NGHIÊN CỨU BƯỚC ĐẦU VỀ BỆNH ĐỐM TRẮNG NỘI TẠNG Ở CÁ CHIM VÂY VÀNG (Trachinotus blochii) NUÔI Ở NHA TRANG

NGHIÊN CỨU BƯỚC ĐẦU VỀ BỆNH ĐỐM TRẮNG NỘI TẠNG Ở CÁ CHIM VÂY VÀNG (Trachinotus blochii) NUÔI Ở NHA TRANG PRELIMINATY STUDY OF WHITE SPOT DISEASE IN INTERNAL ORGANS IN SNUBNOSE POMPANO (Trachinotus blochii) Nguyễn Thị Thùy Giang*, Dương Văn Q Bình Đỗ Thị Hịa * Đại học Nha Trang - Email: nguyenthuygiang2007@gmail.com ABSTRACT In 2010, in cage-cultured snub-nose pompano (Trachinotus blochii) in Nha Trang Bay, a novel disease caused high mortalities at sizes 8-14cm Small pimples which were developed to grey ulcerative spots on skin and tumors along the spine were found in diseased fish Mucus, abscess and small white nodules appeared in the gill Swollen kidney, spleen and liver with white nodules were observed From 47 diseased fish, a Nocardia like bacterium was successfully isolated on Ogawa medium after 7-10 days in 26-280C with white, dry and creasy colonies The bacterium was about 2-10, branched, fragmented, Gram positive and acid fast Histopathological observation presented lesions in kidney, spleen, liver, muscle and the spinal column Development of tumors caused deformation of the spinal cells In vivo challenge experiments and TEM proved that the Nocardia like bacterium was related to the internal organ white spot disease in snub-nose pompano This was the first report in Viet Nam that Nocardia sp was the pathogen in cultured marine fish ĐẶT VẤN ĐỀ Cá chim vây vàng (Trachinotus blochii) loài cá biển tiến hành sinh sản nhân tạo ương nuôi Vũng Ngán, thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa Năm 2010, bệnh đốm trắng nội tạng xuất gây chết nhiều cá có kích thước từ -14cm, nuôi lồng bè biển Cá bị bệnh thể dấu hiệu như: có nốt phồng rộp nhỏ da, vỡ tạo nên vết loét nhỏ màu xám, có khối u làm dọc cột sống làm thể cá cong vẹo, dị dạng, bụng cá phình cứng Các u hạt màu trắng xám quan sát thấy số quan cá như: mang, gan, thận lách Các biến đổi bệnh lý tổ chức quan cá bệnh tác nhân gây bệnh trình bày mơ tả báo cáo VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Thu mẫu cá 47 cá chim vây vàng (kích thước từ 7-14cm ) bị bệnh có biểu hiện: có nốt phồng rộp nhỏ da, vỡ tạo nên vết loét nhỏ màu xám, có khối u làm dọc cột sống làm thể cá cong vẹo, dị dạng, bụng cá phình cứng 10 cá khơng có dấu hiệu bệnh, thu túi riêng biệt, có sục khí để đảm bảo mẫu cá cịn sống chuyển phịng thí nghiệm Các phương pháp nghiên cứu sử dụng Phương pháp mô bệnh học Để nghiên cứu biến đổi bệnh lý mô tế bào tổ chức cá bệnh, phương pháp mô bệnh ứng dụng cho nghiên cứu cá xương giới thiệu Tonguthai & CTV (1999) sử dụng nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu bệnh vi khuẩn Phương pháp nghiên cứu bệnh vi khuẩn cá Whitman (2004) dùng để phân lập, định dạng xác định vai trò vi khuẩn việc gây bệnh đốm trắng nội tạng cá chim vây vàng 427 Làm nhuộm tiêu phết mô từ nôi tạng cá bệnh cá khỏe Sát trùng bề mặt thể cá miếng bơng thấm cồn etylic 70%, sau sử dụng kéo vô trùng để giải phẫu cá tách nội tạng mang, não, gan, lách, thận Dùng kéo panh vô trùng để cắt kẹp miếng nhỏ mơ từ tổ chức có bộc lộ u hạt màu trắng; phết mô cắt mặt lam chứa giọt nước muối sinh lý vô trùng (0,85%) để tạo vết bôi để tiêu khơ khơng khí Các tiêu cố định đèn cồn trước đưa vào nhuộm Phương pháp nhuộm Gram Các tiêu có chứa vết bơi từ mơ cá bệnh nhuộm tím crystal fuchsin, cố định lugol làm màu tím crystal dung dịch cồn-aceton Cuối cùng, tiêu rửa nước chảy nhẹ, để khơ tự nhiên quan sát kính hiển vi quang học độ phóng đại 1000 lần dầu để phát tồn vi khuẩn mơ, quan sát hình dạng màu sắc vi khuẩn sau nhuộm Gram: vi khuẩn Gram (+) có màu tím vi khuẩn Gram (-) có màu hồng Phương pháp nhuộm Ziehl- Neelsen Phương pháp nhuộm Ziehl-Neelsen sử dụng để nhận biết vi khuẩn kháng acid (acid fast) có mặt tổ chức mô cá bệnh Các bước tiến hành sau: dung dịch carbol fuchsin (0,03g fuchsin pha 10ml etylic 95%, bổ sung thêm 5g phenol 95ml nước cất) nhỏ tràn bề mặt vết bôi tiêu phết mô tiêu hơ nóng lửa đèn cồn để nước bốc 10 phút Tiếp theo, tiêu rửa nhẹ nhàng với nước trước làm màu acid acetic 0,5% 20-30 giây Sau đó, tiêu phết nhuộm Methylene blue 60 giây, rửa nhẹ nước cuối để khô Tiêu nhuộm Ziehl-Neelsen quan sát kính hiển vi quang học độ phóng đại 1000x dầu, chất tổ chức vật chủ bắt màu xanh lam nhạt methylene blue, khuẩn lạc hay đám tế bào vi khuẩn kháng acid bắt mầu hồng tím Fuchsine Phân lập vi khuẩn từ mô cá bệnh Chuẩn bị môi trường dùng cho phân lập vi khuẩn Dựa vào kết quan sát tiêu phết từ mơ cá bệnh kính hiển vi quang học để chọn loại môi trường dùng cho phân lập Để phân lập vi khuẩn từ cá bệnh, hai môi trường giàu dinh dưỡng không chọn lọc như: TSA (Tryp Soy Agar) NA (Nutrient Agar) sử dụng Đồng thời, sử dụng mơi trường có tính tính chọn lọc vi khuẩn cao môi trường Ogawa dùng để phân lập vi khuẩn kháng acid môi trường TCBS (Thiosulphate Citrate Bilesalt Sucrose) dùng để phân lập vi khuẩn Vibrio Các môi trường dinh dưỡng tổng hợp có bán sẵn thị trường pha chế hướng dẫn nhà sản xuất ghi nhãn mác chai đựng môi trường Riêng môi trường Ogawa pha chế phường pháp thủ công Môi trường Ogawa gồm thành phần sau Dung dịch muối khoáng: 3g Kali - dihydrophosphate (KH2PO4); 3g Sodium glutamate, 6g NaCl hòa tan 300ml nước cất Dung dịch hấp tiệt trùng nhiệt độ 121oC, thời gian 30 phút Dung dịch malachite green, 2%: Hòa tan 2g bột Malachite green với 100ml nước cất tiệt trùng, đựng dụng cụ thủy tinh vô trùng đặt vào tủ ấm Trứng: Trứng gà đẻ (không ngày từ đẻ) làm bên bằng xà phòng, ngâm tiếp dung dịch xà phòng 30 phút, rửa nước ngâm 428 cồn etanol 70% 15 phút Trứng làm sạch, làm vỡ dao vô trùng, cho dịch trứng vào dụng cụ vô trùng, trộn trứng dụng cụ khuấy vô trùng Trộn 300 ml dung dịch muối khoáng, 18ml dung dịch malachite green 2%, 600 ml trứng gà 18ml glycerol Điều chỉnh pH hỗn hợp 6,8, sau phân phối mơi trường vào ống nghiệm tiệt trùng (6-8 ml/ống) Để ống nghiệm nghiêng góc 450 (tạo mặt nghiêng) làm đơng mơi trường ống nghiệm cách đặt vào tủ sấy nhiệt độ 80 oC – 85oC thời gian 45 phút Khi môi trường rắn lại có màu xanh chuối non Phân lập vi khuẩn từ cá bệnh Bệnh phẩm thu từ gan, thận, lách mang cá bệnh cấy đĩa lồng chứa môi trường phân lập TSA (hoặc NA) TCBS, phần mặt nghiêng môi trường trứng Ogawa ống nghiệm Các đĩa lồng sau cấy ủ nhiệt độ 26 – 28 oC Quan sát xuất khuẩn lạc đĩa ống nuôi cấy lần/ngày Các chủng tách từ khuẩn lạc rời môi trường TSA, NA TCBS sau ủ nhiệt độ 280C 24h Trong đó, chủng vi khuẩn tách từ môi trường Ogawwa sau ủ nhiệt