TUYỂN CHỌN VI KHUẨN AZOTOBACTER CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH NITƠ VÀ SINH TỔNG HỢP IAA

Công nghệ sinh học & Giống trồng TUYỂN CHỌN VI KHUẨN AZOTOBACTER CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH NITƠ VÀ SINH TỔNG HỢP IAA Nguyễn Thị Thu Hằng1, Nguyễn Thị Thủy2 1,2 ThS Trường Đại học Lâm nghiệp TÓM TẮT Azotobacter sp vi khuẩn đất, gram âm, di động, hơ hấp hiếu khí, có khả cố định nitơ tự Vi khuẩn Azotobacter quan tâm không khả cung cấp dinh dưỡng nitơ mà có khả kích thích nảy mầm, sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật Trong đất, Azotobacter tập trung vùng đất xung quanh rễ Các chủng vi khuẩn Azotobacter phân bố 20 mẫu đất trồng lúa tự nhiên phân lập, sở tuyển chọn chủng Azotobacter, kí hiệu AZT1 AZT7, vừa có khả cố định nitơ phân tử khơng khí thành nitơ dạng ammonium (NH4+), vừa có khả sinh Indole acetic acid (IAA) với hàm lượng cao Trong môi trường Ashby lỏng bổ sung 2% glucose, pH 7, nuôi cấy 30oC 72 giờ, chủng AZT1 AZT7 có khả cố định nitơ tương ứng 3,36 mg/l 3,32 mg/l, sinh tổng hợp IAA với hàm lượng tương ứng 10,11 µg/ml 12,87 µg/ml Ngồi khả cố định nitơ sinh IAA, hai chủng AZT1 AZT7 cịn có hoạt tính phosphatase, cellulase Từ khố: Azotobacter sp., cố định nitơ, IAA, phân lập, vi khuẩn I ĐẶT VẤN ĐỀ Vi sinh vật cố định nitơ nhóm vi sinh vật có khả chuyển hóa khí N2 dồi khơng khí (79%) thành nitơ dạng ammonium (NH4+) cung cấp cho thực vật Trong tự nhiên, nhóm vi sinh vật cố định nitơ cung cấp cho hành tinh tới 240 x 106 N/năm (gấp lần lượng nitơ giới sản xuất đường hóa học) (Harunor Rashid Khan, 2008) Trong số vi sinh vật có khả cố định nitơ theo kiểu không cộng sinh, vi khuẩn Azotobacter quan tâm ứng dụng nhiều sản xuất phân bón sinh học cố định nitơ Ngoài khả cố định nitơ, Azotobacter cịn có nhiều đặc tính hữu ích khác như: Sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật, tăng cường hấp thu lân hợp chất hữu từ đất thực vật chúng sinh enzyme phosphatase, cellulase (Ridvan Kizilkaya, 2009) Phân bón vi sinh cố định nitơ quan tâm nghiên cứu đẩy mạnh sản xuất, ứng dụng cho trồng nơng - lâm nghiệp Với mục đích tiếp tục tìm kiếm tự nhiên chủng Azotobacter có nhiều hoạt tính sinh học q, đặc biệt có khả cố định nitơ sinh tổng hợp IAA với hàm lượng cao, có khả thích ứng rộng, nghiên cứu thực nhằm tạo nguồn vật liệu vi sinh vật quý cho sản xuất phân bón sinh học cố định nitơ II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thu thập mẫu 20 mẫu đất (10 g/mẫu) thu thập khu ruộng trồng lúa khác Sơn Tây Xuân Mai, Hà Nội Mẫu đất lấy độ sâu – 15 cm, sau loại bỏ khoảng cm phần đất tàn dư thực vật 2.2 Phân lập nuôi cấy vi khuẩn Azotobacter có khả cố định nitơ tự Hòa tan 10 g đất 90 ml nước cất tiệt trùng, để ổn định 30oC 15 phút, pha loãng mẫu (đến nồng độ 10-6), cấy trải dịch pha lỗng lên mơi trường Ashby mannitol agar (mannitol 20 g; K2HPO4 0,2 g; MgSO4.7H2O 0,2 g; NaCl 0,2g; K2SO4 0,1 g; CaCO3 g; agar 15 g; nước cất 1000 ml; pH - 7,2), ủ 30oC 72 Nhận dạng khuẩn lạc vi khuẩn Azotobacter theo khóa phân loại Bergey (1989) dựa số đặc điểm: Hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào vi khuẩn (nhuộm Gram, quan sát kính hiển vi), khả di động, đặc tính sinh hóa (hoạt tính TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 4-2015 Công nghệệ sinh học & Giống trồng catalase, khả đồng hóa đư ường mannitol, glucose, fructose, lactose, sucrose) sucrose 2.5 Xác định khảả phân giải phosph phosphate khó tan chủng đư ược tuyển chọn 2.3 Tuyển chọn chủng có khảả cố định nitơ nit Khảả phân giải phosph phosphate khó tan chủng Azotobacter ợc xác định phương pháp cấy chấm điểm vào đđĩa Petri chứa môi trường ờng Pykovskaya agar (glucose 10 g; MgSO4.7H2O 0,1 g; Ca3(PO4)2 g; KCl 0,2 g; FeSO4.7H2O 0,002 g; NaCl 0,2 g; (NH4)2SO4 0,5 g; MnSO4 0,002 g; yeast extract 0,5 g; agar 15 g; nước cất 1000 ml; pH 77) Nuôi 30oC 72 Đo đường ờng kính vvịng thủy phân Ca3(PO4)2 để xác định ịnh khả phân giải phosphate khó tan theo cơng th thức: D/d (D: đường kính vịng phân giải ải phosph phosphate khó tan; d: đường kính khuẩn lạc) Dịch ni lỏng chủng Azotobacter phân lập (mật độ tế bào khoảng ảng 105 CFU/ml) cấy tỉ lệ vào 15 ml môi trường trư Ashby lỏng đựng ống 50 ml, ni lắc l 125 o vịng/phút 30 C 72 Ly tâm thu t dịch + xác định nồng độ NH4 cố định chủng Azotobacter dịch d nuôi cấy phương pháp so màu với ới thuốc thử Nessler, Nessler sử dụng đường chuẩn ammonium (hình 1) NH4+ (mg/ml) y = 0.011x + 0.003 R² = 0.996 0.5 0 50 100 Hình Đồồ thị chuẩn ammonium (NH4+) 2.4 Tuyển chọn chủng có khả kh sinh tổng hợp IAA Vi khuẩn ợc nuôi cấy môi trường tr lỏng ỏng bổ sung 0,1% tryptophan, ni lắc (125 ( o vịng/phút) tủ tối 30 C 72 Hàm lượng IAA thô sinh dịch d nuôi cấy xác định ịnh phương ph pháp thực phản ứng màu với ới thuốc thử Salkowski tạo sản phẩm có màu, àu, đo cường độ màu máy quang phổ so màu àu bước sóng 530 nm, dựa vào đồ thị chuẩn IAA (hình 2) xác định xác định hàm àm lượng lư IAA (Glickmann & Dessaux, 1995) OD530nm y = 0.011x + 0.003 R² = 0.996 0.5 0 20 40 60 80 Hình Đồ thị chuẩn IAA 100 2.6 Xác định ảnh hưởng ởng số điều kiện ện nuôi cấy đến sinh tr trưởng khả cố định nitơ,, sinh IAA ccủa chủng tuyển chọn Ảnh hưởng pH môi trư trường nuôi cấy: Tiến hành cấy thểể tích dịch lỏng chủng Azotobacter (105 CFU/ml) có khả cố định nitơ, sinh tổng hợp IAA cao, đđã tuyển chọn môi trường ờng Ashby lỏng có pH mơi trường ợc điều chỉnh đến pH khác nhau: pH 4, 5, 6, 7, 8, Xác định ịnh đặc điểm sinh trưởng, khả cố định nitơ sinh ttổng hợp IAA chủng vi khuẩn tương ương ứng với loại môi trường, sở xác định đđược khoảng ảng pH thích hợp Azotobacter sp Ảnh hưởng nguồn ồn car carbon: Nuôi cấy chủng Azotobacter ong môi trường Ashby lỏng bổ sung nguồn carbon khác nhau: