Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA từ cây lúa

Nghiên cứu Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn nội sinh có khả năng cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA từ cây lúa tiến hành phân tích 30 chủng vi khuẩn đã được phân lập trên môi trường RMR (Rennie medium supplemented with rice extract and malate) từ thân, lá, rễ của các giống lúa trồng tại Gia Lâm – Hà Nội. Kết quả cho thấy, ba chủng N6, N15, N26 có các khả năng cố định đạm, phân giải lân và tổng hợp IAA tốt nhất. Mời bạn tham khảo chi tiết.

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG VI KHUẨN NỘI SINH CÓ KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM, PHÂN GIẢI LÂN, TỔNG HỢP IAA TỪ CÂY LÚA Phạm Thị Hải1, Nguyễn Thị Sơn1, Nguyễn Quang Thạch1 ABSTRACT Currently, application of endophytic bacteria which has capable of nitrogen fixing, phosphate solubilizing, IAA synthesizing is one of effective solutions in agricultural production Using this method, chemical fertilizers are reduced; the environment is fresh and production cost is saved Besides, the yield and quality of crops are also increased In this research, 30 endophytic bacterial strains were isolated on RMR medium from stems, leaves and roots of rice in Gialam, Hanoi The results indicated that three endophytic bacteria strains N6, N15, N26 with the best ability of nitrogen fixing, phosphate solubilizing and IAA synthesizing were selected All three strains showed the highest activity at pH=7 after days inoculation At both 32oC and 37oC, the ability of nitrogen fixing is the best, while the optimum temperature for phosphate solubilizing is at 32 oC and IAA synthesizing is at 37oC Keyword: nitrogen fixing, phosphate solubilizing, IAA synthesizing, rice endophytic bacteria TÓM TẮT Sử dụng chủng vi khuẩn nội sinh có khả cố định đạm, phân giải lân tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA) biện pháp có hiệu sản xuất nông nghiệp Biện pháp giảm tải việc sử dụng q nhiều phân hóa học, khơng gây nhiễm mơi trường, tiết kiệm chi phí sản xuất đảm bảo chất lượng đồng thời tăng suất trồng Trong nghiên cứu này, 30 chủng vi khuẩn phân lập môi trường RMR (Rennie medium supplemented with rice extract and malate) từ thân, lá, rễ giống lúa trồng Gia Lâm – Hà Nội Kết cho thấy, ba chủng N6, N15, N26 có khả cố định đạm, phân giải lân tổng hợp IAA tốt Cả chủng thể hoạt tính nói cao sau ngày nuôi cấy pH =7 Ở nhiệt độ 32oC 37oC, chủng có khả cố định đạm mạnh Tuy nhiên, phân giải lân mạnh diễn 32oC tổng hợp IAA mạnh 37oC Từ khóa: vi khuẩn nội sinh lúa, cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA ĐẶT VẤN ĐỀ Để giảm tải việc sử dụng nhiều phân hóa học sản xuất lúa, việc sử dụng chủng vi khuẩn nội sinh có khả cố định đạm, phân giải lân tổng hợp IAA biện pháp có hiệu mà khơng gây ô nhiễm môi trường, tiết kiệm chi phí sản xuất đảm bảo chất lượng đồng thời tăng suất trồng Vi khuẩn nội sinh vi khuẩn trải qua phần lớn vòng đời trồng (Quispel, 1992) Vi khuẩn nội sinh xem vi khuẩn tập trung mô thực vật mà khơng có dấu hiệu nhiễm bệnh hay hậu