độ 28 0C - 10 ngày Khi khuẩn lạc xuất ống nghiệm chứa chủng thuần, tiêu ép tươi, nhuộm Gram nhuộm Ziehl-Neelsen thực để kiểm tra hình dạng, cách xếp cách bắt màu vi khuẩn Các phản ứng sinh hóa sử dụng để xác định khả oxy hóa lên men (OF), khả lên men đường lactose, glucose, khả sinh sinh H2S (KIA), khả di động, phản ứng catalase, oxidase, nitrat khả lên men loại đường khác như: arabinose, sucrose, galactose, manose, maltose… Các kết sử dụng làm sở cho việc định danh vi khuẩn theo hệ thống phân loại Bergey trình bày Holt, J.G & CS (1994) Quan sát chủng vi khuẩn kháng acid từ cá bệnh kính hiển vi điện tử Để hỗ trợ cho việc định danh vi khuẩn tác nhân gây bệnh, mẫu mô thận lách cá bệnh cố định dung dịch Glutaraldehyde với tỷ lệ thể tích 1/10 (mẫu/dung dịch cố định), giữ đá khô quan sát kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương, Hà Nội Thí nghiệm cảm nhiễm điều kiện in vivo để xác định tác nhân gây bệnh Sử dụng chủng vi khuẩn phân lập cá bệnh với tần xuất gặp cao (VKCVV01 VKCVV02), thí nghiệm cảm nhiễm vào cá khỏe thực trại thực nghiệm phường Vĩnh Hòa, Nha Trang Các vật liệu dùng cho thí nghiệm Chủng vi khuẩn nghi ngờ VKCVV01: trực khuẩn ngắn (1-2 µm), tròn đầu, Gr (-), phát triển nhầy mạnh xung quanh khuẩn lạc hình trịn mơi trường TSA NA, khuẩn lạc có màu vàng TCBS bắt gặp với tỷ lệ cao cá bị bệnh (30/47 cá bệnh), đặc biệt bệnh phẩm lấy từ mang cá bệnh Chủng vi khuẩn nghi ngờ VKCVV02: trực khuẩn dài (2 – 10µm), phân nhánh, gẫy đốt, Gr (+), vi khuẩn kháng acid, phân lập môi trường Ogawa tìm thấy 100% tiêu (47/47 cá bệnh) phết từ mô nội tạng (lách, gan, thận, mang gần khối u cột sống), không tìm thấy phân lập chủng vi khuẩn cá khỏe (n=10 con) sử dụng nghiên cứu Cá dùng cho thí nghiệm cảm nhiễm: Cá chim vây vàng (có chiều dài 8-10cm) mua từ Trại Thực nghiệm Khoa Nuôi trồng Thủy sản, Trường Đại học Nha Trang Các cá hoàn toàn khỏe mạnh, không bộc lộ dấu hiệu bệnh lý thể cá Năm cá giải phẫu để kiểm tra bệnh lý tìm vị trí an tồn để tiêm huyền dịch vi 429 khuẩn vào ổ bụng cá Cá đưa sở thực nghiệm tuần trước thí nghiệm bắt đầu Tạo huyền dịch vi khuẩn dùng để tiêm cho cá: Lấy số khuẩn lạc mọc mặt nghiêng ống nghiệm chứa chủng thuần, đưa vào nước muối sinh lý (0,85% NaCl) vô trùng để tạo huyền dịch có độ đục khác So độ đục với ống đục chuẩn MacFaland để tạo ống chứa huyền dịch với mật độ vi khuẩn khác theo mục đích thí nghiệm Giữ ống chứa huyền dịch nhiệt độ 0C sử dụng để tiêm cho cá khỏe Ngoài ra, mật độ huyền dịch kiểm tra lại phương pháp gián tiếp, pha lỗng ni cấy đĩa thạch Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn nghi ngờ vào cá khỏe Thí nghiệm 1: Hai chủng VKCVV01 VKCVV02 với mật độ 106 cfu/ml, cảm nhiễm riêng rẽ vào cá khỏe cách tiêm vào xoang bụng cá với liều 0,1 ml/con; cá nghiệm thức đối chứng tiêm nước mối sinh lý vơ trùng (0,1ml/con) Thí nghiệm thực thùng nhựa 120 lít (10 cá/thùng), lặp lại đồng thời lần, sục khí liên tục, thay nước đồng loạt 30% thấy nước đục Sức khỏe cá, dấu hiệu bệnh lý, tỷ lệ cá chết số yếu tố môi trường nhiệt độ, pH độ mặn theo dõi hàng ngày Những cá bị bệnh hấp hối thu để kiểm tra bệnh lý, làm tiêu mô bệnh học, phết nội tạng phân lập vi khuẩn trình bày mục trước Thí nghiệm 2: Thí nghiệm xác định chủng vi khuẩn VKCVV02 tác nhân gây bệnh