu mục 2.2.2 Kết trình bày Hình3 100 Thể tích khối bột (ml) 3.1.1 Khả sinh trưởng phát triển hai chủng vi sinh vật nghiên cứu 20 Thời gian (giờ) Kết thảo luận 3.1 Sự phát triển đặc tính sinh học ban đầu nấm men bánh mì S.cerevisiae, vi khuẩn A.xylinum 10 80 60 40 20 0 30 60 90 120 150 Thời gian (phút) Hình Đồ thị biểu diễn hoạt lực làm nở khối bột nhào nấm men bánh mì S cerevisiae Trần Thị Xơ, Ngô Thị Minh Phương* 60 Dựa vào kết trên, tơi thấy khối bột nhào ban đầu tích 36,5ml, sau đạt độ nở cao nhất, thể tích lớn khối bột nhào đạt 88ml So sánh với tiêu chất lượng nấm men bánh mì theo tài liệu [1] tơi thấy hoạt lực làm nở nấm men Saccharomyces cerevisiae tương đối cao Xác định khả tạo khối đông thạch dừa vi khuẩn Acetobacter xylinum Chuẩn bị mẫu giống mục 2.2.2c, đo mẫu ngày lên men thứ 4, 5, 6, 7, thu kết Bảng Để hoạt hóa lại mẫu, dùng sữa gầy tiệt trùng hình ảnh hoạt hóa lại sau đơng khơ tháng trình bày Hình Hình Bảng Khả tạo khối đông vi khuẩn Acetobacter xylinum theo thời gian Thời gian, ngày Khối lượng khối đông thu được, g 1,7 2,2 2,3 2,4 Từ kết nhận thấy rằng, sau ngày lên men khối đơng tạo thành lớn, từ ngày thứ trở khối đông tiếp tục hình thành với tốc độ chậm trước 3.2 Bảo quản nấm men bánh mì S.cerevisiae vi khuẩn A.xylinum phương pháp đông khô Mẫu tiến hành đông khô mục 2.2.3 ghi lại Hình Số lượng tế bào, CFU/ml Hình Mẫu nấm men vi khuẩn đơng khơ Hình Hình ảnh khuẩn lạc nấm men trước sau đông khơ Hình Hình ảnh khuẩn lạc vi khuẩn trước sau đông khô - Các khuẩn lạc mọc đĩa thạch có đặc điểm hình thái giống hệt hình thái chủng nấm men vi khuẩn trước đông khô, số lượng khuẩn lạc nhiều Điều chứng tỏ phương pháp đông khô với những chất bảo vệ phù hợp với trình bảo quản hai chủng vi khuẩn nấm men nghiên cứu 3.3 Kiểm tra khả sống sót đặc tính sinh học chủng nghiên cứu sau đông khô bảo quản 3.3.1 Khả sống sót nấm men bánh mì S.cerevisiae, vi khuẩn A.xylinum sau đơng khơ bảo quản Chúng tiến hành xác định số lượng tế bào nấm men vi khuẩn sống sót cách đếm khuẩn lạc mọc môi trường thạch, thu kết biểu diễn đồ thị Hình Hình 1.00E+08 1.00E+06 1.00E+04 1.00E+02 1.00E+00 Saccarose + cao nấm men Saccarose + gelatin Tinh bột Sữa gầy Không chất bảo vệ Số lượng tế bào ban đầu Số lượng tế bào sau đông khô Số lượng tế bào sau tháng đông khô Số lượng tế bào sau tháng đông khô Số lượng tế bào sau năm đơng khơ Hình Đồ thị biểu diễn khả sống sót S.cerevisiae theo thời gian bảo quản phương pháp đông khô Số lượng tế bào, CFU/ml ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, SỐ 11(84).2014, QUYỂN 61 1.00E+08 1.00E+06 1.00E+04 1.00E+02 1.00E+00 Saccarose + Saccarose + cao gelatin nấm men Số lượng tế bào ban đầu Số lượng tế bào sau tháng đông khô Số lượng tế bào sau năm đông khô Tinh bột Sữa gầy Không chất bảo vệ Số lượng tế bào sau đông khô Số lượng tế bào sau tháng đơng khơ Hình Đồ thị biểu diễn khả sống sót A.xylinum theo thời gian bảo quản phương pháp đơng khơ Bảng Đặc tính sinh học chủng vi sinh vật sau thời gian bảo quản phương pháp đông khô Thời gian khảo sát Trước đông khô Sau tháng Sau năm Hoạt lực làm nở khối bột nhào S.cerevisiae Thể tích, ml % so với ban đầu 88 100 84 95,4 83 94,3 ❖ Nhìn vào đồ thị Hình ta có số