PHƯƠNG PHÁP THỬ NGHIỆM ĐỘC HỌC SỬ DỤNG HỆ HÔ HẤP CỦA MÀNG TY THỂ TIM BÒ

TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 10, SỐ 01 - 2007 PHƯƠNG PHÁP THỬ NGHIỆM ĐỘC HỌC SỬ DỤNG HỆ HƠ HẤP CỦA MÀNG TY THỂ TIM BỊ Lê Phi Nga (1), Nguyễn Thị Thư Hiền (1), Nguyễn Thị Hoa Liên (1), Dương Thị Hương Giang (2), Đinh Duy Kháng (3) (1) Viện Môi trường Tài nguyên, ĐHQG - HCM (2) Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ (3) Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam 1.GIỚI THIỆU Các thử nghiệm độc học môi trường dạng ống nghiệm (in vitro) sử dụng thể sinh học nhỏ bé vi sinh vật, ấu trùng sò chất sống cấu trúc nhỏ bé tế bào như: bào quan, enzyme, khắc phục yếu điểm thử nghiệm dùng thể sinh học bậc cao Các thử nghiệm in vitro thường cho kết nhanh, độ lặp lại cao rẻ nhiều mà độ nhạy phép thử nghiệm tương đương đa số trường hợp Vì khơng có loại thử nghiệm lý tưởng cho tất chất độc môi trường, nữa, cơng cụ thử nghiệm có ưu nhược điểm riêng thường nhạy cảm với số dạng chất độc định, để có đánh giá rủi ro tin cậy nhất, cần sử dụng nhóm hay cơng cụ thử nghiệm có mối quan hệ sinh thái Ở Việt Nam dạng thử nghiệm tồn thử nghiệm dùng cá, dùng bọ nước (Daphina magna Ceriodaphina cornuta), dùng tảo Selenastrum, dùng vi khuẩn Vibrio fischeri - phương pháp thử nghiệm invitro thương mại hóa dạng Test Kít u cầu đo máy chuyên dụng sản xuất công ty Microtox Phương pháp thử nghiệm độc tố môi trường sử dụng hệ hô hấp màng ty thể tim bò nghiên cứu sớm từ cuối năm 70 [4] Ty thể bào quan riêng biệt nghiên cứu sớm đầy đủ cấu trúc, cấu tạo phân tử chức sinh lý, sinh hóa tế bào Vai trị ty thể cung cấp lượng cho tế bào thông qua việc tổng hợp phân tử ATP (adenosine triphosphate) mang lượng cao Quá trình tổng hợp ATP diễn phức tạp nhờ chênh lệch (∆ϕ) hai bên màng ty thể trình proton bơm qua màng thông qua hoạt động chuỗi chuyển dịch điện tử màng gọi chuỗi hô hấp Oxy chất nhận điện tử cuối chuỗi hô hấp Hoạt động chuỗi hô hấp thực chất q trình sinh lý enzym thơng qua trao đổi vật chất qua màng ty thể Vì enzym cửa ngõ tế bào có phản ứng nhạy cảm với có mặt chất kìm hãm - chất gây độc Các phần màng lớp ty thể sau phá siêu âm cho tiểu phần hình cầu (Sub-mitochondrial particles, viết tắt SMP) mang enzym hệ hơ hấp hướng phía ngồi, nhờ mà phản ứng enzym khảo sát Bản thân SMP nhỏ nên phản ứng thực ống nghiệm theo dõi phổ hấp thụ khơng cản bước sóng Về nguyên tắc thử nghiệm độc học dùng SMP thử nghiệm khả ức chế hoạt tính hệ enzym phần hay tồn phần chuỗi hơ hấp tạo tương tác enzym sau: Phức hợp (Complex)-I: NADH dehydrogenase; Phức hợp-II: sucinate hydrogenase; Phức hợp-III: cytochrome-c; Phức hợp-IV: ferrocytochrome-c; Phức hợp-V: ATPase Các phản ứng thử nghiệm độc học thường là: 1/ ETr: phản ứng vận chuyển điện tử xuôi với tham gia Phức hợp-I, III IV; 2/ RET: phản ứng vận chuyển điện tử ngược với tham gia Phức hợp-I, II V; 3/ FEW : phản ứng lấy điện tử với tham gia Phức hợp-I Thử nghiệm độc học sử