đốm trắng nội tạng cá chim vây vàng Do đó, để khẳng định VKCVV02 tác nhân gây bệnh cá chim vây vàng theo nguyên tắc Korch xác định tính độc chủng vi khuẩn thơng qua số LD50%, thí nghiệm cảm nhiễm thứ thực Theo đó, 0,1ml huyền dịch chủng VKCVV02 tiêm vào cá khỏe với mật độ khác nhau: 10 4, 105, 106, 10 108 tb/ml (xác định mật độ phương pháp MacFaland) Tuy nhiên, sau kiểm tra lại phương pháp nuôi cấy đĩa thạch, mật độ huyển dịch nghiệm thức xác định lại là: NT1: 0,98 x 10 4; NT2:1,02 x 105; NT3: 1,10 x 106 ; NT4: 0,85 x 10 NT5: 0,97 x 10 cfu/ml Ở nghiệm thức đối chứng (ĐC), 0,1 ml nước mối sinh lý vô trùng tiêm vào xoang bụng cá Phương pháp tiêm huyền dịch vi khuẩn vào cá, chăm sóc, theo dõi, thu mẫu phân tích mẫu cá bệnh thí nghiệm thực tương tự trình bày thí nghiệm Thí nghiệm lặp lại lúc 02 lần Chỉ số LD50 xác định theo công thức Reed Muench (1938): LD50= ax-pd, đó: x nồng độ vi khuẩn thấp gây chết cá 50%; a bậc pha loãng liều vi khuẩn (trong thí nghiệm a=10); pd (hiệu số hiệu chỉnh)= [L (tỷ lệ % cá chết thấp > 50%) – 50] / [L (tỷ lệ % cá chết thấp > 50%) – H (tỷ lệ % cá chết cao nhất< 50%)] KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN Các dấu hiệu bệnh quan sát Quan sát bên thể bên ổ bụng cá bệnh phát nhiều dấu hiệu đặc trưng cho bệnh cá chim vây vàng Trên bề mặt thể cá bệnh xuất nhiều nốt phồng rộp nhỏ da, nốt phồng vỡ tạo nên thương tổn mầu xám, nhỏ (hình 1a) Mang cá bệnh tiết nhiều dịch nhầy, làm tơ mang dính bết vào nhau, vài thương tổn hoại tử quan sát thấy mang số cá bệnh (hình 1b) Dọc theo cột sống số bị bệnh có hay nhiều khối u nằm dọc cột sống, khối u có kích thước lớn làm thể cong gập, dị dạng (hình 1c & d) Khi giải phẫu cá bệnh, đốm trắng nhỏ quan sát thấy số nội tạng thận, gan lách (hình 2) 430 Các biến đổi bệnh lý mơ tế bào cá bệnh Sự thối hóa từ nhẹ đến nặng kết hợp với thương tổn dạng u hạt thay cho mô mềm quan sát tổ chức nội tạng gan, thận, lách cá bệnh làm biến dạng cấu trúc mô tổ chức Các vật chất hữu bị hoại tử nằm vùng trung tâm u hạt xung quanh u hạt bao bọc vách dày tạo lớp tế bào biểu mô dẹt Khi quan sát độ phóng đại > 400 lần, vi khuẩn dạng hình que phát vùng trung tâm khối u đại thực bào quan sát thấy tập trung xung quanh u hạt (hình 3và 4) Riêng u xương dọc cột sống, thương tổn dạng u hạt có kích thước lớn so với u hạt mô mềm thận, lách, gan và gây tác động chèn ép làm biến dạng, méo mó tế bào xương tạo nên khối u xương dọc cột sống (hình 5) Hình 1: Các dấu hiệu bên cá chim vây vàng bị bệnh đốm trắng nội tạng a Các nốt phồng rộp da (mũi tên nhỏ) vết loét nhỏ màu xám (mũi tên lớn) b Mang cá bệnh bị tiết nhiều dịch nhầy có u hạt trắng (mũi tên đen) c & d Khối u (mũi tên) nằm cột sống làm cá bệnh cong vẹo, dị dạng Hình Các dấu hiệu thể nội tạng cá chim vây vàng bị bệnh a & b Nhiều u hạt nhỏ, màu trắngxuất gan cá bệnh c Nhiều u hạt màu trắng, nhỏ xuất lách cá bệnh, làm tổ chức sưng to bình thường 431 Hình 3: Biến đổi bệnh lý lách cá chim vây vàng bị bệnh đốm trắng nội tạng a Mô học lách cá khỏe (nhuộm với H&E, độ phóng đại 400x) b Nhiều thương tổn dạng u hạt tồn tổ chức lách cá bệnh (nhuộm với H&E, 100x) c Các thương tổn dạng u hạt tồn nhiều tổ chức lách cá bệnh (nhuộm với H&E, 400x) Hình 4: Biến đổi bệnh lý thận cá chim vây vàng bị bệnh đốm trắng nội