nhận xét sau: - Sau q trình đơng khơ, khả sống sót tế bào nấm men giảm xuống đáng kể, số lượng ban đầu 2,7.108 CFU/ml giảm 106 – 8.106 CFU/ml hầu hết trường hợp, với kết thu tốt đông khô với chất bảo vệ sữa gầy 8.106 CFU/ml - Sau đông khô, khả sống sót tế bào nấm men khơng có chất bảo vệ thấp, 106 CFU/ml khả sống sót nấm men sau đơng khơ trường hợp có 10% sữa gầy 8.106 CFU/ml Theo tài liệu tham khảo [2] việc bổ sung chất bảo vệ, chẳng hạn loại đường, làm giảm lượng nước liên kết bề mặt protein nấm men Các chất bảo vệ hình thành liên kết hydro với protein, thay cho nước để trì ổn định protein Khi sử dụng đường saccarose kết hợp với cao nấm men thấy hiệu bảo vệ tăng lên đáng kể, khả sống sót sau đơng khơ 5.106 CFU/ml - Với chất bảo vệ tinh bột, ta nhận thấy khả sống sót nấm men sau đông khô 6.106 CFU/ml, thấp so với chất bảo vệ sữa gầy Kết giải thích tinh bột có khả giữ lại một lượng nước nhiều Nước dạng liên kết nên vi sinh vật hoạt động lượng nước đảm bảo khả sống sót vi sinh vật - Trong tất chất bảo vệ sau q trình đơng khơ, sữa gầy cho kết tốt nhất, số lượng tế bào nấm men sống 8.106 CFU/ml Sự diện lượng lớn protein muối phosphate sữa cung cấp bổ sung lớp phủ bảo vệ cho tế bào q trình lạnh đơng sấy khơ Đồng thời, sữa gầy cho khả Khả tạo khối đông A.xylinum Khối đông tạo thành, g % so với ban đầu 2,4 100 2,2 91,6 2,2 91,6 sống sót tốt tạo sản phẩm đơng khơ có cấu trúc xốp làm cho việc bù nước dễ dàng [2] - Sau thời gian bảo quản tháng, khả sống sót nấm men tiếp tục giảm tỉ lệ giảm không đáng kể với mẫu có chất bảo vệ Và sau tháng bảo quản, kiểm tra lại mẫu có chất bảo vệ sữa gầy thấy tỉ lệ sống sót 0,88%, mẫu không chất bảo vệ 0,09%, Như tỉ lệ sống sót sau tháng giảm so với tháng Cịn mẫu khơng chất bảo vệ sau tháng bảo quản nấm men khơng cịn sống sót Sau năm bảo quản, đem kiểm tra lại thấy, mẫu sữa gầy số lượng tế bào sau hoạt hố cịn 106CFU/ml mẫu saccarose + cao nấm men 5,7.105CFU/ml Với tỉ lệ sống sót đảm bảo vai trò bảo quản giống ❖ Trên đồ thị hình biểu diễn khả sống sót vi khuẩn A.xylinum ta có nhận xét sau: - Số lượng tế bào vi khuẩn giảm sau trình đơng khơ tỉ lệ giảm so với nấm men Ví dụ với mẫu vi khuẩn đơng khơ chất bảo vệ sữa gầy tỉ lệ sống sót sau đơng khơ 12%, cao so với nấm men 2,96% Cơ chế bảo vệ chất bảo vệ có hiệu tương tự chủng nấm men Các mẫu có chất bảo vệ khác chủng vi khuẩn cao so với nấm men Điều khác cấu trúc màng tế bào vi khuẩn nấm men Kết lần khẳng định lại nghiên cứu tài liệu [5] cho rằng: Nấm men, vi khuẩn có khả sống sót khác sau q trình đơng khơ Trong nghiên cứu tỉ lệ sống sót nấm men S.cerevisiae sau đông khô 8%, vi khuẩn Enterococcus faecium 85%, Pseudomonas putida 33% Trần Thị Xô, Ngô Thị Minh Phương* 62 Và sau tháng bảo quản tỉ lệ sống sót vi khuẩn giảm không đáng kể so với sau đơng khơ Mẫu khơng có chất bảo vệ tế bào vi khuẩn khơng cịn sống sót Đến sau năm bảo quản, chúng tơi hoạt hố lại thấy kết mẫu có chất bảo vệ sữa gầy hỗn hợp saccarose + cao nấm men có số lượng tế bào 4,6.107 CFU/ml 106 CFU/ml, chứng tỏ lượng tế bào vi khuẩn cịn sống sót mức cao đảm bảo thành cơng cho việc bảo quản giống 3.3.2 Ảnh hưởng trình đơng khơ bảo quản đến đặc tính sinh học nấm men bánh mì S.cerevisiae