tiêu cực chủ (Schuluz Boyle, 2005) Trên giới, nhiều vi khuẩn nội sinh tìm thấy rễ, vùng rễ thân lúa Azospirillum sp., Burkholderia sp., Enterobacter sp., Herbaspirillium sp., Klebsiella sp…(Koomnok et al., 2007; Mano Morisaki, 2008) Ở Việt Nam, đặc biệt vùng đồng sông Cửu Long có nhiều nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn nội sinh lúa phân lập Burkholderia vietnamiensi, Azospirillum lipoferum từ lúa trồng miền Nam Việt Nam (Van et al., Học viện Nông nghiệp Việt Nam 497 1994; Cao Ngọc Điệp et al., 2007) Tuy nhiên, việc nghiên cứu loài vi khuẩn nội sinh hữu ích lúa trồng đồng sông Hồng chưa tập trung nghiên cứu VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1.Vật liệu Thân, rễ mẫu lúa Gia Lâm Hóa chất: Cồn, HgCl2, H2O2, Mg(SO4)2, KH2PO4, K2HPO4, CaCl2, NaOH, Na2SO4, (NH4)2SO4, Ca3(PO4)3,… 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phân lập chủng vi khuẩn Chọn mẫu lúa giai đoạn tăng trưởng mạnh Sau rửa lúa vịi nước chảy cho đất bám thân rễ, bảo quản 40C Sau cắt rời thân, rễ thành đoạn nhỏ, khử trùng bề mặt thân, lá, rễ cồn 70% phút, rửa nước cất vô trùng Tiếp đến cho HgCl2 0.1%, lắc nhẹ phút, rửa nước cất vô trùng Làm tương tự với hydrogen peroxide (H2O2) 3%, sau rửa lần nước cất vơ trùng Để kiểm tra vi sinh vật cịn sót lại bề mặt thân, lá, rễ lúa sau khử trùng: 200 µl nước cất vơ trùng rửa mẫu lần cuối cấy lên đĩa chứa môi trường Tryptone Yeast extract – glucose agar ủ 300C 24 Nếu sau 24 giờ, đĩa môi trường không xuất khuẩn lạc mẫu thân rễ khử trùng đạt yêu cầu Mẫu thân, rễ sau khử trùng cho vào cối vô trùng, giã nhuyễn, thêm 1ml nước cất vô trùng vào cối, trộn hút dịch trích mẫu cho vào tube 1,5ml vơ trùng Hút 50µl dịch trích mẫu cho vào đĩa mơi trường RMR sau dùng que chang chang lên mặt thạch, ủ 300C khoảng 1-2 ngày Sau 1-2 ngày, chọn khuẩn lạc (khác hình dạng, màu sắc, kích thước) từ đĩa mơi trường cấy chuyển nhiều lần đến khuẩn lạc rời Cấy chủng vi khuẩn vào ống nghiệm chứa môi trường RMR đặc giữ 40C (Cao Ngọc Điệp, 2011) 2.2.2 Xác đinh khả cố định đạm phương pháp Indophenol blue Hút 0,5ml phần dịch sau ly tâm dịch nuôi vi khuẩn cho vào ống nghiệm chứa sẵn 2ml nước cất khử trùng cộng với 0,5 ml EDTA Thêm 1ml dung dịch Phenol nitroprusside 2ml dung dịch Sodium hypocloride vào ống, trộn dung dịch máy Vortex Để ổn định nhiệt độ phòng khoảng 30 phút Sau tiến hành đo OD bước sóng 636nm (OD636nm) Kết đo OD dòng vi khuẩn thay vào phương trình đồ thị đường chuẩn, từ suy hàm lượng ammonium sinh dung dịch (Page et al., 1982) 2.2.3 Xác định khả hòa tan lân phương pháp acid ascorbi Hút 0,5ml phần dịch sau ly tâm dịch, nuôi vi khuẩn cho vào ống nghiệm chứa sẵn ml nước cất khử trùng Sau nhỏ 4ml hỗn hợp thuốc thử (H2SO4 5N, K(SbO)C4H4O6.1/2H2O, (NH4)6Mo7O24.4H2O,Acid Ascorbic 0,1M), trộn dung dịch máy Vortex Để ổn định nhiệt độ phịng khoảng 30 phút Sau tiến hành đo OD bước sóng 880 nm (OD880nm) Kết đo OD dòng vi khuẩn thay vào phương trình 498 đồ thị đường chuẩn, từ suy hàm lượng PO43- dung dịch (Murphy and Riley, 1977) (Cao Ngọc Điệp, 2011) 2.2.4 Xác định khả tổng hợp IAA vi khuẩn phương