Phân lập và tuyển chọn chủng aureobasidium pullulans từ một số loại quả sinh tổng hợp ß glucan tan ngoại bào để bổ sung trong sản xuất thức ăn chăn nuôi

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC KINH TẾ - KỸ THUẬT CÔNG NGHIỆP NGÔ THU THUỶ PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG AUREOBASIDIUM PULLULANS TỪ MỘT SỐ LOẠI QUẢ SINH TỔNG HỢP βGLUCAN TAN NGOẠI BÀO ĐỂ BỔ SUNG TRONG SẢN XUẤT THỨC ĂN CHĂN NUÔI LUẬN VĂN THẠC SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM HÀ NỘI, NĂM 2021 BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC KINH TẾ - KỸ THUẬT CÔNG NGHIỆP NGÔ THU THUỶ PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG AUREOBASIDIUM PULLULANS TỪ MỘT SỐ LOẠI QUẢ SINH TỔNG HỢP βGLUCAN TAN NGOẠI BÀO ĐỂ BỔ SUNG TRONG SẢN XUẤT THỨC ĂN CHĂN NUÔI LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên ngành: Công nghệ thực phẩm Mã số: 8540101 Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS Hồ Tuấn Anh Người hướng dẫn khoa học 2: PGS.TS Vũ Văn Hạnh HÀ NỘI, NĂM 2021 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu kết nghiên cứu luâ ̣n văn khách quan, trung thực, kết từ q trình lao động thân tơi hướng dẫn PGS.TS Hồ Tuấn Anh PGS.TS Vũ Văn Hạnh Các thơng tin trích dẫn luận văn ghi rõ nguồn phần Tài liệu tham khảo Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm theo quy định nghiên cứu khoa học nội dung luận văn Hà Nội, ngày 01 tháng 12 HỌC VIÊN Ngô Thu Thuỷ i năm 2021 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận văn tơi nhận giúp đỡ tận tình thầy cơ, anh chị, bạn bè, đồng nghiệp người thân u gia đình Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Vũ Văn Hạnh, PGS.TS Hồ Tuấn Anh đã quan tâm, ta ̣o mo ̣i điề u kiê ̣n sở vật chất phịng thí nghiệm trực tiếp hướng dẫn thực đề tài nghiên cứu khoa học luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể thầy cô giáo Khoa Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học kinh tế - Kỹ thuật Công nghiệp cho tri thức quý báu q trình học tập nghiên cứu Tơi xin cảm ơn anh chị Phòng chất chức sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam giúp đỡ suốt trình thực luận văn Xin cảm ơn tập thể lớp cao học cơng nghệ thực phẩm khóa 2019-2021, bạn đồng nghiệp, gia đình người thân động viên, khích lệ giúp đỡ tơi hồn thành khóa học Hà Nội, ngày 01 tháng 12 năm 2021 HỌC VIÊN Ngô Thu Thuỷ ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN .i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC BẢNG vi DANH MỤC HÌNH vii MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4 1.1 Giới thiệu β-glucan tan 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Cấu trúc β-glucan tan 1.1.3 Ứng dụng β-glucan tan 1.2 Nấm Aureobasidium pullulans 1.3 Tổng quan cơng trình nghiên cứu ngồi nước 10 1.4 Cơ sở thực tiễn 14 CHƯƠNG 2: MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 17 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 3.1 Đối tượng nghiên cứu 18 3.1.1 Vật liệu .18 3.1.2 Dụng cụ, máy móc, thiết bị, hố chất 18 3.1.3 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật .18 3.2 Nội dung nghiên cứu 19 3.3 Phương pháp nghiên cứu kỹ thuật sử dụng 19 3.3.1 Phương pháp phân lập, làm chủng tuyển chọn vi sinh vật 19 3.3.2 Phương pháp sinh học phân tử để định danh chủng phân lập 25 3.3.3 Xác