mannitol, glucose, sucrose, maltose, carboxymethyl cellulose (CMC) (CMC) Điều chỉnh mơi trường đến pH thích hhợp, ni nhiệt độ 30ºC, lắc 125 vòng/phút Sau 72 giờ, xác định khả sinh trưởng, ởng, cố định nit nitơ sinh tổng hợp IAA chủng Azotobacter tuyển chọn Khả sinh trưởng, ởng, phát triển vi khuẩn ợc đánh giá thông qua llượng sinh TẠP ẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ V CƠNG NGHỆ Ệ LÂM NGHIỆP SỐ 44-2015 Công nghệ sinh học & Giống trồng khối vi khuẩn xác định theo phương pháp đo độ đục dịch nuôi cấy máy quang phổ so màu UV/VIS bước sóng 600 nm Khả cố định nitơ xác định phương pháp Nessler Xác định hàm lượng IAA môi trường theo phản ứng màu với thuốc thử Salkowski III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Phân lập vi khuẩn Azotobacter Từ 20 mẫu đất thu thập ruộng trồng lúa, phân lập 14 chủng vi khuẩn có khả Azotobacter mọc tạo khuẩn lạc môi trường phân lập đặc hiệu không chứa nguồn nitơ Trong số 14 chủng phân lập, có chủng sinh trưởng, phát triển mạnh môi trường Ashby nên lựa chọn làm đối tượng cho nghiên cứu Kết nhận dạng chủng vi khuẩn đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào vi khuẩn, xác định số đặc điểm sinh hóa (theo khóa phân loại Bergey, 1989), cho phép khẳng định chủng vi khuẩn Azotobacter có khả cố định nitơ, gram âm, tạo bào nang với thành dầy, có khả di động, có hoạt tính catalase oxidase, có khả đồng hóa mannitol, glucose, lactose, fructose, sucrose (bảng 1) Bảng Phân lập nhận dạng chủng Azotobacter sau 72 nuôi cấy mơi trường Ashby mannitol agar 30oC Kí hiệu chủng AZT1 Hình thái khuẩn lạc Hình dạng tế bào Gram Khả di động + Catalas e + Tròn, trắng, bề Hình cầu mặt bóng, nhầy AZT2 Trịn, vàng sáng, Hình cầu + + bề mặt nhăn, nhầy AZT3 Trịn, vàng đậm, Hình cầu + + bề mặt nhăn, nhầy AZT4 Trịn, trắng đục, Hình ovan + + bề mặt trơn, nhầy AZT5 Trịn, vàng nhạt, Hình cầu + + bề mặt bóng, nhầy AZT6 Trịn, vàng nâu, Hình cầu + + bề mặt bóng, nhầy AZT7 Trịn, trắng trong, Hình ovan + + bề mặt nhẵn, nhầy Man: Mannitol; Glu: Glucose; Fruc: Fructose; Lac: Lactose; Suc: Sucrose 3.2 Tuyển chọn chủng có khả cố định nitơ Bảng Khả cố định nitơ chủng Azotobacter sau 72 ni lắc 125 vịng/phút, 30oC Ký hiệu Hàm lượng NH4+ chủng (mg/ml) AZT1 3,24 AZT2 2,50 AZT3 2,65 AZT4 3,05 AZT5 1,81 AZT6 3,09 AZT7 3,18 Kết nhận (bảng 2) cho thấy chủng Azotobacter có khả cố định Khả đồng hóa loại đường Hoạt tính enzyme Oxidase Man Glu Fru Lac Suc + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + nitơ (phù hợp với lý thuyết để chủng sinh trưởng mơi trường Ashby agar khơng chứa nitơ chúng phải có khả cố định N2 thành NH4+) Tuy nhiên, khả cố định nitơ chủng Azotobacter khác nhau: chủng có khả cố định nitơ mạnh, sinh NH4+ với hàm lượng mg/ml, gồm chủng AZT1, AZT4, AZT6, AZT7; đó, chủng AZT1 có khả cố định nitơ mạnh (3,24 mg/ml), sau đến chủng AZT7 (3,18 mg/ml), AZT6 (3,09 mg/ml), AZT4 (3,05 