NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC CAO CHIẾT TỪ LÁ VỐI VÀ THỬ NGHIỆM TẠO BỘT LÁ VỐI HÒA TAN

Ngơ Thái Bích Vân, Trần Thị Thu Hiền, Phan Thị Trâm Anh 44 NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CÁC CAO CHIẾT TỪ LÁ VỐI VÀ THỬ NGHIỆM TẠO BỘT LÁ VỐI HÒA TAN TO INVESTIGATE ANTIMICROBIAL ACTIVITY OF CRUDE EXTRACT OF CLEISTOCALYXOPERCULATUS LEAVES AND INITIALLY MAKE SOUBLE POWDER Ngơ Thái Bích Vân1*, Trần Thị Thu Hiền2, Phan Thị Trâm Anh3 Trường Đại học Bách khoa - Đại học Đà Nẵng Sinh viên lớp 16SH, Trường Đại học Bách khoa - Đại học Đà Nẵng Sinh viên lớp 15SH, Trường Đại học Bách khoa - Đại học Đà Nẵng Tác giả liên hệ: ntbvan@dut.udn.vn (Nhận bài: 28/10/2020; Chấp nhận đăng: 15/01/2021) * Tóm tắt - Nghiên cứu nhằm khảo sát khả kháng khuẩn cao chiết nước cao chiết ethanol từ vối (Cleistocalyx operculatus) thu hái Quảng Nam lên bốn chủng gây bệnh thường gặp Kết cho thấy cao etanol có hiệu ức chế vi khuẩn tốt cao nước, với giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) hai chủng vi khuẩn L monocytogenes, S aureus 0,4 mg/ml, E coli 1,6 mg/ml Salmonella sp 3,125 mg/ml Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) hai loại cao chiết khảo sát, cho thấy cao vối phơi khơ vối ủ có khả kiềm hãm phát triển chủng vi khuẩn thử nghiệm Đây cơng bố tính kháng khuẩn vối trồng Quảng Nam Ngoài ra, nhóm tác giả tạo bột vối hịa tan giữ màu xanh có khả kháng khuẩn cao Kết thử nghiệm sở khoa học cho việc tạo sản phẩm có hoạt tính sinh học từ vối Abstract - This study aimed to investigate the antibacterial ability of aqueous and ethanol extracts of the Robusta leaves (Cleistocalyx operculatus) collected in Quang Nam on four common pathogenic strains The results showed that ethanolic extract has higher effect than aqueous one, its minimum inhibitory concentration (MIC) on L monocytogenes, S aureus is 0.4 mg/ml, on E coli is 1.6 mg/ml and on Salmonella sp is 3.125 mg/ml The minimum bactericidal concentration (MBC) of these two extracts were also identified, showing that all the extracts of the dried and incubated leaves were able to inhibit the growth of the tested bacterial strains This is the first report about the antibacterial properties of the leaves grown in Quang Nam And we initially made the soluble powder which retains its green color and have antibacterial activity These results are the prerequisites for production of bioactive products from the Robusta leaves Từ khóa - Cao chiết; vối; kháng khuẩn; E coli; Staphylococcus aureus Key words – Extracts; Cleistocalyx operculatus; antibacterial activity; E coli; Staphylococcus aureus Đặt vấn đề Việc lạm dụng kháng sinh thời gian dài làm cho số lượng vi khuẩn đa kháng thuốc tăng cao Và kháng kháng sinh dòng vi khuẩn gây bệnh mối lo ngại lớn [1] Trong nhiều năm, thực vật công nhận nguồn tự nhiên hợp chất hoạt tính sinh học với tiềm đầy hứa hẹn việc điều trị bệnh nhiễm khuẩn Thực vật giàu chất chuyển hóa thứ cấp, nhiều chất phát có hoạt tính kháng khuẩn in vitro [2] Ở Việt Nam, đặc biệt khu vực miền Bắc Bắc Trung Bộ, vối (Cleistocalyx operculatus) trồng nhiều để lấy làm trà uống (thường gọi nước vối), phơi khô dùng làm thuốc trị rối loạn tiêu hóa làm thuốc chống nhiễm trùng da Nhiều nghiên cứu mơ hình tế bào (in vitro) hay chuột (in vivo) chứng minh vối có hoạt tính sinh học cao kháng ung thư, làm chậm phát triển