định điều kiện thành phần môi trường lên men chủng chọn lọc 26 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 iii 4.1 Phân lập, tuyển chọn chủng Aureobasidium pullulans spp có khả sinh tổng hợp β-glucan tan 28 4.2 Định danh đến loài chủng Aureobasidium pullulans spp tuyển chọn 38 4.3 Nghiên cứu điều kiện thành phần môi trường lên men chủng tuyển chọn 39 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Từ Viế t Tắt EPS Từ Tiếng Anh Nghiã Tiế ng Việt Polysaccharide ngoại bào Exopolysaccharide KLPT Khối lượng phân tử CNSH Công nghệ sinh học SHPT Sinh học phân tử GRAS Generally Regarded As Safe Được coi an toàn LAB Lactic Acid Bacteria Vi khuẩn lactic NC Negative Control Đối chứng âm PC Positive Coltrol Đối chứng dương PDA Potato dextrose agar Môi trường PDA YPD Yeast peptone dextrose Môi trường YPD PDB Môi trường PDB PSB Môi trường PSB MM Môi trường MM CJ Môi trường CJ PM Môi trường PM BBD Box-Behnken v DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 4.1 Khả sinh exopolysaccharide (EPS) ngoại bào chủng nấm men phân lập …………………………………… 28 Bảng 4.2 Khuẩn lạc tế bào chủng giả nấm men điển hình phân lập tiềm có nhiều đặc điểm giống Aureobasidium pullulans ……………………………………………….………… …… Bảng 4.3 Các biến giá trị thiết kế Box-Behnken thành phần môi trường lên men sản xuất β-glucan … 40 Bảng 4.4 Ma trận thiết kế Box-Behnken giá trị thực nghiệm sản lượng β-glucan chủng H8 …………… …… 30 41 Bảng 4.5 Phân tích phương sai mơ hình bậc hai bề mặt phản ứng để sản xuất β-glucan chủng H8 ………… …………… vi 42 DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 1.1 Cấu trúc EPS dạng β-(1,3;1,6) …………………… Hình 1.2: Nấm Aureobasidium pullulans đĩa thạch (ảnh phải) hình ảnh hiển vi điện tử quét (SEM) khuẩn ty bào tử nấm (ảnh trái) ………………………………………… Hình 1.3: Vịng đời A pullulans (Kocková-Kratochvílová et al., 1980) …………………………………………………… 8 Hình 1.4 Sơ đồ quy trình sản xuất β-glucan tan từ chủng Aureobasidium pullulans spp 16 Hình 3.1 Sơ đồ phân lập chủng giả nấm men …………… 20 Hình 3.2 Sơ đồ tách chiết EPS từ dịch lên men …………… 22 Hình 3.3 Sơ đồ kiểm tra hoạt tính enzyme ngoại bào chủng vi sinh vật …………………………………………… 24 Hình 3.4 Sơ đồ kiểm tra hoạt tính ức chế vi khuẩn gây bệnh chủng vi khuẩn phân lập ………………………… 25 Hình 4.1 Dịch lên men chủng nấm men phân lập ……… 32 10 Hình 4.2 Mật độ tế bào sinh khối chủng phân lập qua ngày lên men môi trường PM, nuôi lắc 180 rpm 28oC ……………………………………………………… 11 33 Hình 4.3 Khối lượng β-glucan sản xuất từ chủng phân lập sau ngày lên men khác (3, 4, ngày sau lên men) ………………………………………………………… 12 34 Hình 4.4 Khả kháng số chủng vi nấm kiểm định đĩa PDA, ủ 28°C, ngày chủng giả nấm men tiềm (H8, 58543, 58539 41291, 12017, 43382) ……… vii 35 13 Hình 4.5 Khả kháng chủng vi khuẩn kiểm định dịch lên men chủng nấm men đen (H8, 58543, 58539 41291, 12017, 43382), 37°C, 24 …………………………… 14 36 Hình 4.6 Khả sinh tổng hợp enzyme chủng nấm men phân lập (H5, H8, H12, H26, HY5, HY10) ủ 37°C, 24 ………………………………………………… 15 Hình 4.7 Cây phát sinh chủng loại chủng nấm men đen phân lập H8 ………………………………………………… 16 38 Hình 4.8 Ảnh hưởng loại môi trường khác đến khả sinh tổng hợp β-glucan chủng A pullulans H8… 17 37 39 Hình 4.9 Biểu đồ đường bao (bên trái) biểu đồ bề mặt phản ứng tương ứng (bên phải) tác động ba biến độc lập đến việc tạo β-glucan ………………………………… viii 44 Hình 4.6 Khả sinh tổng hợp enzyme chủng nấm men phân lập (H5, H8, H12, H26, HY5, HY10) ủ 37°C, 24 Từ kết thu cho thấy, chủng nấm men phân lập có khả sinh tổng hợp amylase yếu Hầu hết chủng có khả sinh tổng hợp cellulase lipase yếu trừ chủng H12 khả sinh tổng hợp cellulase Trong đó, hai chủng H5 H8 có khả sinh tổng hợp protease yếu Kết phù hợp với nghiên cứu Liu cộng cho thấy lipase từ A pullulans enzyme ngoại bào [24] Nấm men không trội khả sinh enzyme ngoại bào, hầu hết hãng sản xuất enzyme công nghiệp giới công bố việc ứng dụng vào sản xuất chủng vi khuẩn, vi khuẩn biến đổi gen nấm mốc Như vậy, chủng nấm men đen phân lập chủng giả nấm men có khả sinh tổng hợp số enzyme ngoại bào yếu, chủng H8 có khả sinh tổng hợp enzyme cellulase, lipase protease cao chủng cịn lại Chủng H8 vừa có khả sinh β-glucan tan cao, vừa có khả sinh enzyme ngoại bào cao chọn lọc để nghiên cứu tiếp 37 4.2 Định danh đến loài chủng Aureobasidium pullulans spp tuyển chọn DNA sử dụng làm khuôn để khuếch đại phần trình tự nucleotide vùng 18S 28S cặp mồi ITS1 ITS4, sau sản phẩm PCR làm đọc trình tự xây dựng phát sinh chủng loại Thu sinh khối chủng H8 dùng để tách DNA kit QIAgene DNA sử dụng làm khuôn để khuếch đại phần trình tự nucleotide vùng V1-V9 16S-rARN cặp mồi ITS1 ITS4, sau sản phẩm PCR làm đọc trình tự xây dựng phát sinh chủng loại Hình 4.7 Cây phát sinh chủng loại chủng nấm men đen phân lập H8 Sử dụng phần mềm Blast, MEGAX Clustal trình tự vùng ITS1ITS4 Aureobasidium đăng kí ngân hàng gene dùng để so sánh với vùng ITS chủng H8 Trình tự ITS mẫu H8 có độ tương đồng với chủng Aureobasidium pullulans đến 99% Chủng nấm men H8 so sánh đoạn trình tự ITS 1-4 giống với chủng Aureobasidium pullulans LR588473 38 genbank đến 99% Chủng nấm men H8 kết luận thuộc loài Aureobasidium pullulans 4.3 Nghiên cứu điều kiện thành phần môi trường lên men chủng tuyển chọn Trên loại môi trường khác YPD, PDB, PSB, MM, CJ, PM, chủng A pullulans H8 lên men theo mô tả mục 3.3.3, kết xác định khả sinh tổng hợp β-glucan chủng A pullulans H8 loại môi trường riêng biệt biểu thị hình 4.8 Hình 4.8 Ảnh hưởng loại môi trường khác đến khả sinh tổng hợp β-glucan chủng A pullulans H8 Chủng A pullulans H8 nuôi môi trường với thành phần khác Dữ liệu biểu thị dạng giá trị trung bình ± SD (n = 3) A- Khối lượng β-glucan thu B- Dịch sau ly tâm chủng A pullulans H8 môi trường khác tủa với 96% EtOH lạnh (1:2 v/v) Từ kết nghiên cứu cho thấy, β-glucan cho hàm lượng cao môi trường PM, nuôi lắc 180 rpm, 28ᵒC ngày, đạt 16,75 ± 0,56 g/L Môi trường PM cho khả sản xuất β-glucan cao so với mơi trường khác cịn lại YPD, YDB, PSB, MM CJ 39 Từ kết thu được, môi trường PM lựa chọn để tối ưu đáp ứng bề mặt dựa phần mềm Design Expert Môi trường lên men (PM) (g/L) gồm có: sucrose 30,0; (NH4)2SO4 5,0; KH2PO4 5,0; MgSO4 0,4; NaCl 1,0; cao nấm men 0,4 Những thành phần mơi trường sucrose, KH2PO4 (NH4)2SO4 sử dụng để triển khai nghiên cứu theo bảng 4.3 (Các biến giá trị thiết kế Box-Behnken thành phần môi trường lên men sản xuất β-glucan) Các thí nghiệm thực nhằm tối ưu hoá thành phần môi trường lên men, sử dụng thiết kế Box-Behnken (BBD) sản xuất β-glucan chủng A pullulans H8 Giữa phương pháp khác áp dụng cho tối ưu thành phần môi trường, phương pháp tối ưu bề mặt phương pháp áp