mg/ml) TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 4-2015 Công nghệ sinh học & Giống trồng 3.3 Tuyển chọn chủng có khả sinh tổng hợp IAA Kết xác định khả sinh tổng hợp IAA chủng Azotobacter (bảng 3) cho thấy chủng vi khuẩn sinh tổng hợp IAA, điều phù hợp với kết nghiên cứu Gomare cộng (2013) công bố khả sinh Indole đặc điểm đặc trưng vi khuẩn Azotobacter Trong đó, có chủng có khả sinh tổng hợp IAA với hàm lượng 10 µg/ml, chủng AZT7 (11,52 µg/ml), AZT1 (10,72 µg/ml), AZT4 (10,41 µg/ml); chủng có khả sinh IAA cao AZT6 (9,5 µg/ml) AZT2 (9,36 µg/ml) Bảng Khả sinh tổng hợp IAA chủng Azotobacter sau 72 ni lắc 125 vịng/phút, 30oC Ký hiệu chủng vi khuẩn Hàm lượng IAA (µg/ml) AZT1 AZT2 AZT3 AZT4 AZT5 AZT6 AZT7 10,72 9,36 5,64 10,41 6,81 9,50 11,52 Trong số chủng vi khuẩn phân lập, có chủng AZT1 AZT7 vừa có khả cố định nitơ, vừa sinh IAA với hàm lượng cao: Chủng AZT1 có khả cố định nitơ 3,24 mg/l, khả sinh IAA 10,72 µg/ml; chủng AZT7 cố định nitơ 3,18 mg/l, sinh IAA 11,52 µg/ml Hai chủng AZT1 AZT7 tuyển chọn để tiến hành nghiên cứu 3.4 Xác định khả phân giải phosphate khó tan Có nhiều chứng khoa học giới chứng minh vi khuẩn Azotobacter khả cố định nitơ, sinh IAA, cịn phân giải phosphate khó tan thành phosphate dễ tan Do vậy, nhiều loại phân bón sinh học cố định nitơ cịn có tác dụng tăng cường hiệu việc bón lân vô cho trồng Khả phân giải phosphate khó tan thành phosphate dễ tan chủng Azotobacter tuyển chọn khả cố định nitơ sinh IAA xác định Kết (bảng 4) chủng AZT1 AZT7 có khả phân giải phosphate khó tan Hoạt tính phân giải phosphate sau 72 nuôi môi trường Pykovskaya agar 30oC chủng AZT1 D/d = 3,00, chủng AZT7 có D/d = 1,83 Bảng Khả phân giải phosohate Azotobacter sp sau 72 môi trường Pykovskaya agar Khả phân giải phosphate khó tan Ký hiệu chủng vi khuẩn D - đường kính vịng phân giải (mm) d - đường kính khuẩn lạc (mm) Hoạt tính phân giải (D/d) AZT1 AZT7 18 11 6 3,00 1,83 3.5 Xác định ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy Kết xác định ảnh hưởng pH, nguồn carbon bổ sung vào môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng, khả cố định nitơ, sinh tổng hợp IAA hai chủng AZT1 AZT7 (bảng 5) cho thấy: Hai chủng AZT1 AZT7 có khả cố định nitơ sinh tổng hợp IAA mơi TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 4-2015 Công nghệ sinh học & Giống trồng trường có pH từ – 9, khơng cố định nitơ sinh tổng hợp IAA môi trường có pH pH Khả cố định nitơ sinh tổng hợp IAA hai chủng AZT1 AZT7 mạnh mơi trường có pH (hàm lượng nitơ dạng ammonium tạo hai chủng tương ứng 3,24 mg/ml 3,18 mg/ml), giảm nhẹ mơi trường có pH pH 8, giảm mạnh mơi trường có pH Do vậy, pH mơi trường ni cấy thích hợp cho nuôi cấy AZT1 AZT7 pH - 8, pH thích hợp pH Kết đạt phù hợp với nhiều công bố khoa học giới pH thích hợp cho ni cấy Azotobacter từ 7,2 8,2 (Aquilanti cộng sự, 2004; Damir cộng sự, 2011) Bảng Ảnh hưởng pH môi trường nguồn