pháp Salkowski Hút 1ml phần dịch sau ly tâm lạnh (40C) dịch nuôi vi khuẩn cho vào ống nghiệm chứa sẵn 2ml thuốc thử Salkowski (H2SO4 10,8M FeCl3), trộn máy vortex Ủ hỗn hợp tối 10-15 phút để phản ứng xảy hồn tồn Tiến hành đo OD bước sóng 530nm (OD530nm) Kết đo OD dòng vi khuẩn thay vào phương trình đồ thị đường chuẩn IAA, từ suy hàm lượng IAA sinh dung dịch (Glickmann Dessaux, 1995) 2.2.5 Khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy, nhiệt độ, pH đến hoạt tính cố định đam, phân giải lân, tổng hợp IAA chủng vi khuẩn tuyển chọn Các chủng vi khuẩn nuôi cấy môi trường Burk không đạm, NBRIP, King B 1; 2; 3; 4; 5; ngày, dải nhiệt độ 25; 32; 37; 450C, dải pH, 5; 6; 7; 8; lắc 120 vịng/phút Sau tiến hành kiểm tra hoạt tính cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA chủng vi khuẩn tuyển chọn 2.2.6 Khảo sát ảnh hưởng môi trường, nhiệt độ, pH đến khả sinh trưởng, phát triển chủng có khả cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA cao Các chủng vi khuẩn nuôi cấy loại môi trường khác Nfb, King B, Fallik dải nhiệt độ 25; 32; 37; 450C, dải pH 5; 6; 7; 8; 9, lắc 120 vòng/phút Tiến hành đo OD 660nm sau 48h nuôi cấy để kiểm tra khả sinh trưởng chủng vi khuẩn tuyển chọn KẾT QUẢ 3.1 Phân lập chủng vi khuẩn Từ thân, rễ mẫu lúa phân lập 30 chủng vi khuẩn môi trường RMR gồm 13 chủng từ mẫu rễ, 10 chủng từ thân chủng từ mẫu Đặc điểm khuẩn lạc tế bào chủng thể hiển bảng sau Bảng 1: Đặc điểm khuẩn lạc tế bào chủng vi khuẩn phân lập TT 10 Chủng N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 N10 Nguồn phân lập Lá Lá Lá Lá Lá Lá Lá Thân Thân Thân Đặc điểm tế bào Đặc điểm khuẩn lạc Kích thước Tròn 1,5 Tròn 1,5 Tròn Tròn Khơng 1,5 Trịn Trịn Trịn Trịn Khơng Hình dạng Bề mặt khuẩn lạc Trắng trong, có nhân Trắng trong, nhầy Trắng đục,có nhân Trắng đục Trắng đục Trắng trong, nhầy Trắng đục, có nhân Trắng Trắng đục Trắng 499 Mép khuẩn lạc Bằng phẳng Bằng phẳng Bằng phẳng Bằng phẳng Nhăn Bằng phẳng Bằng phẳng Nhăn Bằng phẳng Bằng phẳng Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 N11 N12 N13 N14 N15 N16 N17 N18 N19 N20 N21 N22 N23 N24 N25 N26 N27 N28 N29 N30 Thân Thân Thân Thân Thân Thân Thân Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Rễ Trịn Khơng Trịn Khơng Trịn Trịn Trịn Tròn Tròn Tròn Tròn Tròn Tròn Tròn Tròn Tròn Tròn Tròn Tròn tròn 1,5 2,5 1,5 1,5 1,5 1 1,5 1,5 1,5 2 1,5 1,5 Trắng đục Trắng Trắng Trắng đục Trắng đục Trắng đục,có nhân Trắng trong, nhầy Trắng đục Trắng đục Trắng đục,có nhân Trắng Trắng trong, lan Trắng Trắng đục Trắng đục, lan Trắng đục Trắng trong, có nhân Trắng trong, nhầy Trắng đục,có nhân Trắng đục Nhăn Bằng phảng Nhăn Bằng phẳng Bằng phẳng Nhăn Bằng phẳng Nhăn Bằng phẳng Nhăn Nhăn Bằng phẳng Bằng phẳng Bằng phẳng Bằng phẳng Nhăn Bằng phẳng Bằng phẳng Nhăn Nhăn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Hình 1: Hình ảnh khuẩn lạc chủng N6, N26 3.2 Khả cố định đạm chủng vi khuẩn Từ 30 chủng vi khuẩn phân lập tuyển chọn 19 chủng có khả cố định đạm Có 5/19 chủng có khả tổng hợp NH4+ mạnh chủng N15 (1,797mg/l), N26 (1,526mg/l), N9 (1,429mg/l), N28 (1,243mg/l), N2 (1,187mg/l)/l Hình 2: Đồ thị biểu hàm lượng NH4+tổng hợp chủng vi khuẩn Hình 3: Khả tổng hợp NH4+của chủng vi khuẩn 500 3.3 Khả phân giải lân chủng vi khuẩn Kết khảo sát khả phân giải lân 30 chủng vi khuẩn cho thấy 19 chủng có khả phân giải lân 19 chủng vi khuẩn có khả phân giải lân có chủng N6, N26, N23, N21 có khả phân giải lân mạnh tương ứng 7,784mg/l; 6,992 mg/l; 6,014mg/l; 4,197mg/l Kết thấp nhiều so với nghiên cứu Lăng Ngọc Dậu (2006) chủng vi khuẩn nội sinh phân lập từ thân rễ lúa mùa cao sản mơi trường Nfb với lượng lân hịa tan cao đạt tới 1334,51mg/l Hình 4: Hàm lượng PO43-phân giải chủng vi khuẩn Hình 5: Khả phân giải lân chủng vi khuẩn 3.4 Khả tổng hợp IAA Nhận thấy, chủng vi khuẩn có khả sinh tổng hợp IAA, hàm lượng IAA sinh dao động từ 3,75 đến 14,67mg/l Các chủng N15, N26, N6 có hàm lượng IAA mạnh tương ứng với 14,67mg/l;13,52mg/l; 12,92mg/l Khả sinh tổng hợp IAA chủng vi khuẩn phân lập thấp chủng vi khuẩn phân lập từ rễ thân lúa phân lập môi trường Nfb Lăng Ngọc Dậu (2006) (15,61mg/l) Hình 6: Hàm lượng IAA tổng hợp chủng vi khuẩn 3.5 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy, nhiệt độ, pH đến khả cố định đạm, phân giải lân tổng hợp IAA chủng vi khuẩn tuyển chọn 3.5.1 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả cố định đạm, phân giải lân tổng hợp IAA chủng vi khuẩn tuyển chọn 501 Thời gian nuôi cấy có ảnh hưởng lớn đến khả sinh cố định đạm, phân giải lân tổng hợp IAA chủng vi khuẩn Hoạt tính chủng vi khuẩn tăng theo thời gian từ ngày thứ hai đến ngày thứ sau lại giảm dần đạt giá trị cao ngày thứ Hàm lượng NH4+ tổng hợp chủng N15 đạt 1,807mg/l chủng N26 đạt 1,529mg/l Hàm lượng PO43-phân giải chủng N6 đạt 7,907 mg/l, chủng N26 đạt 7,050 mg/l Hàm lượng IAA chủng N6 đạt 13,58 mg/l, chủng N15 đạt 15,42, chủng N26 đạt 14,50mg/l Hình 7: Ảnh hưởng thời gian đến khả tổng hợp NH4 + chủng vi khuẩn tuyển chọn Hình 8: Ảnh hưởng thời gian đến khả phân giải lân chủng vi khuẩn tuyển chọn Hình 9: Ảnh hưởng thời gian đến khả tổng hợp IAA chủng vi khuẩn tuyển chọn 3.5.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA chủng vi khuẩn tuyển chọn Kết nghiên cứu cho thấy nhiệt độ có ảnh hưởng tới khả cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA chủng vi khuẩn Nhiệt đội thích hợp cho khả cố định đạm chủng N15 320C, chủng N26 370C Các chủng có khả phân giải lân mạnh 320C Ba chủng vi khuẩn tổng hợp IAA cao 370C Hình 10: Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả cố định đạm chủng vi khuẩn tuyển chọn Hình 11: Ảnh hưởng nhiệt độ đến phân giải lân chủng tuyển chọn 502 Hình 12: Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả tổng hợp IAA chủng vi khuẩn tuyển chọn 3.5.3 Ảnh hưởng pH đến khả cố định đạm, phân giải lân tổng hợp IAA chủng vi khuẩn tuyển chọn Từ đồ thị ta nhận thấy ba chủng vi khuẩn có khả năng cố định đạm, phân giải lân tổng hợp IAA mạnh pH =7, nồng độ NH4+ chủng N15 đạt 1,714mg/l, chủng N26 đạt 1,524mg/l Nồng độ PO43- phân giải chủng N6 đạt 5,456mg/l, chủng N26 đạt 6,973mg/l Nồng độ IAA tổng hợp chủng đạt N6: 12,42mg/l, N15: 14,92mg/l, N26: 13,83mg/l