dụng rộng rãi tăng sản lượng đại phân tử sinh học từ vi sinh vật polysaccharide, glycoprotein enzyme Dựa thông số đơn biến, nồng độ sucrose, (NH4)2SO4 KH2PO4 xác định biến quan trọng ảnh hưởng đến sản xuất β-glucan Ba biến chọn cho nghiên cứu tối ưu hóa xa với thiết kế Box-Behnken khoảng từ -1 tới +1 liên quan đến sản xuất β-glucan (Y) Các biến độc lập Sucrose (A), KH2PO4 (B) (NH4)2SO4 (C) mức dao động chúng trình bày bảng 4.3 Ma trận tối ưu giá trị thực tế β-glucan với giá trị dự đốn trình bày bảng 4.4 Phân tích liệu thí nghiệm mối quan hệ biến phụ thuộc biến độc lập cho phương trình đa thức bậc hai sau: Y (g/L)= 15,4+ 1,47A +1,97B + 1,88C +AB-0,4375AC + 1,94BC -7,2A2 – 2,45B2 – 1,26C2 (1) 40 Bảng 4.3 Các biến giá trị thiết kế Box-Behnken thành phần môi trường lên men sản xuất β-glucan Mức độ A Sucrose (g/L) B KH2PO4 (g/L) C (NH4)2SO4 (g/L) -1 10 0 30 5 +1 50 10 10 Bảng 4.4 Ma trận thiết kế Box-Behnken giá trị thực nghiệm sản lượng β-glucan chủng H8 STT A B C β-glucan (g/L) +1 -1 7.75 0 14.75 0 15 +1 -1 9.75 0 15.5 +1 +1 18 -1 -1 9.25 -1 +1 0 15.5 10 +1 +1 9.5 11 -1 -1 12 +1 -1 13 -1 +1 5.5 14 -1 -1 15 +1 +1 10 16 -1 +1 9.75 17 0 16.25 41 Phân tích phương sai sử dụng hồi quy bội trình bày bảng 4.5 Phân tích F-test thực để xác định ý nghĩa thống kê mơ hình bậc hai Giá trị F mơ hình 66,29 cho thấy mơ hình quan trọng Hơn nữa, giá trị F không phù hợp 2,94 cho thấy thiếu phù hợp không đáng kể so với sai số túy Giá trị CV 7,59%, cho thấy thí nghiệm có độ xác tốt Sự phù hợp mơ hình kiểm tra hệ số xác định R2 Giá trị R2 0,9884 cho thấy 98,84% thay đổi giải thích mơ hình phản hồi Giá trị hệ số xác định R2 hiệu chỉnh 0,9735 đủ cao để ý nghĩa mơ hình Tất thơng số có thống hợp lý giá trị thử nghiệm dự đốn, mơ hình sử dụng để điều hướng việc nâng cao sản xuất β-glucan chủng A pullulans H8 Bảng 4.5 Phân tích phương sai mơ hình bậc hai bề mặt phản ứng để sản xuất β-glucan chủng H8 Nguồn Mơ hình A-Sucrose B-KH2PO4 C-(NH4)2SO4 AB AC BC A² B² C² Phần dư Sự khơng tương thích Sai số Tổng tương quan Sản xuất β-glucana Bình phương Giá trị F trung bình 40.22 66.29 17.26 28.45 31.01 51.11 28.12 46.36 4.00 6.59 0.7656 1.26 15.02 24.75 218.27 359.77 25.27 41.66 6.71 11.06 0.6067 1 1 1 1 Tổng bình phương 361.94 17.26 31.01 28.12 4.00 0.7656 15.02 218.27 25.27 6.71 4.25 2.92 0.9740 16 1.33 366.18 0.3313 df 42 2.94 Giá trị p Prob>F < 0.0001 0.0011 * 0.0002 * 0.0003 * 0.0371 * 0.2983 0.0016 * < 0.0001* 0.0003* 0.0127* 0.1623 *Các điều khoản mơ hình có ý nghĩa (p (NH4)2SO4 (C) Sự tương tác hai biến với biến thứ ba trì mức mô tả biểu đồ đường bao hai chiều biểu đồ bề mặt phản ứng ba chiều chúng Đồ thị đường bao hình elip có nghĩa tương tác tốt hai biến độc lập Tương tác sucrose (A) KH2PO4 (B) tương tác KH2PO4 (B) (NH4)2SO4 (C) đáng kể sản xuất β-glucan Hơn nữa, tương tác Sucrose (A) (NH4)2SO4 (C) không đáng kể để ảnh hưởng đến sản xuất β-glucan Bằng cách giải ma trận nghịch đảo phần mềm Design-Expert, sản lượng β-glucan tối đa dự đốn đạt 20,72 g/L với thành phần môi trường tối ưu sau sucrose 38,137 g/L, KH2PO4 8,491 g/L (NH4)2SO4 7,196 g/L 43 Hình 4.9 Biểu đồ đường bao (bên trái) biểu đồ bề mặt phản ứng tương ứng (bên phải) tác động ba biến độc lập đến việc tạo β-glucan Khi tác động hai biến vẽ biểu đồ, biến lại đặt mức (A) Tương tác sucrose