(Luận án tiến sĩ) phân lập và tuyển chọn vi khuẩn bản địa có khả năng cố định đạm và tổng hợp iaa để canh tác rau ở sóc trăng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ LÊ THỊ XÃ PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN BẢN ĐỊA CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM VÀ TỔNG HỢP IAA ĐỂ CANH TÁC RAU Ở SÓC TRĂNG LUẬN ÁN NGHIÊN CỨU SINH CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH 62420201 NĂM 2021 luan an BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ LÊ THỊ XÃ PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN VI KHUẨN BẢN ĐỊA CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM VÀ TỔNG HỢP IAA ĐỂ CANH TÁC RAU Ở SÓC TRĂNG LUẬN ÁN NGHIÊN CỨU SINH CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ NGÀNH 62420201 NGƢỜI HƢỚNG DẪN PGS.TS NGUYỄN KHỞI NGHĨA TS PHẠM NGỌC TÚ NĂM 2021 luan an PHẦN KÝ DUYỆT Cần Thơ, ngày tháng năm 2021 NGƢỜI HƢỚNG DẪN CHÍNH PGS.TS NGUYỄN KHỞI NGHĨA luan an NGHIÊN CỨU SINH LÊ THỊ XÃ LỜI CẢM TẠ Để hoàn thành luận án tốt nghiệp, ngồi nỗ lực thân, tơi cịn nhận giúp đỡ nhiệt tình nhiều cá nhân tập thể Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành sâu sắc đến tập thể cá nhân có tên góp sức để giúp đỡ tơi hồn thành nghiên cứu luận án Đầu tiên quan trọng nhất, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình người thân yêu đồng hành, chia sẻ, nhẫn nại, tình yêu hỗ trợ tinh thần, tài suốt q trình học tập, nghiên cứu bốn năm qua Xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến hai cán hướng dẫn PGS.TS Nguyễn Khởi Nghĩa-Phó trưởng mơn Khoa học Đất, khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ TS Phạm Ngọc Tú-Viện Lúa Đồng sông Cửu long Đặc biệt PGS.TS Nguyễn Khởi Nghĩa- người Thầy tận tình hướng dẫn, đóng góp ý kiến quý báu, hỗ trợ phương tiện nghiên cứu, đồng thời truyền đạt kinh nghiệm tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt q trình thực luận án trình viết báo khoa học Xin gửi lời cảm ơn đến em Nguyễn Thị Kiều Oanh, Ngô Thị Phương Thảo, Đỗ Thành Luân, Đặng Thị Yến Nhung, Nguyễn Thị Thu Hà, Nguyễn Hoàng Kim Nương cán nghiên cứu thuộc phịng thí nghiệm Vi sinh vật Đất, môn Khoa học đất, khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ em sinh viên ngành Khoa học Đất khố 41 thuộc mơn Khoa học Đất, khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ gồm Giang Yến Anh, Thị Hạnh Nguyên, Nguyễn Thị Thuý Cầm em học viên cao học Quách Thị Trúc Ly ngành Sinh thái học khố 24 thuộc mơn Sinh học, khoa Khoa học tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ hỗ trợ tơi thực thí nghiệm nghiên cứu Xin cảm ơn em Nguyễn Thị Kiều Anh nghiên cứu viên phịng thí nghiệm vi sinh vật đất, môn Khoa học đất, khoa Nơng nghiệp, trường Đại học Cần Thơ, em Trần Hồng Ty học viên cao học lớp Sinh thái học khoá 25 thuộc môn Sinh học, khoa Khoa học tự nhiên, trường Đại học Cần Thơ, em Lâm Thanh Tâm sinh viên ngành khoa học đất khố 41 mơn Khoa học đất, khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ, em sinh viên lớp Bảo vệ Thực vật khố 43 thuộc mơn Bảo vệ thực vật, khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ hỗ trợ tơi thí nghiệm nhà lưới ngồi đồng Xin cảm ơn anh chị em nghiên cứu sinh khoá 2016-2020 thuộc viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ, đặc biệt em nghiên cứu sinh Trần Võ Hải Đường động viên, chia sẻ kinh nghiệm giúp đỡ tơi q trình hồn thành luận án nghiên cứu sinh loại hồ sơ suốt trình học tập luan an Xin chân thành cảm ơn Ban giám đốc, quý Thầy/Cô thuộc viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học trang bị cho kiến thức quý báu, động viên tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian học tập nghiên cứu Xin cảm ơn tập thể cán bộ, giảng viên, nghiên cứu viên phịng thí nghiệm Vi sinh vật Đất phịng thí nghiệm Hố học Đất thuộc môn Khoa học Đất, khoa Nông nghiệp, trường Đại học Cần Thơ chia sẻ kinh nghiệm, hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành nghiên cứu luận án Xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Sở Giáo dục Đào tạo, Sở Nội Vụ tỉnh Sóc Trăng Uỷ ban Nhân dân tỉnh Sóc Trăng tạo điều kiện để học tập nghiên cứu nâng cao trình độ Xin chân thành cảm ơn Lãnh đạo Khoa Sau Đại học Ban giám hiệu Trường Đại học Cần Thơ tạo điều kiện thuận lợi để học tập nghiên cứu suốt năm năm qua mái trường thân yêu Xin cảm ơn Ban giám hiệu, tập thể giảng viên cán trường Cao đẳng Sư phạm Sóc Trăng, trường Cao đẳng Cộng đồng Sóc Trăng động viên tạo điều kiện cho học tập, nghiên cứu thời gian qua Xin trân trọng cảm ơn với lòng thành kính nhất! luan an LỜI BẢN QUYỀN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu thân nghiên cứu sinh hướng dẫn PGS TS Nguyễn Khởi Nghĩa TS Phạm Ngọc Tú Các số liệu trình bày luận án trung thực chưa công bố công trình nghiên cứu hay luận văn trước Cán hƣớng dẫn PGS.TS Nguyễn Khởi Nghĩa Cán hƣớng dẫn TS Phạm Ngọc Tú luan an Tác giả luận án Lê Thị Xã TÓM LƢỢC Mục tiêu nghiên cứu nhằm đánh giá hai chức cố định đạm tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA) số hệ vi sinh vật địa (indigenous microorganism-IMO) thu thập từ hệ thống canh tác trồng khác Sóc Trăng đồng thời phân lập, tuyển chọn dịng vi khuẩn có chức IMO có khả kích thích sinh trưởng, làm tăng suất rau muống cải xanh trồng Sóc Trăng Mơi trường Burks khuyết đạm sử dụng để phân lập vi khuẩn cố định đạm phương pháp so màu phản ứng với thuốc thử phenol nitroprusside Salkowski để xác định hàm lượng đạm IAA môi trường lỏng bước sóng 636 nm 530 nm Khả kích thích hạt nảy mầm kích sinh trưởng rau muống cải xanh dòng vi khuẩn IMO tuyển chọn đánh giá điều kiện phịng thí nghiệm, nhà lưới ngồi đồng Kết nghiên cứu cho thấy hệ IMO thu thập từ hệ thống trồng khác tỉnh Sóc Trăng có đa dạng vi khuẩn, nấm xạ khuẩn Trong vi khuẩn nhóm diện với mật số cao đa dạng hai nhóm cịn lại Ngồi ra, kết khơng có diện nhóm vi khuẩn gây bệnh đường ruột cho người Salmonella, Shigella, E coli Coliform hệ IMO thu thập Đặc biệt, tất hệ IMO khảo sát cho thấy chúng có chức tổng hợp IAA cố định đạm có diện nhóm vi khuẩn mang gen nifH với mật số vi khuẩn cố định đạm dao động từ 106-108 cfu.g-1 Trong đó, Luận án phân lập 44 dịng vi khuẩn có chức cố định đạm, tổng hợp IAA tuyển chọn 10 dòng vi khuẩn tốt chúng thuộc chi: Bacillus, Klebsiella, Paenibacillus, Paraburkholderia Pseudomonas Kết đánh giá điều kiện phịng thí nghiệm cho thấy hệ IMO tuyển chọn dòng vi khuẩn tuyển chọn gồm Paraburkholderia tropica TP-1.3, Paenibacillus cineris TP-1.4, Bacillus megaterium MQ-2.5, Klebsiella pneumoniae MT-16.5, Bacillus megaterium OM-17.5, cho hiệu tương đương kích thích gia tăng tỷ lệ nảy mầm hạt rau muống (14-15%) hạt cải xanh (3-5%), làm tăng chiều cao thân, chiều dài rễ sinh khối tươi rau Kết thí nghiệm nhà lưới cho thấy dịng vi khuẩn tuyển chọn cho hiệu kích thích sinh trưởng tốt hệ IMO dòng vi khuẩn TP-1.3, TP-1.4 MQ-2.5 giúp giảm 25% lượng phân đạm bón theo khuyến cáo cho suất rau tương đương với nghiệm thức bón 100% NPK khuyến cáo Đặc biệt, điều kiện đồng ba dòng vi khuẩn tuyển chọn giúp tăng suất rau muống cải xanh từ 1020% dù bón giảm 25% lượng đạm theo khuyến cáo, đồng thời giúp giảm lượng nitrate lưu tồn rau từ 40-60% so với nghiệm thức đối chứng Tóm lại, ứng dụng dòng vi khuẩn