vi khuẩn A.xylinum Sau hoạt hố lại mẫu đơng khơ bảo quản, đem mẫu kiểm tra đặc tính sinh học chúng, thu kết Bảng Kết Bảng 3.4 cho thấy hoạt lực làm nở bột nhào nấm men S.cerevisiae khả tạo cellulose A.xylinum có bị giảm sau đông khô bảo quản tháng năm giảm khơng đáng kể, chí với vi khuẩn khơng giảm, tất đạt 90% so với hoạt lực ban đầu Điều chứng tỏ hai chủng nghiên cứu thích hợp với phương pháp đông khô 3.4 Sử dụng vi khuẩn A.xylinum sau đông khô để sản xuất sản phẩm thạch dừa Sau có chủng giống vi sinh vật tìm phương pháp bảo quản thích hợp, chúng tơi tiến hành lên men thử nghiệm tạo sản phẩm thạch dừa từ vi khuẩn Acetobacter xylinum bảo quản phương pháp đông khô theo quy trình cơng nghệ sau so sánh sản phẩm thu với thạch dừa lên men từ vi khuẩn trước đơng khơ Sơ đồ quy trình cơng nghệ lên men thạch dừa: Vi khuẩn A.xylinum → Đông khô bảo quản 40C → Hoạt hoá lại Nước dừa→ Lọc→ Trộn đều→ Đun sôi 15 phút→ Để nguội→ Cho axit axetic vào→ Cấy giống→ Lên men→ Thạch dừa TÀI LIỆU THAM KHẢO Hình Hình ảnh sản phẩm thạch dừa Sau thời gian bảo quản hoạt hoá giống lên men thạch dừa, sản phẩm tạo thành giống ban Điều chứng tỏ rằng, đặc tính sinh học chủng giống khơng bị thay đổi, khơng bị thay đổi đặc tính di truyền trình bảo quản Đây hai tiêu chí quan trọng việc bảo quản giống Kết luận - Phương pháp đơng khơ thích hợp để bảo quản hai chủng nấm men bánh mì S cerevisiae vi khuẩn A xylinum với thời gian bảo quản năm đảm bảo tỉ lệ sống sót 106CFU/ml, hoạt lực sinh học chúng thay đổi không đáng kể - Chất bảo vệ tốt cho trình đơng khơ sữa gầy 10% - Chúng tơi sử dụng vi khuẩn sau đông khô để lên men thử nghiệm tạo sản phẩm thạch dừa từ vi khuẩn Acetobacter xylinum [1] Nguyễn Đức Lượng (2002), Công nghệ Vi sinh vật tập 2, Nhà xuất TP Hồ Chí Minh [2] Abadias M., Benabarre A., eixidoN T, Usall J., Vinas I (2001), “Effect of freeze drying and protectants on viability of the biocontrol yeast Candida sake”, International Journal of Food Microbiology, 65, pp 173–182 [3] Safronova V.I., Novikova N.I (1996), “Comparison of two methods for root nodule bacteria preservation: Lyophilization and liquid nitrogen –freezing”, Journal of Microbiological Methods, 24, pp 231 – 237 [4] Stefan Toegel, Sharareh Salar-Behzadi, Andrea Horaczek-Clausen, Helmut Viernstein (2010), “Preservation of aerial conidia and biomasses from entomopathogenic fungi Beauveria brongniartii and Metarhizium anisopliae during lyophilization”, Journal of Invertebrate Pathology, 105, pp.16–23 [5] Yukie Miyamoto-Shinohara, Junji Sukenobe, Takashi Imaizumi, Toro Nakahara (2006), “Survival curves for microbial species stored by freeze-drying”, Cryobiology, 52, pp 27 – 32 [6] Gabriela Zárate, María Elena Nader-Macias (2006), Viability and biological properties of probiotic vaginal lactobacilli after lyophilization and refrigerated storage into gelatin capsules, Process Biochemistry, 8, pp 1779–1785 [7] Stephanie Hessea, Tetsuo Kondo (2005), “Behavior of cellulose production of Acetobacter xylinum in 13C-enriched cultivation media including movements on nematic ordered cellulose templates”, Carbohydrate Polymers, 60, pp 457 – 465 (BBT nhận bài: 03/03/2014, phản biện xong: 31/03/2014)