dụng hoạt tính của phản ứng công bố tài liệu [1], [2], [4], [5] và[6] Mục đích nghiên cứu nhằm thử nghiệm ứng dụng phương pháp SMP ty thể tim bò cho thử nghiệm độc học nước, bao gồm nội dung: 1/ Thu nhận ty thể SMP từ tim bò; 2/ Thử nghiệm độc học dùng SPM sở hoạt tính phản ứng RET hoạt tính phản ứng ETr với: a) kim loại nặng: Cd, Cu, Hg, Pb, Zn; b) Thuốc bảo vệ thực vật Carbamat thuốc diệt cỏ Science & Technology Development, Vol 10, No.01 - 2007 Vifosalt; c) mẫu nước thải công nghiệp);3/ So sánh với phương pháp thử nghiệm dùng SMP với phương pháp hành: Daphnia Mirotox Sự thành công nghiên cứu góp phần đưa thêm phương pháp thử nghiệm độc học invitro vào sử dụng Việt Nam 2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1.Vật liệu Tim bò tươi mới, sau giết mổ không bảo quản đá lạnh (~ oC - 6oC) Hoá chất sử dụng có độ tinh cao (nhà cung cấp: Merk, Sigma): Tris (Trimabse), ATP (Adenosine triphosphate), NADH (Nicotinamide adenine dinucleotide), NAD+ (dạng bị khử NADH), PMSF (Phenylmethylsulfonylfluoride), GSH (Glutathion), DCPIP (2,6dichlorophenolindophenol) Các kim loại nặng dùng cho thử nghiệm dung dịch chuẩn: Cu(NO3)2 , Zn(NO3)2, Cd(NO3)2, Pb(NO3)2, Hg(NO3)2 nhà sản xuất Merk Carbamate thuốc trừ sâu công ty thuốc sát trùng Miền nam cung cấp Glyfosalt (chứa hoạt chất Glyfosate-isopropylamine) thuốc diệt cỏ cho trồng cạn bán rộng rãi thị trường Bốn mẫu nước thải công nghiệp có mã số: T03.57-1/4, T03.36-1/5, T03.38-3/8 T03.18-5/5 cung cấp Phịng Chất lượng nước Viện Mơi trường Tài nguyên, ĐHQG-HCM 2.2.Phương pháp tách ty thể SMP từ tim bị Q trình tách chiết chủ yếu tiến hành theo Rodney F Boyer [3] có cải tiến Tồn q trình thực nhiệt độ ± oC Sau loại bỏ phần mỡ gân, tim bò xắt miếng, rửa, xay nhuyễn Tris-sucrose: 10 mM Tris chứa 0,25 M sucrose, pH 7,8 (Đệm-1) Lọc bỏ dịch máu Đồng hóa tim bò xay cối nghiền piston dung dich Đệm-1 có thêm mM MgCl2, mM Succinate, µg/ml Leupeptin 0,1 mM PMSF (Đệm-2) Loại bỏ tế bào chưa vỡ cách ly tâm tốc độ 1500 rpm 20 phút với máy ly tâm Sorvall RC26 Ty thể tủa lại sau ly tâm tốc độ 8000 rpm 45 phút máy ly tâm Ty thể nặng đồng hóa dung dịch Đệm-2 có thêm mM GSH (Đệm-3), sau rửa lại dich đệm, lắng ly tâm, đồng hóa lại Từ ty thể chuyển sang bước tách SMP đông lạnh nhanh nitơ lỏng bảo quản nhiệt độ -20oC Ty thể (~ 20 mg/ml) tươi hay rã đông đưa qua máy siêu âm (Sonics model VC130PB) Ty thể chưa vỡ loại bỏ ly tâm 8000 rpm 15 phút (Sorvall RC26), thu phần dịch SMP lắng ly tâm siêu tốc 30.000 rpm (Sorvall UltraPro 80) Sau đồng hóa, rửa đồng hóa lại dung dịch Đệm-3 có thêm 1mM ATP, SMP đơng lạnh nhanh nitơ lỏng bảo quản nhiệt độ -200C Hình 1.Nguyên tắc phản ứng RET 2.3.Phản ứng RET [6]: Nguyên tắc phản ứng trình bày Hình-1 Phản ứng thực đệm 25 mM HEPES-KOH, pH 7,5, mM MgCl2, mM Na-succinat, mM NAD+, 2,5µg/ml Antimycin ~ 0,2 mg/ml SMP Phản ứng bắt đầu thêm mMATP vào dung dịch Độ gia TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 10, SOÁ 01 - 2007 tăng