KH2PO4; (B) Tương tác sucrose (NH4)2SO4; (C) Tương tác KH2PO4 (NH4)2SO4 Để xác định điều kiện tối ưu dự đốn mơ hình trên, chủng A pullulans H8 nuôi cấy môi trường chứa sucrose 38,137 g/L, 44 KH2PO4 8,491 g/L (NH4)2SO4 7,196 g/L, NaCl 1g/L, MgSO4 0,4 g/L, cao nấm men 0,4 g/L Thí nghiệm lặp lại lần khối lượng β-glucan thu 20,08±0,11 g/L, điều với giá trị dự đốn 20,72 g/L Sự thống hồn hảo giá trị dự đoán giá trị thực tế mơ hình xác nhận tồn điểm tối ưu Ngày nay, với phát triển khoa học kỹ thuật, việc ứng dụng công nghệ đáp ứng nhu cầu người ngày nâng cao Các hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên dần thay cho hợp chất có nguồn gốc hóa học Theo tổ chức y tế giới, nhu cầu sử dụng hợp chất từ thiên nhiên công nghệ thực phẩm, dược phẩm thức ăn chăn nuôi xu tất yếu, đặc biệt hợp chất tự nhiên tổng hợp từ vi sinh vật điểm đến nhà nghiên cứu [3] Beta glucan men bia đen hoạt động chất kích thích tế bào miễn dịch đại thực bào, tế bào NK (hoặc gọi tế bào giết tự nhiên), tế bào T, bạch cầu khác để hỗ trợ công việc hệ thống miễn dịch Beta glucan men bia đen ức chế gốc giúp chống lão hóa Beta glucan men bia đen giúp chống táo bón nên thúc đẩy q trình giải độc Bên cạnh chế phẩm sinh học có chứa beta glucan phân phối lưu hành thị trường sản xuất thức ăn chăn ni việc tìm quy trình thu nhận beta glucan tan từ q trình lên men chủng A pullulans H8 có ý nghĩa quan trọng thực tiễn ngành sản xuất thức ăn chăn nuôi 45 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận: Từ mẫu thu phân lập 57 chủng nấm men giả nấm men có khả sinh EPS β-glucan khác nhau, chủng H8 có khả sinh tổng hợp β-glucan cao sau ngày lên men môi trường PM, nuôi lắc 180 rpm, 28ᵒC đạt 17,25 g/L β-glucan khơ Chủng H8 khuẩn lạc có màu kem, chuyển dần sang màu rêu, cuối chuyển thành màu đen Có núm nhỏ tâm, quanh rìa có màu rêu nhạt, sợi hình tán xạ Tế bào hình oval, sinh sản hình thức nảy chồi Chủng H8 định danh kỹ thuật SHPT thuộc loài Aureobasidium pullulans Chủng A pullulans H8 có khả sinh tổng hợp β-glucan môi trường tối ưu (bằng phương pháp tối ưu bề mặt: RSM) chứa sucrose 38,137 g/L, KH2PO4 8,491 g/L (NH4)2SO4 (g/L) 7,196 g/L, NaCl 1g/L, MgSO4 0,4 g/L, cao nấm men 0,4g/L, β-glucan đạt 20,08 g/L Đề nghị: Nghiên cứu phát triển sản xuất, thực lên men quy mô pilot với chủng A pullulans H8 môi trường tối ưu hoá để thu nhận sản phẩm chế phẩm chứa β-glucan tan bổ sung sản xuất thức ăn chăn nuôi 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Beta-glucan, (2021), Công ty TNHH Acare Việt Nam, https://www.acarevietnam.com/%CE%B2-glucan-beta-glucan-la-gi-pd-2280-pbKYTHUAT.aspx ICFOOD, (2014), Men vi sinh hoạt tính cho cơng nghiệp chăn ni, (truy cập ngày 8/8/2015) http://icfood.vn/home/2014/11/20/men-vi-sinh-hoat-tinh-chocong-nghiep-chan-nuoi/ Nguyễn Mai Linh (2021), Nghiên cứu tinh pullulan tạo nano bạc PuAgNPs có hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định, Luận văn thạc sỹ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Trần Thị Ái Luyến (2019), Nghiên cứu thu nhận, khảo sát cấu trúc tính chất exopolysaccharide sinh tổng hợp từ Lactobacillus fermentum, Luận án tiến sĩ hoá học, Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế Andi, M.A., M Hashemi and F Ahmadi, (2011), "Effects of feed type with/without nanosil on cumulative