khối u [3], có hiệu điều trị huyết áp hoạt động tim mạch [4] Theo nghiên cứu Buu TG cs, tinh dầu chiết xuất từ nụ vối có khả điều trị vết bỏng [5] Như vậy, nghiên cứu nước cho thấy hoạt tính sinh học hợp chất chiết xuất từ nụ vối Tuy nhiên, khả kháng lại vi khuẩn, đặc biệt chủng vi khuẩn Listeria monocytogenes (L monocytogenes) Staphylococcus aureus (S aureus) vối trồng khu vực Quảng Nam - Đà Nẵng chưa cơng bố Vì vậy, nghiên cứu này, nhóm tác giả tiến hành khảo sát khả kháng khuẩn xác định nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum inhibitory concentration – MIC), nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (minimum bacterial concentration – MBC) cao chiết vối sử dụng dung môi nước etanol chủng vi khuẩn S aureus, L monocytogenes, Escheria coli (E coli) Salmonella sp Bên cạnh đó, nhóm tác giả thử nghiệm qui trình tạo bột vối có khả tan tốt nước, vối làm lạnh 5ºC tốt để đem sản xuất thử nghiệm bột vối hòa tan Sau có sản phẩm tiếp tục đem thử hoạt tính sinh học Kết cho thấy, tất loại cao chiết bột vối hòa tan có họat tính kháng khuẩn chủng vi khuẩn nêu Vật liệu phương pháp 2.1 Vật liệu: 2.1.1 Lá vối Lá vối thu hái xã Điện an, huyện Điện Bàn, tỉnh Quảng Nam vào tháng 8-11/2019 The University of Danang - University of Science and Technology (Ngo Thai Bich Van) Student of class 16SH, The University of Danang - University of Science and Technology (Tran Thi Thu Hien) Student of class 15SH, The University of Danang - University of Science and Technology (Phan Thi Tram Anh) ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ - ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, VOL 19, NO 5.2, 2021 • Lá vối phơi khô (PK): Lá vối phơi nắng từ 2- ngày khơ giịn, lược bỏ cuống gân xay thành bột • Lá vối ủ: Lá vối ủ với rơm rạ đen đều, để xay thành bột 2.1.2 Chủng vi khuẩn Các chủng vi khuẩn sử dụng nghiên cứu gồm có: Salmonella sp, E coli, L monocytogenes S aureus cung cấp Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng (Quatest 2), ni cấy bảo quản phịng thí nghiệm mơn Cơng nghệ sinh học khoa Hóa -Trường Đại học Bách khoa - Đại học Đà Nẵng 2.1.3 Hóa chất Dung mơi ethanol tuyệt đối cung cấp công ty Chemsol (Việt Nam) Thuốc thử Resazurin (Sigma) 0,015%: Hòa tan 0,015g thuốc thử 100 ml nước cất hai lần, bảo quản 40C, tránh ánh sáng trực tiếp 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp thu nhận cao thô a Phương pháp thu nhận cao thô etanol Các bột phơi khô ủ ngâm dầm ethanol tuyệt đối (EtOH) với tỉ lệ 1:3 (w/v) Sau ngày, lọc thu dịch chiết Phần bột lại tiếp tục ngâm EtOH (2 lần, ngày/lần) Tất dịch chiết quay chân khơng 50 vịng/phút 500C để loại bỏ dung môi thu cao thô etanol Hiệu suất thu nhận cao tổng tính tỉ lệ % cao thu so với khối lượng khô mẫu b Phương pháp thu nhận cao nước Các bột phơi khô ủ ngâm dầm nước cất với tỉ lệ 1:50 (w/v) Sau ngày, lọc thu dịch chiết Phần bột lại tiếp tục ngâm nước cất (2 lần, ngày/lần) Tất dịch chiết cô quay chân không 50 vòng/phút 600C để loại bỏ thu cao nước 2.2.2 Phương pháp đục lỗ thạch Trải 100μl dịch vi khuẩn (nồng độ 10 CFU/ml) môi trường thạch Buffered Pepton Water (BPW) Nhỏ 50μl dịch cao chiết (50 mg/ml) vào lỗ thạch (đường kính mm) đĩa, ni 37 0C, 24 Kháng sinh Ampicillin (50mg/ml) sử dụng làm chứng dương, chứng âm dung môi Dimethyl sulfoxide (DMSO) cao etanol, nước cao nước Khả ức chế vi khuẩn cao chiết xác