hấp thu quang phổ bước sóng 340 nm ghi lại 10 giây (tính từ thời điểm thêm ATP) 2.4.Phản ứng ETR [6]: Nguyên tắc phản ứng trình bày Hình-2 Phản ứng thực đệm 25 mM HEPES-/KOH, mM MgCl2, pH 7,5 ~ 0,2 mg/ml SMP Phản ứng bắt đầu 0,16 mM NADH thêm vào dung dịch Độ giảm hấp thu quang phổ bước sóng 340 nm ghi lại 10 giây (tính từ thời điểm thêm NADH) Hình Nguyên tắc phản ứng ETR 2.5.Phương pháp xác định EC50 đánh giá độ tương đương phương pháp: EC50 tính theo tuyến tính bậc logarit phần trăm độ kìm hãm hoạt tính theo thay đổi nồng độ tỉ lệ phần trăm kìm hãm = [1 – (Sn / So)] * 100%) với So hệ số góc khơng có chất độc; Sn hệ số góc có chất độc Độ tương đương phương pháp biểu diễn mối tương quan tuyến tính (y = ax + b) nhóm trị số logarit EC50 tất mẫu thu theo phương pháp nhóm trị số logarit EC50 tất mẫu thu theo phương pháp [4] 2.6.Các phương pháp khác: 1/ Xác định hàm lượng protein phương pháp Lowry [7]; 2/ Phản ứng hô hấp ty thể với DCPIP chất nhận điện tử cuối cùng; 3/Thử nghiệm độc tính cấp EC50 -24h Daphnia magna theo OECD-202; 4/ Thử nghiệm độc tính cấp 15 phút Vibrio Fisheri theo Microtox [8] 3.KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1.Kết tách ty thể SMP Hiệu suất thu protein ty thể đạt khoảng 1-1,4% trọng lượng tim bò tươi (đã loại bỏ phần mỡ bao tim) Hoạt tính chuỗi hơ hấp ty thể khảo sát dựa phản ứng chuyền điên tử với chất nhận điên tử cuối DCPIP (0,754 ± 0,013 mmoles/mg protein/phút) Quá trình tạo SMP từ ty thể thu khó khăn với yêu cầu lượng máy siêu âm phải đủ lớn để làm đứt gãy nhanh màng ty thể, sau hỗn dịch thu phải ly tâm tốc độ cao, nhanh chóng tủa màng, tách bỏ chất Với lượng máy 100 W/22 Hz, hiệu suất thu không cao, 4,4 ± 0,4% trọng lượng tươi ty thể Cũng lượng thấp nên việc phá vỡ ty thể siêu âm phải lặp lại nhiều lần đá lạnh, tăng nguy làm giảm hoạt tính SMP sau Tuy nhiên, hoạt tính SMP thu theo quy trình ổn định đề cập đến cách chi tiết phần sử dụng SMP cho phản ứng thử nghiệm độc học Science & Technology Development, Vol 10, No.01 - 2007 3.2.Hoạt tính SMP theo phản ứng RET ETr Hình-3 kết thu làm ví dụ cho phản ứng RET hoạt tính RET bị ức chế Pb2+ Phản ứng tạo NADH tuyến tính vòng 15-20 phút So với phản ứng ETr tốc độ RET chậm nhiều phản ứng vận chuyển điện tử ngược Tốc độ phản ứng RET khơng có chất độc 6,2 ± 2.5 µmoles NADH/g protein/phút (18 thí nghiệm) RET-Pb 23-3-2006 A340nm 0.185 control 0.16 0.15mg/l 0.3mg/l 0.5mg/l 0.135 0.8mg/l 0.11 0.085 Thời gian (phút) Hình 3.Ảnh hưởng Pb2+ hoạt tính RET Hình-4 kết thu làm ví dụ phản ứng ETr, phản ứng phân hủy NADH, bị ức chế nước thải sản xuất bột cá So với phản ứng RET tốc độ ETr nhanh phản ứng vận chuyển điện tử xi, có nghĩa theo chiều hoạt tính sinh lý chuỗi hơ hấp Tốc độ phản ứng ETr khơng có chất độc đo 12,0 ± 4,3 µmoles NADH/g protein/phút (14 thí nghiệm) 3.3 Đánh giá độc tính kim loại nặng (EC50) phương pháp thử nghiệm độc học dùng SMP Các kim loại nặng đặc biệt kim loại hóa trị II nồng độ nhỏ có vai trị tạo nên Coenzym xúc tác cho nhiều phản ứng sinh học: Fe, Zn, Cu, Ni, Se, nhiên nồng độ cao nồng độ sinh lý ion thường chất kìm hãm trình enzym chế cạnh tranh (thay thế) khơng cạnh tranh (khóa vị trí xúc tác) với chất Việc tích lũy ion thể người động vật độc tính Trên Bảng-1, kim loại nặng (chất chuẩn), giá trị EC50 thu qua thí nghiệm hồn tồn so sánh với giá trị EC50 phương pháp ghi nhận tài liệu số [4] Đối với kẽm, kết ngạc nhiên giá trị EC50 thu nhỏ tài liệu gần 100 lần, điều chưa tìm lý giải, SMP tỏ nhạy cảm Cadmium TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 10, SỐ 01 - 2007 Nước thải T03.18-5/5 (21-04-2006) A340nm 0.96 0.125% 0.25% 0.4% 0.5% 0.005% control 0.93 0.90 0.87 2.5 Thời gian (phút) 3.5 Hình Ảnh hưởng nước thải sản xuất bột cá hoạt tính ETr Bảng Giá trị EC50 kim loại nặng (ppb) Kim loại Phương pháp Kết thực nghiệm Tài liệu tham khảo [4] Cd Cu Hg Pb Zn RET 1103 -1263 - 69,5 7,6 -419 4,32-13,1 ETr 463 243 - 720 25,2 Microtox 60,5 66,6 72,6 10,2 199 Daphnia 39 25 45 >100 0,266-0,375 0,081-1,136 0,68 1,587 Science & Technology Development, Vol 10, No.01 - 2007 T03.18-5/5 (bột cá) T03.36-1/5 (mỹ phẩm) 0,134 0,084 0,117 2,504 78,1 27,2 - - Nước thải T03.57-1/4 từ sản xuất da giày T03.18-5/5 từ sản xuất bột cá, độc với số EC50 < 0,5% v/v (Bảng-2) T03.38-3/8 (nước thải Vedan) gây độc mạnh cho phản ứng RET (EC50: 4,8 ~ 10,2% v/v) dường gây độc sử dụng cơng cụ lại Một điều đáng ngạc nhiên là, mẫu T03.18-5/5 T03.36-1/5 (nước thải hóa mỹ phẩm) tương tự kết phân tích hóa học (khơng cơng bố Phịng chất lượng nước Viện Mơi trường Tài ngun) lại khác độ độc T03.36-1/5 gây độc nhẹ (EC50 < 27,2) T03.18-5/5 gây độc mạnh (EC50 < 0,2%) Hai công cụ SMP/RET SMP/ETr tỏ nhạy với nước thải tương đương với phương pháp Microtox, Daphnia nhạy khoảng 10 lần 3.5.So sánh phương pháp SMP với phương pháp hành Bảng-3 kết xử lý số liệu EC50 cặp cơng cụ thử nghiệm Có tất cặp công cụ Giá trị “R2” cho biết độ tin tưởng độ gần sát điểm thực nghiệm so với đường tuyến tính R2= tất điểm nằm đường tuyến tính Hệ số góc “a” cho phép so sánh độ nhạy phương pháp Ví dụ: so sánh ETr RET (ETr/RET) có a = 0,9651 ETr nhạy RET chút ít, ngược lại Daphnia/ETr có a = 1,1049 cho biết ETr nhạy Daphnia Độ lệch gốc hay lệch tâm “b” đường tuyến tính cho biết sai số phép thử nghiệm Ở sai số lớn khoảng 0,5 tức có nghĩa sai lệch cặp giá trị EC50 không ppb Nếu quy ước tương đương phương pháp giá trị 0.9 ≤ a ≤1,1 độ tin tưởng R2 ≥ 0.9 phương pháp Daphnia khơng tương đồng với phương pháp khác thử nghiệm độc học nước thải cơng nghiệp, ETr RET tương đồng với phương pháp Microtox tất mẫu thử nghiệm Bảng Bảng so sánh phương pháp SMP với phương pháp hành (sử dụng giá trị EC50 tất mẫu thử nghiệm: KLN, TBVTV, nước thải) Số lần thử nghiệm (n) Độ tin tưởng (R2) Hệ số góc (a) Độ lệnh gốc (b) ETr/RET 20 0,9727 0,9651 0,3214 Microtox/ RET 20 0,8958 1,067 -0,2968 Daphnia/ RET 21 0,8302 1,0969 0,0462 Microtox/ ETr 17 0,9131 