tạng a Mô thận cá chim vây vàng khỏe (nhuộm với H&E, 400x) b Mô thận cá bệnh với nhiều vùng thương tổn dạng u hạt (nhuộm với H&E, 100x) c Các thương tổn dạng u hạt đặc thù gặp mô thận với tập trung đại thực bào xung quanh u hạt vi khuẩn dạng que trung tâm (nhuộm với H&E, 400x) Hình 5: Biến đổi bệnh lý xương sống cá bệnh, nơi xuất khối u (với H&E) a Khối u xương sống cá chim vây vàng bị bệnh (luộc chín, gỡ thịt) b Mô xương sống cá khỏe (400x), c Thương tổn dạng u hạt bắt màu tím thuốc nhuộm hematoxylin chiếm chỗ mô xương, chèn ép, dồn nén làm biến dạng tế bào xương (Mũi tên màu đen khối u hạt, mũi tên màu trắng mô xương)(400x) 432 Phát vi khuẩn tiêu phết mơ cá bị bệnh Hình Trực khuẩn mảnh, phân nhánh, có gẫy thành đốt, Gram (+) kháng acid (có mầu hồng Fuchsin nhuộm Ziehl-Neelsen có mầu tím xanh nhuộm Gram) phát tiêu phết mô từ cá bị bệnh - a,b,c: tiêu phết mô não, bề mặt khối u, lách thận cá bệnh nhuộm Gram - e, f, g: tiêu phết mơ trình bày nhuộm Ziehl-Neelsen, mơ cá có màu xanh methylen blue, tế bào vi khuẩn có mầu hồng fuchin Các tiêu phết làm từ mô mang, vùng da bị phồng rộp, gan, thận, lách não cá chim vây vàng bị bệnh đốm trắng nội tạng, nhuộm phương pháp: Gram Ziehl-Neelsen Dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại 1000 lần, loại vi khuẩn dạng que, phân nhánh, số nhánh gẫy thành đoạn ngắn, dài từ 2- 10µm, Gram (+) kháng acid phát phổ biến hầu hết tiêu phết mô gan thận, lách… từ cá bị bệnh Tuy nhiên hồn tồn khơng phát loài vi khuẩn tiêu phết mô làm từ cá khỏe Kết quan sát thể rằng, cá chim vây vàng bị đốm trắng nội tạng bị nhiễm vi khuẩn hệ thống (nhiễm tồn thân) Ngồi lồi vi khuẩn mơ tả trên, số tiêu phết phát số trực khuẩn Gram (-), ngắn 1-2 µm nhiễm mô mang nội tạng số cá bệnh (hình 6) Kết phân lập vi khuẩn từ cá bệnh Hình Kết phân lập vi khuẩn từ cá bị bệnh - VKCVV02: Khuẩn lạc (a), tế bào nhuộm Ziehl-Neelsen (b) nhuộm Gram (c) chủng vi khuẩn phân lập môi trường Ogawa - VKCVV01: Khuẩn lạc (d) tế bào nhuộm Gram (e) chủng vi khuẩn sinh nhầy phân lập TSA, NA TCBS từ cá bệnh 433 Bệnh phẩm lấy từ mang, gan, thận lách cá bệnh nuôi cấy phân lập môi trường dinh dưỡng: TSA NA (2% NaCl), môi trường Ogawa (2% NaCl) TCBS Sau 24h ủ mẫu nhiệt độ 280C, xuất nhiều khuẩn lạc trịn, trắng sinh nhầy mọc mơi trường TSA NA; khuẩn lạc trịn, lồi, có màu vàng TCBS Kiểm tra tiêu ép nhuộm Gram phát trực khuẩn ngắn, kích thước từ 1-2 µm, Gram (-), vi khuẩn khơng bắt mầu hồng nhuộm Ziehl-Neelsen ký hiệu VKCVV01 (hình d & e) Trên mặt nghiêng ống nghiệm chứa môi trường Ogawa, khuẩn lạc màu trắng phấn, khô nhăn nheo bề mặt mọc dày sau -10 ngày nuôi cấy nhiệt độ 2628 0C Từ khuẩn lạc này, tiêu nhuộm Gram nhuộm Ziehl-Neelsen thực Dưới kính hiển vi quang học (phóng đại 400-1000 lần) xác định loại trực khuẩn dài 2- 10µm, phân nhánh, số nhánh bị gẫy để tạo nên đoạn ngắn, Gram (+) kháng acid phát phổ biến mô nội tạng cá bệnh Loại vi khuẩn hồn tồn khơng phát triển mơi trường dinh dưỡng NA, TSA TCBS Điều chứng tỏ chúng phân lập thành công môi trường Ogawa Chủng vi khuẩn hồn tồn khơng phân lập từ mẫu cá khỏe ký hiệu VKCVV02 (hình a,b c) Bằng phương pháp vi sinh vật học truyền thống, dựa vào đặc điểm hình dạng, cấu tạo sinh hóa, chủng vi khuẩn VKCVV01 xác định loài Vibrio alginolyticus, lồi thơng báo tác nhân gây bệnh tôm cá biển (Liu, C.H & CS, 2004) Chủng vi khuẩn VKCVV02 thể số đặc điểm giống vi khuẩn Nocardia, thuộc nhóm 22, Nocadioform Actinomycetes, hệ thống phân loại Bergey như: trực khuẩn dài, mảnh, phân nhánh, số nhánh tồn tự khơng khí bị gẫy thành nhiều đoạn, Gram dương, kháng acid; khuẩn lạc màu trắng phấn, khô, nhăn nheo bề mặt, mọc chậm mơi trường đặc thù Ogawa (có 2% NaCl), khoảng từ ngày nuôi cấy thứ -7 nhiệt độ 26-280C phát rõ khuẩn lạc (hình 7a khuẩn lạc quan sát ngày ni cấy thứ 10) Một số đặc điểm sinh hóa chủng VKCVV02 xác định như: Catalase (+), Cytochrom oxydase (-), O/F (-/-), sinh (-), sinh H2S (-), khơng di động, Nitrate (+) ngồi khả lên men glucose (+) cịn lại âm tính (-) với hàng loạt loại đường khác như: Lactose, Mannitol, Maltose, Mannose Galactose Với đặc điểm hình thái sinh hóa nêu trên, chủng VKCV02 cho tương tự loài Nocardia sp., viết tắt NLB (Nocardia Like Bacteria) Cảm nhiễm chủng vi khuẩn phân lập vào cá khỏe Cảm nhiễm VKCVV01 (Vibrio alginolyticus) VKCVV02 (NLB ) vào cá khỏe 0,1 ml huyền dịch có mật độ 106 tế bào/ml chủng vi khuẩn nói tiêm vào ổ bụng, vị trí trước vây bụng cá khỏe (cỡ 8-10cm); cá nghiệm thức đối chứng tiêm 0,1 ml nước muối sinh lý (0,85%) Thí nghiệm tiến hành điều kiện nhiệt độ 28-29 oC, pH 7,8–8,0, độ mặn 30 o/oo Bố trí thí nghiệm trình bày phần phương pháp nghiên cứu kết thể hình Sau 14 ngày thí nghiệm, tượng cá chết khơng xảy nghiệm thức đối chứng nghiệm thức tiêm V alginolyticus Tuy nhiên, tượng cá chết với dấu hiệu bệnh đặc thù bệnh đốm trắng nội tạng quan sát thấy nghiệm thức tiêm VKCVV02 (NLB), bắt đầu vào ngày thứ 11 chết 100% vào ngày thứ 14 Kết thí nghiệm xác định chủng VKCVV02 (NLB) tác nhân gây bệnh đốm trắng nội tạng cá chim vây vàng 434 Tỷ lệ cá chết tích lũy sau cảm nhiễm (%) 120 ĐC 100 VKCVV01 80 VKCVV02 60 40 20 10 11 12 13 14 Ngày sau cảm nh iễm Hình Tỷ lệ chết tích lũy (%) cá thí nghiệm cảm nhiễm - VKCVV01: Vibrio alginotylicus - VKCVV02: Nocardia Like Bacteria (NLB) Cảm nhiễm VKCVV02 với liều khác vào cá khỏe Ở thí nghiệm thứ 2, vi khuẩn NLB cảm nhiễm vào cá chim vây vàng khỏe với liều khác nhau: 0,1ml huyền dịch vi khuẩn NLB mật độ khác (NT1: 10 4; NT2: 10 5; NT3: 10 ; NT4: 10 NT5: 10 tế bào/ ml) tiêm vào ổ bụng cá khỏe, 0,1ml nước muối sinh lý vô trùng tiêm cho cá nghiệm thức đối chứng (ĐC) theo phương pháp trình bày phần phương pháp nghiên cứu Thí nghiệm thực điều kiện: 24-26oC, pH: 7,4–7.8 độ mặn: 28– 30 ppt Tỷ lệ chết tích lũy cá sau cảm nhiễm (%) Kết hình thể hiện, cá bị cảm nhiễm vi khuẩn NLB với liều cao cá bị chết sớm đạt tỷ lệ chết 100% nhanh Cá nghiệm thức NT2, NT3, NT4 NT5 bắt đầu chết vào ngày thứ sau cảm nhiễm chết 100% theo thứ tự vào ngày thứ 12, 11, 10 Cá NT1, bắt đầu chết vào ngày thứ chết 100% vào ngày thứ 13 Chỉ số gây chết 50% LD50 vi khuẩn xác định sau ngày cảm nhiễm là: 1,78 x 10 Cá chim vây vàng bị bệnh sau cảm nhiễm thí nghiệm bộc lộ rõ số dấu hiệu đặc thù bệnh đốm trắng nội tạng trình bày (hình 1) 120 100 NT1 80 NT2 NT3 60 NT4 NT5 40 ĐC 20 10 11 12 13 Ngày sau cảm nhiễm Hình Tỷ lệ chết tích lũy (%) cá bị cảm nhiễm chủng NLB liều lượng vi khuẩn VKCVV02 khác Thảo luận Với dấu hiệu bệnh đốm trắng nội tạng cá chim vây vàng (hình 1&2), biến đổi bệnh lý mô tế bào tổ chức quan cá bệnh (hình 3,4 & 