định cách đo đường kính vịng vơ khuẩn tạo xung quanh lỗ thạch 2.2.3 Phương pháp xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) cao chiết Trong thí nghiệm này, cao chiết pha loãng bậc từ nồng độ ban đầu 50 mg/ml nước (đối với cao nước) DMSO (đối với cao etanol) Dịch vi khuẩn nuôi cấy qua đêm pha loãng mật độ 106 CFU/ml Cho vào giếng gồm 50µl dịch vi khuẩn 50µl dịch cao chiết nồng độ pha loãng khác Các giếng đối chứng chứa dịch vi khuẩn môi trường Mỗi nghiệm thức lặp lại lần Ủ 370C, qua đêm Sau 24 giờ, thêm 30µl thuốc thử resazurin 0,015% cho vào giếng Ủ 370C quan sát đổi màu hỗn hợp 45 giếng Giá trị MIC nồng độ thấp dãy thử nghiệm cao chiết ức chế tăng trưởng vi khuẩn (giếng không làm đổi màu resazurin) [6] Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) xác định phương pháp trải đĩa: 100µl dịch thử nghiệm giếng khơng có đổi màu resazurin trải lên đĩa thạch chứa môi trường BPW ủ 37ºC, sau 24 quan sát việc tạo thành khuẩn lạc Giá trị MBC nồng độ thấp dãy nồng độ cao chiết tiêu diệt tồn vi khuẩn a) b) Hình Hình ảnh vịng kháng khuẩn cao etanol vối ủ (a) phơi khô (b) vi khuẩn S aureus 2.2.4 Phương pháp tạo bột hòa tan Để giữ màu xanh lá, nhóm tác giả thử nghiệm làm khô phương pháp khác nhau: (1) Lá sau thu hái, rửa làm khô nhiệt độ thấp (5 0C -200C); (2) Đông khô thiết bị đông khô Sau đó, nghiền mịn để thu bột Hịa tan bột nước ấm đánh giá độ hòa tan Khả kháng khuẩn bột kiểm tra phương pháp đục lỗ thạch Kết thảo luận 3.1 Hiệu suất thu hồi cao thô Theo qui trình nghiên cứu dược liệu Viện Ung thư quốc gia Hoa Kì (National Cancer Institute – NCI), lồi thực vật tách chiết cao thơ (hay gọi cao tổng) hai loại dung môi khác nước hỗn hợp methanol:diclorometan (1:1) Tuy nhiên, nghiên cứu này, nhóm tác giả sử dụng etanol dung mơi đánh giá an tồn cho sức khỏe mơi trường, đồng thời xem loại dung mơi tồn năng, tách chiết đa dạng hợp chất thực vật [7] Lá vối ngồi việc phơi khơ hãm lấy nước số địa phương, người dân thường ủ rơm rạ đen nấu nước uống Vì vậy, nhóm tác giả sử dụng hai loại phơi khô (PK) ủ (U) cho q trình chiết cao thơ hai dung môi nước, etanol tuyệt đối Bảng Hiệu suất thu hồi loại cao thô Mẫu bột Cao vối phơi khô Cao vối ủ Dung môi Nước Ethanol Nước Ethanol Hiệu suất (%) 10,8 2,3 16,7 2,1 Kết thu nhận cao thô cho thấy cao nước có hiệu suất thu hồi cao cao etanol (Bảng 1) trình ngâm dầm etanol bay cách đáng kể Ngô Thái Bích Vân, Trần Thị Thu Hiền, Phan Thị Trâm Anh 46 3.2 Kết khảo sát hoạt tính kháng khuẩn phương pháp đục lỗ thạch Trong nghiên cứu này, nhóm tác giả tiến hành khảo sát hai chủng Gram âm: E coli Salmonella sp, hai chủng Gram dương: L monocytogenes S aureus Đây vi khuẩn gây bệnh thường gặp tiêu chảy, ngộ độc thực phẩm, nhiễm trùng da, lở loét Để đánh giá khả kháng khuẩn loại cao chiết, nhóm tác giả sử dụng phương pháp đục lỗ thạch (Mục 2.2.2) Đường kính vịng vơ khuẩn tăng dần theo nồng độ cao thô (25mg/ml, 50mg/ml 100 mg/ml) (Hình 1) Kết cho thấy cao etanol phơi khơ có tác dụng kháng lại bốn chủng vi khuẩn thử nghiệm cao cao lại (Bảng 2) Và kết đường kính vịng kháng khuẩn S aureus cao so với chủng vi khuẩn khác Bảng Kết đường kính vịng vơ khuẩn (mm) loại cao chiết nồng độ 100 mg/ml Dung môi Chủng vi khuẩn E coli Lá Nước 9,7±0,6 phơi khô Etanol 10,7±0,6 Lá ủ L Salmonella S aureus monocytogen sp 10,0±0,0 8,7±0,6 11,3±0,6 12,0±0,0 12,0±0,0 12,3±0,6 9,3±0,6 9,3±0,6 