1,0579 -0,4902 Daphnia/ ETr 17 0,8162 1,1049 -0,4973 Daphnia/Microtox 20 0,8615 1,054 -0,1004 KẾT LUẬN Đề tài tạo thành công phép thử độc học sử dụng SMP dựa sở phản ứng RET phản ứng ETr tương tự “kit” thử độc học cơng ty MitoScan Hoạt tính phản ứng RET 6,2 ± 2,5 µmoles NADH/g protein/phút, nhiên, 10% hoạt tính kít thử cơng ty MitoScan, cần có bước cải tiến để nâng cao hiệu suất hoạt tính SMP Hoạt tính phản ứng ETr 12,0 ± 4,3 µmoles NADH /g protein/phút, gấp lần phản ứng RET Cả hoạt tính đáp ứng tốt với chất độc thử nghiệm SM-/RET SMP-ETr có dùng thay cơng cụ Microtox, đáp ứng tiêu chí kỹ thuật ưu điểm kinh tế TẠP CHÍ PHÁT TRIỂN KH&CN, TẬP 10, SOÁ 01 - 2007 SMP-RET SMP-ETr nên dùng thay phương pháp Daphnia cho thử nghiệm chất độc hữu (ví dụ nước thải cơng nghiệp hay loại thuốc bảo vệ thực vật) cơng cụ nhạy cảm Tuy nhiên, Daphnia lại nhạy cảm với kim loại nặng hơn, cơng cụ thích hợp trường hợp mẫu thử nghiệm chứa kim loại nặng Cũng giống thử nghiệm độc học môi trường khác, phương pháp dùng ty thể SMP ty thể có yếu điểm SMP có độ nhạy với ammonia, colchicin [9[ Hơn nữa, phép thử sử dụng phương pháp so màu mẫu có độ đục cao có màu gây ảnh hưởng tới tính xác phép thử Một lần kết nghiên cứu cho thấy để đánh giá độc tính mẫu môi trường nên kết hợp vài hay nhiều công cụ thử nghiệm TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] E Manuele Argese, Cinzia Bettiol, Annamaria Volpi Ghiradini, Matteo Fasolo, Gianumberto Giurin, Pier Francesco Ghetti Comparison of in vitro submitochondrial Particle and Microtox assays for determining the toxicity of origanotin compounds Environ Toxicol Chem 17(6), 1005-1012 (1998) [2] E Manuele Argese, Cinzia Bettiol, Francesca Agnoli, Agfonso Zambon, Martina Mazzola, Annamaria Volpi Ghiradni Assessment of chloroaniline toxicology by the submitochondrial particle assay Environ Toxicol Chem 20 (4), 826-832 (2001) [3] Rodney F Boyer Modern experimental Biochemistry (1993) [4] Harry W Read, John M Harkin, Karl E Gustavson Environmental Applications with Submitochondrial Particles Microscale testing in aquatic toxicology: Advances, Techniques, and Practice, 31-52 (1998) [5] Karl E Gustavson, Andres Svenson, Jonh M Harkin Comparison of toxicities and mechanism of acition of N-Alkanols in the submitochondrial particles and the Vibrio fischeri bioluminescence (Microtox@) bioassay - Environmetal toxicology and Chemistry 17(10), 1917-19214 (1998) [6] Assessing toxicity of wastewater using the submitochondria particle (SMP) reverse electron transfer (RET) bioassay - Mitoscan corporation [7] www.mitoscan.com [8] Lowry protein assay - P.J Hansen [9] www.animal ufl.edu/hansen/protocols/LOWRY.htm [10] Microtox® Rapid Toxicity Testing System [11] http://www.azurenv.com/mtox.htm [12] L.M Knobeloch, G.A Blondin, H.W Read and J.M Harkin Assessment of chemical toxicity using mammalian mitochondrial electron transport particles Arch Environ Contam.Toxicol 19, 828-835 (1990)