5) việc phát số lượng lớn vi khuẩn dạng hình que, Gram (+), kháng acid, phân nhánh gẫy đốt 435 tiêu phết mơ cá bệnh (hình 6) chứng tỏ rằng: mẫu cá bệnh bị bệnh nhiễm trùng hệ thống thương tổn nặng nề mô nội tạng gan, thận lách nguyên nhân gây chết cho cá bệnh Đã có nhiều cơng trình cơng bố tác giả nước loại bệnh khác cá xương có chung dấu hiệu bệnh lý u hạt trắng xuất hay nội tạng cá bệnh thương tổn dạng u hạt thể tiêu mơ bệnh học Ví dụ bệnh mủ gan thận cá tra nuôi đồng sông Cửu Long vi khuẩn Edwardsiella ictaluri (Crumlish M.& CS, 2002; Nguyễn Quốc Thịnh & CS, 2004) Bệnh Photobacteriosis vi khuẩn Photobacterium damsela gây cá cobia nuôi Đài Loan với đốm trắng dạng hạt nằm thận, lách hay gan cá bệnh (Liu & CS 2003) Bệnh Nocardiosis nhiễm vi khuẩn Nocardia spp có dạng hình que, phân nhánh, Gram dương, kháng acid, thơng báo gây bệnh lồi cá chim vây vàng (Trachinotus blochii) nhiều loài cá biển khác cá hồng (Lutjanus spp.), cá rô phi (Oreochromis sp.), cá mú (Epinephelus spp) Malaysia, Trung Quốc Singapore (Labrie & CS, 2008), cá Lateolabrax japonicus Đài Loan (Chen & CS, 2000; Shimahara & CS, 2009), cá đuôi vàng (Seriola quinqueradiala) nuôi Nhật (Kudo & CS, 1988; Itano & CS, 2002; Shimahara & CS, 2005), cá Larimichthys crocea (Wang & CS, 2005) cá lóc (Ophiocephalus argus) (Wang & CS, 2007) Ngồi ra, biến đổi mơ bệnh học tổ chức nội tạng cá bệnh có dạng u hạt phát nhiều lồi cá ni bị nhiễm bệnh Mycobacteriosis vi khuẩn Mycobacterium spp., vi khuẩn Gram (+) kháng acid Một số đặc điểm hình thái, sinh vật hóa học vi khuẩn VKCVV02 thể tương đồng với loài thuộc giống Nocardia spp Do vậy, chủng VKCVV02 định danh loài tương tự Nocardia, viết tắt NLB Tuy nhiên, để phân loại xác cần phải làm thêm số đặc điểm sinh hóa khác xác định hàm lượng acid mycolic, phản ứng hypoxanthine, phản ứng testosterone kháng Lysozyme… Mặc dù cần tiến hành nghiên cứu sâu để xác định đến loài vi khuẩn gây bệnh đốm trắng nội tạng cá chim vây vàng ni Khánh Hịa, kết thu từ hai thí nghiệm cảm nhiễm ngược chứng minh rằng, loại vi khuẩn tương tự Nocardia (NLB) tác nhân gây bệnh đốm trắng nội tạng cá chim vây vàng Đây nghiên cứu bước đầu bệnh xảy đối tượng cá nuôi nhập vào Việt Nam vài năm gần báo cáo phân lập loại vi khuẩn tương tự Nocardia từ cá biển nuôi bị bệnh Việt Nam KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN Kết luận Cá Chim vây vàng (Trachinotus blochii), cỡ 6-14 cm bị bệnh đốm trắng nội tạng bộc lộ dấu hiệu sau: xuất nhiều nốt phồng rộp da, u hạt mầu trắng, nhỏ mang nội tạng lách, thận, gan khối u lớn nhỏ nằm dọc cột sống Các thương tổn làm thể cá bệnh biến dạng gây chết chết rải rác; tỷ lệ chết tích lũy quan sát đạt từ 30-70% cá ni Cá chim vây vàng bị bệnh đốm trắng nội tạng bị cảm nhiễm hệ thống quan nội tạng dạng vi khuẩn hình que, dài từ 2-10 µm, phân nhánh thường gẫy thành đoạn ngắn, Gram (+) kháng acid Các đặc điểm hình thái, sinh vật hóa học chủng vi khuẩn tựa giống vi khuẩn Nocardia spp, đặt tên NLB (Nocardia Like Bacteria) Kết cảm nhiễm ngược điều kiện thí nghiệm chứng tỏ rằng, vi khuẩn NLB tác nhân gây bệnh đốm trắng nội tạng cá chim vây vàng nuôi lồng Khánh Hòa Đề xuất ý kiến Cần tiến hành định danh đến loài chủng vi khuẩn NLB kỹ thuật sinh học phân tử 436 TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Quốc Thịnh, Từ Thanh Dung Ferguson, H.W (2004) Nghiên cứu mô bệnh học cá tra (Pangasius hypophthalmus) bị bệnh trắng gan Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ 2004: 120-125 Chen, S-C., Lee, J,-L., Lai, C.