10,3±0,6 11,0±0,0 Etanol 10,0±0,0 10,3±0,6 11,3±0,6 11,7±0,6 Nước 3.3 Kết xác định nồng độ ức chế tối thiểu cao chiết (MIC) Để so sánh đánh giá cụ thể tác động loại cao chiết chủng vi khuẩn thử nghiệm, nhóm tác giả tiến hành xác định giá trị MIC môi trường lỏng cách bổ sung chất thị màu Resazurin Sự đổi màu chất thị theo thời gian phụ thuộc vào hoạt động vi sinh vật Ban đầu, dung dịch Resazurin có màu xanh, bị khử enzyme tế bào vi khuẩn tạo thành resorufin, có màu hồng [6] Như vậy, vi khuẩn bị ức chế cao chiết, chúng khơng có khả làm đổi màu thuốc thử Ghi nhận nồng độ thấp cao chiết giếng khơng có chuyển màu dung dịch resazurin Giá trị MIC xác định ½ nồng độ ban đầu cao chiết giếng Đối với loại cao chiết nồng độ nhóm tác giả thử nghiệm hai giếng, chứng âm giếng không vi khuẩn (được giới hạn đường nét gạch Hình 2) Hình Kết xác định MIC cao chiết chủng vi khuẩn S aureus Giá trị MIC bốn loại cao chiết chủng vi khuẩn thử nghiệm trình bày Bảng Kết cho thấy, cao etanol có hoạt tính kháng khuẩn cao cao nước Tương tự kết thu từ phương pháp đục lỗ thạch, cao chiết vối có tác động kháng lại chủng Gram dương tốt Gram âm Điều lí giải dựa cấu tạo vi khuẩn Gram dương khơng có lớp màng lipopolysaccharide bên ngồi vi khuẩn Gram âm, hợp chất dễ dàng thấm qua màng tế bào ức chế vi khuẩn phát triển Bảng Giá trị MIC (mg/ml) loại cao chiết Dung môi Lá phơi Nước khô Etanol Nước Lá ủ Etanol Chủng vi khuẩn L Salmonella E coli S aureus monocytogen sp 3,125 3,125 6,25 3,125 1,6 0,4 3,125 0,4 6,25 6,25 6,25 6,25 0,8 0,4 1,6 0,4 3.4 Kết xác định nồng độ diệt khuẩn tối thiểu cao chiết (MBC) Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (MBC) nồng độ thấp cao chiết thực vật tiêu diệt toàn vi khuẩn giếng Việc xác định đồng thời hai giá trị MIC MBC cho thấy rõ tác động cao chiết lên sinh trưởng vi sinh vật Bảng Giá trị MBC (mg/ml) loại cao chiết Dung môi Chủng vi khuẩn L Salmonella E coli S aureus monocytogen sp 12,5 12,5 12,5 12,5 Lá phơi Nước khô Etanol 6,25 Nước 25 Lá ủ Etanol 3,125 0,8 12,5 0,8 6,25 25 3,125 0,8 12,5 0,8 Tương tự kết trước, nồng độ thấp (0,8 mg/ml), cao etanol phơi khô ủ tiêu diệt toàn vi khuẩn L monocytogenes S aureus Trong nghiên cứu Đào Thị Thanh Hiền cs (2003), tác giả chứng minh cao vối khơ vối ủ có tác động S aureus tốt E coli [8] Tính kháng khuẩn cao chiết vối S aureus, tụ cầu vàng gây bệnh nhiễm trùng da, công bố trước [9, 10] Tuy nhiên, giá trị MIC MBC cao chiết chưa xác định cụ thể Đặc biệt, tác động vối chủng Salmonella sp, L monocytogenes lần khảo sát nghiên cứu nhóm tác giả Đây chủng gây bệnh đường ruột thường gặp người Kết nghiên cứu làm sáng tỏ việc uống nước sắc vối để chữa bệnh tiêu chảy tắm nước vối để chữa viêm da dân gian 3.5 Thử nghiệm tạo bột vối hòa tan Người dân thường dùng vối phơi khô ủ lên men nấu nước uống Cách làm thời gian làm giảm hoạt tính sinh học vối Với mục tiêu hướng đến việc tạo sản phẩm từ vối, nghiên cứu này, nhóm tác giả thử nghiệm tạo bột vối hòa tan với yêu cầu giữ màu xanh không làm hoạt tính kháng khuẩn ISSN 1859-1531 - TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG, VOL 19, NO 5.2, 2021 Trong điều kiện thử nghiệm làm khơ (Mục 2.2.4), nhóm tác giả thấy rằng, vối làm lạnh 50C ngày giữ màu xanh bột sau xay có độ mịn 47 – hai chủng gây tỉ lệ nhiễm trùng cao bệnh viện Việc chiết tách hợp chất từ vối có tiềm tìm chất kháng sinh Bước đầu thử