TP-1.3, TP-1.4, MQ-2.5 hỗn hợp chúng canh tác rau rau an tồn tỉnh Sóc Trăng Từ khố: cải xanh, kích thích sinh trưởng trồng, rau muống, vi khuẩn cố định đạm, vi khuẩn tổng hợp IAA, vi sinh vật địa luan an ABSTRACT The main objective of this study was to evaluate some of basic functions of several indigenous microorganism (IMOs) collected from different crop farming systems in Soc Trang as well as to isolate and select indigenous bacteria capable of fixing nitrogen and synthesizing IAA from these IMOs for plant growth promotion, yield enhancement of water spinach, mustard green in Soc Trang province N-free Burk’s medium was used to isolate nitrogen-fixing bacteria Nitrogen and IAA concentrations in liquid media were determined by phenol nitroprusside and Salkowski's reagent method at a wavelength of 636 and 530 nm with the help of spectrophotometer, respectively The seed germination rate, growth and yield performance testes were carried out under laboratory, greenhouse and field conditions The results showed that all collected IMOs had a diversity of three main microbial groups including bacteria, fungi and actinomyces In which, bacterial group was the most predominant one Moreover, there was no presence of bacterial group causing human intestinal infections such as Salmonella, Shigella, E coli and Coliform in all collected IMOs Besides, all IMOs revealed their good abilities in biological nitrogen fixation, IAA synthesis Especially, all IMOs were found the sequence of nifH gene with the number of N-fixing bacteria varied 106-108 cfu.g-1 Therefore, a total of 44 bacterial strains capable of both fixing nitrogen and synthesizing IAA were isolated and identified the most 10 outstanding bacteria, they belonged to different genera including Bacillus, Klebsiella, Paenibacillus, Paraburkholderia, and Pseudomonas The results of laboratory conditions test indicated that five selected IMO and the best selected isolates included Paraburkholderia tropica TP-1.3, Paenibacillus cineris TP1.4, Bacillus megaterium MQ-2.5, Klebsiella pneumoniae MT-16.5 and Bacillus megaterium OM-17.5, equally effective in stimulating germination of water spinach seeds (14-15%) and mustard green seeds (3-5%), Besides, they also helped to increase stem height, root length and fresh biomass of water spinach and mustard green The pot experiment showed that isolated strains were more effective than IMOs in stimulating growth, in which strains, TP-1.3, TP-1.4, and MQ-2.5 were the best bacterial isolates identified as bio-stimulant agents in order to reduce 25% of the recommended chemical N fertilizer formula, but the yields, growth and development of vegetables were remained similar as 100% recommended NPK formula treatment Particularly, in the field, three selected bacterial strains showed their benefit in increasing the vegetable yield by 10-20% and reducing of 25% chemical N fertilizer and also helped to reduce from 40 to 60% of the total nitrate in fresh vegetables In short, these three outstanding bacterial isolates and their mixture can be exploited for safe and clean vegetable cultuvation in Soc Trang province Key words: IAA synthesizing bacteria, indigenous microorganisms, mustard green, nitrogen fixing bacteria, plant growth promotion, water spinach luan an MỤC LỤC MỤC LỤC .i DANH SÁCH BẢNG vii DANH SÁCH HÌNH .x DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT .xii CHƢƠNG GIỚI THIỆU .1 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu 1.4 Nội dung nghiên cứu 1.5 Tính cấp thiết luận án 1.6 Đóng góp luận án 1.7 Ý nghĩa khoa học thực tiễn luận án