Hình 13: Ảnh hưởng pH đến khả cố định đạm chủng vi khuẩn tuyển chọn Hình 14: Ảnh hưởng pH đến khả phân giải lân chủng vi khuẩn tuyển chọn Hình 15: Ảnh hưởng pH đến khả tổng hợp IAA chủngvi khuẩn tuyển chọn 503 KẾT LUẬN Trên môi trường RMR, từ phận rễ, thân, lúa phân lập 30 chủng vi khuẩn nội sinh gồm 13 chủng từ mẫu rễ, 10 chủng từ thân chủng từ mẫu Đã đánh giá khả cố định đạm, phân giải lân, sinh IAA chủng phân lập tuyển chọn chủng có hoạt tính cố định đạm, phân giải lân, sinh IAA cao nhất: N6, N15, N26 Cả chủng cho hoạt tính cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA cao sau ngày nuôi cấy, pH =7 Các chủng cố định đạm mạnh tai 320C 370C, phân giải lân mạnh 320C, tổng hợp IAA mạnh 370C LỜI CẢM ƠN Chúng xin chân thành cảm ơn GS.TS Cao Ngọc Điệp hỗ trợ phương pháp nghiên cứu để cơng trình hồn thành TÀI LIỆU THAM KHẢO Cao Ngọc Điệp, Phạm Thị Khánh Vân Lăng Ngọc Dậu, (2007) Phát vi khuẩn Azospirillum lipoferum nội sinh lúa mùa cao sản (Oryza sativa L.) trồng đồng sông Cửu Long Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc Nghiên cứu khoa học sống, Quy Nhơn 10-08-2007, NXB KH-KT, trang 456-459 Cao Ngọc Điệp, (2011) Vi khuẩn nội sinh thực vật (Endophytic bacteria) NXB Đại học Cần Thơ, trang 1-48 Lăng Ngọc Dậu, (2006) Đánh giá khả cố định đạm, hòa tan lân tổng hợp IAA vi khuẩn sống rễ thân lúa múa đặc sản đồng Sông Cửu Long Luận văn tốt nghiệp thạc sĩ ngành Công nghệ sinh học, Trường Đại học Cần Thơ Glickmann, E and Y Dessaux, (1995) A critical examination of the specificity of the salkowski reagent for indolic compounds produced by phytopathogenic bacteria Appl Environ Microbiol, 61(2):793-796 Murphy, J.;Riley, J R.Amodified, (1977) Single solutionmethod for determination of phosphate in natural waters Anal Chem.,27,31-36 the Page, L., R.H Miller and R.D Keeney, (1982) Methods for Soils Analysis, Part 2: Chemical and Microbial properties, 2nd edition American Society of Agronomy Incorporation USA Quispel A, (1992) A search of signal in endophytic microorganisms, In: Verma, DPS (Eds.) Molecular Signail in Plant-Microbe Communications, CRS Press, Boca Raton, FL p.475-491 Schuluz B Boyle C, (2005) The endophytic continuum Mycol Res 109: 661-686 Van, T.V., O Berge, S Ngo Ke, J Balandreau and T Heulin (2000), Repeated beneficial effects of rice inoculation with a strain of Burkholderia vietnamiensis on early and late yield component in low fertility sulphate acid soils of Viet Nam Plant Soil, 218:273-284 504 ... khả tổng hợp IAA chủng vi khuẩn tuyển chọn 3.5.3 Ảnh hưởng pH đến khả cố định đạm, phân giải lân tổng hợp IAA chủng vi khuẩn tuyển chọn Từ đồ thị ta nhận thấy ba chủng vi khuẩn có khả năng cố định. .. khả cố định đạm, phân giải lân, tổng hợp IAA chủng vi khuẩn Nhiệt đội thích hợp cho khả cố định đạm chủng N15 320C, chủng N26 370C Các chủng có khả phân giải lân mạnh 320C Ba chủng vi khuẩn tổng. .. NH4 +tổng hợp chủng vi khuẩn Hình 3: Khả tổng hợp NH4+của chủng vi khuẩn 500 3.3 Khả phân giải lân chủng vi khuẩn Kết khảo sát khả phân giải lân 30 chủng vi khuẩn cho thấy 19 chủng có khả phân giải