carbon đến khả sinh trưởng, cố định nitơ sinh tổng hợp IAA chủng AZT1 AZT7 Khả sinh trưởng, phát triển Hàm lượng NH4+ (mg/ml) Hàm lượng IAA (µg/ml) AZT1 AZT7 AZT1 AZT7 AZT1 AZT7 - - 0 0 - - 0 0 ++ ++ 2,97 3,051 8,30 9,77 +++ +++ 3,24 3,18 10,72 11,52 ++ ++ 3,05 3,06 9,18 10,58 + + 0,78 1,17 2,21 5,06 Glucose +++ +++ 3,36 3,32 10,11 12,87 Sucrose +++ +++ 3,30 3,27 9,11 12,17 Maltose ++ ++ 2,83 2,74 8,34 11,03 Carboxymethyl cellulose (CMC) + + 1,05 1,13 2,37 3,051 Mannitol +++ +++ 3,24 3,18 10,72 11,52 Điều kiện nuôi cấy pH môi trường Nguồn carbon (2%) Môi trường bổ sung ba nguồn carbon glucose, sucrose, mannitol thích hợp cho ni cấy chủng AZT1 AZT7 Trong môi trường bổ sung glucose, khả cố định nitơ sinh IAA AZT1 AZT7 tương ứng 3,36 mg/l 3,32 mg/l NH4+; 10,11 µg/ml 12,87 µg/ml IAA Khả sinh trưởng, cố định nitơ, sinh IAA hai chủng giảm nhẹ môi trường bổ sung maltose, giảm mạnh môi trường bổ sung CMC Đặc biệt, môi trường chứa CMC - hợp chất hữu cao phân tử, thẩm thấu qua màng tế bào vi khuẩn, mà vi khuẩn sinh trưởng, cố định nitơ, sinh IAA, với cường độ yếu, điều chứng tỏ chủng vi khuẩn có khả sinh cellulase phân giải CMC thành phần tử nhỏ để hấp thu TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 4-2015 Công nghệệ sinh học & Giống trồng a Bào nang c b d ĐC AZT1 AZT2 AZT3 AZT4 ZT4 AZT5 AZT6 AZT7 e Hình Một M số hình ảnh trình nghiên cứu a,b: khuẩn lạc sinh khối kh vi khuẩn Azotobacter môi trường ờng Ashby agar; c: hình dạng tế bào dạng ạng bào b nang với thành dầy ầy vi khuẩn Azotobacter chủng AZT1; d: thí nghiệm ệm xác định khả cố định nitơ; nit e: thí nghiệm ệm xác định khả sinh tổng hợp IAA IV KẾT LUẬN - Đã phân lập ợc chủng vi khuẩn có khả cố định nitơ, sinh trưởng, ởng, phát triển mạnh môi trường Ashby mannitol agar Các chủng vi khuẩn ợc tinh nhận dạng vi khuẩn Azotobacter theo khóa phân loại ại của Bergey (1989), với đặc điểm đặc trưng: gram âm, tạo bào nang với v thành dầy, có khả di động, có hoạt ạt tính catalase c oxidase; có khảả đồng hóa mannitol, glucose, lactose, fructose, se, sucrose - Đã tuyển chọn chủng ủng Azotobacter A sp kí hiệu AZT1 AZT7 có khảả cố định nitơ sinh tổng hợp IAA với hàm h lượng cao Trong môi trường ờng Ashby lỏng (glucose ( 20 g; K2HPO4 0,2 g; MgSO4.7H2O 0,2 g; NaCl 0,2 g; K2SO4 0,1 g; CaCO3 g; Agar 15 g; nước cất 1000 ml; pH = 7), nuôi ccấy 30oC 72 giờ, chủng AZT1 vàà AZT7 có kh khả cố định nitơ tương ứng 3,36 mg/l 3,32 mg/l, sinh tổng hợp IAA với hàm àm lư lượng tương ứng 10,11 µg/ml 12,87 µg/ml - Ngồi khảả cố định nitơ sinh tổng hợp ợp IAA, chủng AZT1 vvà AZT7 cịn có hoạt tính phosphatase ase (có kh khả phân giải phosphatee khó tan) cellulase (có kh khả phân giải ải cellulose Do vậy, hai chủng nnày có triển vọng sản ản xuất phân bón vi sinh đa chức (cố định nitơ,, sinh chất kích thích sinh trưởng, tăng cường ờng tác dụng việc bón TẠP ẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ V CƠNG NGHỆ Ệ LÂM NGHIỆP SỐ 44-2015 Cơng nghệ sinh học & Giống trồng and the microbiological properties of soils J environ Biol, 30 (1): 73-82 lân vô cơ, phân giải cellulose) TÀI LIỆU THAM KHẢO Harunor Rashid Khan, Mohiuddin, Rahman (2008) Enumeration, isolation and identification of nitrogenfixing bacterial strains at seeding stage in rhizosphere of rice grown in non-calcareous grey flood plain soil of Bangladesh Journal of the Faculty of Environmental Science and Technology, Vol 13: 97-101 Kizilkaya (2009) Nitrogen fixation capacity of azotobacter spp strains isolated from soils in different ecosystems and relationship between them Ridvan Glickman E, Dessaux Y (1995) A critical examination of the specificity of the Salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria Appl Environ Microbiol 61: 793-795 R.I (1948) Mobilization of phosphorus in soil in connection with vital activities by some microbial species Microbiologia, 17, 362-367 Pikovskaya, Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (1989) SCREENING OF AZOTOBACTER STRAINS WITH THE ABILITY OF NITROGEN FIXING AND SYNTHESIS OF INDOLE ACETIC ACID (IAA) Nguyen Thi Thu Hang, Nguyen Thi Thuy SUMMARY Azotobacter sp are soil bacterium, Gram-negative, motile, aerobic respiration They have capability of nitrogen fixing and synthesis of Indole acetic acid (IAA) Azotobacter sp are found in the soil and rhizosphere of many plants 20 soil samples collected from rice rhizosphere region, we isolated Azotobacter strains Among strains of Azotobacter tested, two strains AZT1 and AZT7 that had the highest ability of N-fixing and synthesis of IAA After 72 hours of incubation at 30oC, on Ashby medium with 2% glucose, pH 7, AZT1 and AZT7 strains have capable of N-fixing at the level of 3.36 mg/l and 3.32 mg/l, and synthesis of IAA at 10.11 µg/ml and 12.87 µg/ml, respectively Moreover, AZT1 and AZT7 strains have enzyme activity phosphatase, cellulase Keywords: Azotobacter sp., bacteria, IAA, isolation, nitrogen fixing Người phản biện Ngày nhận Ngày phản biện Ngày định đăng : PGS.TS Vũ Quang Nam : 28/8/2015 : 15/9/2015 : 20/9/2015 TẠP CHÍ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ LÂM NGHIỆP SỐ 4-2015 ... WITH THE ABILITY OF NITROGEN FIXING AND SYNTHESIS OF INDOLE ACETIC ACID (IAA) Nguyen Thi Thu Hang, Nguyen Thi Thuy SUMMARY Azotobacter sp are soil bacterium, Gram-negative, motile, aerobic respiration... định hàm lượng IAA môi trường theo phản ứng màu với thu? ??c thử Salkowski III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Phân lập vi khuẩn Azotobacter Từ 20 mẫu đất thu thập ruộng trồng lúa, phân lập 14 chủng vi khuẩn... ml, ni lắc l 125 o vịng/phút 30 C 72 Ly tâm thu t dịch + xác định nồng độ NH4 cố định chủng Azotobacter dịch d nuôi cấy phương pháp so màu với ới thu? ??c thử Nessler, Nessler sử dụng đường chuẩn