CHƢƠNG LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Điều kiện địa lí tự nhiên tỉnh Sóc Trăng 2.2 Định hƣớng phát triển rau Sóc Trăng 2.3 Tổng quan rau 2.3.1 Giá trị dinh dưỡng 2.3.2 Giá trị kinh tế 2.3.3 Yêu cầu đất trồng, dinh dưỡng, phân bón nước canh tác rau 10 2.3.4 Nhu cầu đạm rau ăn 10 2.3.5 Cây rau muống 11 2.3.6 Cây cải xanh 11 2.4.Vai trị vi sinh vật kích thích sinh trƣởng thực vật trồng 13 2.4.1 Vi khuẩn kích thích sinh trưởng thực vật 13 2.4.2 Cố định đạm 14 2.4.2.1 Định nghĩa trình cố định đạm 14 2.4.2.2 Enzyme nitrogenase trình cố định đạm 15 2.4.2.3 Gen nif cố định đạm 16 2.4.2.4 Cơ chế trình cố định đạm 18 2.4.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình cố định đạm 19 2.4.2.6 Vi sinh vật cố định đạm 19 2.4.3 Tổng hợp indole-3-acetic acid 26 2.4.3.1 Vai trò sinh lý auxin 26 2.4.3.2 Vi sinh vật tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA) 27 2.4.3.3 Các đường tổng hợp IAA vi sinh vật 28 2.4.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình tổng hợp IAA 29 2.4.4 Các nghiên cứu, ứng dụng vi khuẩn cố định đạm tổng hợp IAA nước 31 2.4.4.1 Ngoài nước 31 i luan an 2.4.4.2 Trong nước 32 2.5 Hệ vi sinh vật địa IMO 34 2.5.1 Lịch sử nghiên cứu 34 2.5.2 Vai trò chức IMO trồng 34 2.5.3 Các nghiên cứu ứng dụng IMO nước 36 2.5.3.1 Nghiên cứu ứng dụng IMO nước 36 2.5.3.2 Nghiên cứu ứng dụng IMO Việt Nam 38 2.6 Đa dạng vi sinh vật 39 2.6.1 Khái niệm đa dạng vi sinh vật vai trò đa dạng vi sinh vật đất 39 2.6.2 Phương pháp đánh giá đa dạng vi sinh vật 40 2.6.2.1 Phương pháp truyền thống đánh giá đa dạng vi vinh vật 40 2.6.2.2 Phương pháp sinh học phân tử đánh giá đa dạng vi sinh vật 41 2.6.2.3 Phương pháp phân tích đa dạng vi sinh vật dựa vào giải trình tự acid nucleic đoạn gen mã hóa 16S-rRNA 41 2.6.2.4 Phương pháp điện di theo gradient biến tính (DGGE TGGE) 42 CHƢƠNG PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP 45 3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu 45 3.1.1 Thời gian địa điểm 45 3.1.2 Vật liệu nghiên cứu 45 3.1.3 Dụng cụ, thiết bị hoá chất 45 3.1.3.1 Dụng cụ 45 3.1.3.2 Thiết bị 45 3.1.3.3 Hoá chất 46 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 46 3.2.1 Nội dung 1: Khảo sát đa dạng nhóm vi sinh vật hệ IMO thu thập 47 3.2.1.1 Thu thập nguồn vi sinh vật địa IMO 47 3.2.1.2 Khảo sát đa dạng nhóm vi khuẩn, nấm xạ khuẩn hệ IMO phương pháp PCR 48 3.2.1.3 Đánh giá đa dạng vi khuẩn, nấm xạ khuẩn hệ IMO thu thập phương pháp nested-PCR kết hợp DGGE 50 3.2.1.4 Khảo sát mật số vi khuẩn, nấm xạ khuẩn hệ IMO thu thập 52 3.2.1.5 Khảo sát diện số vi khuẩn gây bệnh (Coliform, E coli, Salmonella Shigella) hệ IMO thu thập 53 3.2.2 Nội dung 2: Khảo sát đánh giá số chức kích thích sinh trưởng trồng hệ IMO thu thập 54 3.2.2.1 Khảo sát khả tổng hợp hormone thực vật IAA hệ IMO thu thập 54 3.2.2.2 Khảo sát khả cố định đạm hệ IMO thu thập 55 3.2.3 Nội dung 3: Phân lập, tuyển chọn định danh dịng vi khuẩn địa có chức cố định đạm tổng hợp IAA từ hệ IMO thu thập 56 ii luan an C Xạ khuẩn *Chú thích: 1: IMO tre; 2: IMO luân canh; 3: IMO chuối; 4: IMO hành tím; 5: IMO rau; 6: IMO lúa; 7: IMO dưa hấu; 8: IMO cỏ hoang; 9: IMO bắp; 10: IMO rau; 11: IMO cam; 12: IMO bưởi; 13: IMO ổi; 14: IMO mía luan an Phụ lục Hình thái khuẩn lạc hình dạng tế bào 83 dịng vi khuẩn phân lập sau ngày nuôi cấy môi trường Burks Hình thái khuẩn lạc mơi trường Burks STT Ký hiệu Tế bào VK Kích thước Hình dạng Màu sắc Rìa Nổi/lài Bề mặt Hình dạng Gram TP-1.1 0.2 Trịn Trắng mờ ngun bóng trơn que dài - TP-1.8 0.3 Trịn Trắng ngun bóng trơn que ngắn - TP-1.2 0.3 Tròn Trắng mờ nguyên bóng trơn que ngắn - TP-1.3