nghiệm cho thấy sấy lạnh phương pháp thích hợp để tạo bột vối hịa tan giữ hoạt tính kháng khuẩn Lời cảm ơn: Bài báo tài trợ Trường Đại học Bách khoa – Đại học Đà Nẵng với nghiên cứu có mã số: T2020-02-25 TÀI LIỆU THAM KHẢO a) b) Hình Hình ảnh vối làm khơ C (a) bột (b) 3.6 Kết kháng khuẩn bột Tiếp theo, nhóm tác giả cân lượng định bột hòa nước ấm tan hoàn toàn để đạt nồng độ 25 mg/ml, 50 mg/ml 100 mg/ml Khả ức chế vi khuẩn bột nồng độ khác đánh giá phương pháp khuếch tán đĩa thạch Kết cho thấy, bột vối hịa tan cịn giữ hoạt tính ức chế vi khuẩn (Bảng 5) Bảng Đường kính vịng vơ khuẩn (mm) bột vối Chủng vi khuẩn E coli L monocytogenes Salmonella sp S aureus 25 10 Nồng độ bột (mg/ml) 50 100 11 12 10 11 12 Kết luận Từ kết thu được, nhóm tác giả kết luận sau: - Các cao chiết từ vối sử dụng dung mơi nước etanol có khả ức chế phát triển chủng vi khuẩn thử nghiệm Trong đó, cao etanol có hoạt tính kháng vi khuẩn tốt cao nước - Các vi khuẩn Gram dương nhạy với cao chiết vối so với Gram âm Kết nghiên cứu tiền đề cho nghiên cứu sâu chế kháng khuẩn vối, đặc biệt S aureus [1] Lương TMN, Lê TKL, Nguyễn TTL, Nguyễn NQ, Lê TTL, Trương THH, Trần TH, “Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn cao chiết hoa dâm bụt Hibiscus rosa – sinensis l lên Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa Klebsiella pneumoniae”, Tạp chí Phát triển Khoa học & Cơng nghệ: chuyên san khoa học tự nhiên, tập 2, số 1, 2018, trang 19-26 [2] Trần MN, Đoàn CS, Phạm TA, Đỗ PTT, “Nghiên cứu tác dụng chống oxy hóa nụ vối (Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr et Perry Myrtaceae)”, Tạp chí Dược học số 422, 2011, trang 35-38 [3] Huang H, Niu J, Lu Y, Hua Y, “Multidrug resistance reversal effect of DMC derived from buds of Cleistocalyx operculatus in human hepatocellular tumor xenograft model”, Journal of the Science of Food and Agriculture 92(1), 2012, p135-140 [4] Trương TM, Fumie N, Nguyen VC, “Antioxidant activities and hypolipidemic effects of an aqueous extract from flower buds of Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr and Perry”, Journal of Food Biochemistry 33(6), 2009, p790-807 [5] Tran GB, Le TNT, Dam SM, “Potential use of essential oil isolated from Cleistocalyx operculatus leaves as a topical dermatological agent for treatment of burn wound”, Dermatology Research and Practice, 2018 March 5, p1-8 [6] Mohamed E, Syed A, Scott F, Paul D, Mark MG, Roger M, and Ibrahim MB, “Resazurin-based 96-well plate microdilution method for the determination of minimum inhibitory concentration of biosurfactants”, Biotechnology letter 38, 2016, p1015- 1019 [7] Azwanida NN, “A Review on the Extraction Methods Use in Medicinal Plants, Principle, Strength and Limitation”, Medicinal & Aromatic Plants 4(3), 2015, doi:10.4172/2167-0412.1000196 [8] Đào TTH, Phạm KT, Lê MH, “Nghiên cứu số tác dụng sinh học vối”, Tạp chí Dược học (3), 2003, p 22-23 [9] Nguyen TD, Kim MJ, Kang SC, Anti-inflammatory effects of essential oil isolated from the buds of Cleistocalyx operculatus (Roxb.) Merr and Perry, 2008, https://doi.org/10.1016/j.fct.2008.11.033 [10] Nguyen, PTM, Schultze, N, Boger, C, Alresley, Z, Bolhuis, A & Lindequist, U, “Anticaries and antimicrobial activities of methanolic extract from leaves of Cleistocalyx operculatus L.”, Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, 7(1), 2017, p 43-48