-C, Gu, Y.-W., Gu, C.-T., Wang, C.-T., Chang, H-Y and K.-H Tsai (2000).Nocardiosis in sea bass-Lateolabrax japonicus in Taiwwan J Fish Dis.20: 299307 Crumlish, M., Dung, T.T., Turnbull, J.F., Ngoc and Ferguson, H (2002) Identification of Edwardsiella ictaluri from diseased freshwater catfish Pangasius hypophthalmus (Sauvage) cultured in Mekong delta, Vietnam J Fish Dis 25: 733 – 736 Holt, J.G., N.R Krieg, P.H.A Sneath, J.T Staley and S.T Williams (1994).Bergey!s Manual of Determinative Bacteriology, ninth Edition Williams and Wilkins, Baltimore, Maryland 21202, USA.605-649p Kudo, T., Hatai, K.and A.Seino (1988) A Nocardia seriolae sp nov causing nocardiosis of cultured fish International Journal of Systematic Bacteriology 38, p.173–178 Liu, P.C., J Y Lin and K K Lee (2003).Virulence of Photobacterium damsela Subsp Piscicida in Cultured cobia Rachycentron canadum.In Basic Microbiol.42 (2003) 6, 499-507 Liu, C.H., Cheng, W., Hsu, J.P and J.C Chen (2004) Vibrio algynolyticus infection in the white shrimp- Litopenaeus vannamei confirmed by polymerase chain reaction-PCR and 16s rDNA sequancy Dis Aquat Org, vol 61, p.169-174 Labrie, L., J NG., Z Tan, C Komar, E Ho and L Grisez (2008) Nocardial infections in fish: an emerging problem in both freshwater and marine aquaculture systems in Asia Diseases in Asian Aquaculture VI, 297-312 Shimahara, Y., Y-F Huang, M.-A Tsai, P.-C Wang, T Yoshida, J - L Lee and S C Chen (2009) Genotypic and Phenotypic analysis of fish pathogen Nocardia seriola isolated in Taiwan Aquaculture 294: 165-171 Shimahara, Y., Yasuda, H., Nakamura, A and T Itami (2005) Detection of antibody responses against Nocardia seriolae by enzyme-linked immunosorbent assay and a preliminary vaccine trial in yellowtail Seriolae quinqueradiata.Bulletin of The European Association of Fish Pathologists, 25, p.270-275 Tonguthai K , S Chinabut, T Somsiri., P Chanratchakool and S Kanchanakhan (1999): Diagnostic procedures for finfish diseases Aquatic Animal Health Research Institute Wang , G.L., Xu, Y.J., Jin S J.L andS P Zhu (2007) Nocardiosis in snakehead, Ophiocephalus argus Cantor Aquaculture, 271,p 54–60 Wang, G.L., Yuan, S.P and S Jin (2005) Nocardiosis in large yellow croaker, Larimichthys crocea (Richardson) Journal of Fish Diseases, 28, p 339–345 Whitman K.A and N.G.MacNair (2004) Finfish and Shellfish Bacteriology Manual Techniques and Procedures Lowa State Press, 258p 437 ... Manual of Determinative Bacteriology, ninth Edition Williams and Wilkins, Baltimore, Maryland 21202, USA.605-649p Kudo, T., Hatai, K.and A.Seino (1988) A Nocardia seriolae sp nov causing nocardiosis... hay gan cá bệnh (Liu & CS 2003) Bệnh Nocardiosis nhiễm vi khuẩn Nocardia spp có dạng hình que, phân nhánh, Gram dương, kháng acid, thông báo gây bệnh loài cá chim vây vàng (Trachinotus blochii)... trắng nội tạng cá chim vây vàng ni Khánh Hịa, kết thu từ hai thí nghiệm cảm nhiễm ngược chứng minh rằng, loại vi khuẩn tương tự Nocardia (NLB) tác nhân gây bệnh đốm trắng nội tạng cá chim vây vàng