performance, relative organ weight and some blood parameters on broilers", Global Veterinaria 7(6): 605-609 Badr-Eldin S., El-Tayeb O., El-Masry H., Mohamad F and Abd El-Rahman O (1994) "Polysaccharide production by Aureobasidium pullulans: factors affecting polysaccharide formation", World Journal of Microbiology and Biotechnology 10(4): 423-426 Bohn J A., Bemiller J N., (1995), "(1-3) - Beta-D-glucan as biologycal responsemodifiers: a review of structure-funtional activity relationship", Carbonhydr Polym 28:3-14 Brown R., Hanic L and Hsiao M (1973) "Structure and chemical composition of yeast chlamydospores of Aureobasidium pullulans." Canadian journal of microbiology 19(2): 163-168 Bulmer M., Catley B and Kelly P (1987) "The effect of ammonium ions and pH on the elaboration of the fungal extracellular polysaccharide, pullulan, by Aureobasidium pullulans." Applied microbiology and biotechnology 25(4): 362365 10 Campbell B., Siddique A., McDougall B and Seviour R (2004), "Which morphological forms of the fungus Aureobasidium pullulans are responsible for pullulan production?" FEMS microbiology letters 232(2): 225-228 11 Catley B (1970), "Pullulan, a relationship between molecular weight and fine structure", FEBS letters 10(3): 190-193 12 Catley.B.J, Whelan.W.J, ( 1971), " Observation on the structure of pullulan", Arch.Biochem.Biophys, (143), pp 138-142 13 Castanon, J.I (2007), "History of the use of antibiotic as growth promoters in European poultry feeds", Poultry Science, 86(11): 2466-2471 14 Chen G., Wang J., Su Y., Zhu Y., Zhang G., Zhao H., Liu H., Yang Y., Nian R and Zhang H (2017), "Pullulan production from synthetic medium by a new mutant of Aureobasidium pullulans", Preparative Biochemistry and Biotechnology 47(10): 963-969 15 Cheng K., Demirci A and Catchmark J (2011), "Pullulan: biosynthesis, production, and applications", Applied microbiology and biotechnology 92(1): 29 16 Cheng K., Demirci A., Catchmark J and Puri V (2011), "Effects of initial ammonium ion concentration on pullulan production by Aureobasidium pullulans and its modeling", Journal of food engineering 103(2): 115-122 17 Gaur R., Singh R., Gupta M and Gaur M (2010), "Aureobasidium pullulans, an economically important polymorphic yeast with special reference to pullulan." African journal of biotechnology 9(47): 7989-7997 18 Hiji Y (1986), "Method for inhibiting increase in blood sugar content", Google Patents 19 Hijiya H and Shiosaka M (1975a), "Adhesives and pastes", Google Patents 20 Hijiya H and Shiosaka M (1975b), "Shaped bodies of pullulan esters and their use", Google Patents 21 Kocková-Kratochvílová A., Černáková M and Sláviková E (1980), "Morphological changes during the life cycle ofAureobasidium pullulans (de Bary) Arnaud", Folia microbiologica 25(1): 56-67 22 Kurtzman C and Robnett C., (1998), "Identification and phylogeny of ascomycetous yeasts from analysis of nuclear large subunit (26S) ribosomal DNA partial sequences." Antonie van Leeuwenhoek 73(4): 331-371 23 Lee J., Kim J., Zhu I., Zhan X., Lee J., Shin D and Kim S (2001), "Optimization of conditions for the production of pullulan and high molecular weight pullulan by Aureobasidium pullulans", Biotechnology letters 23(10): 817820 24 Liu Z., Li X., Chi Z., Wang L., Li J and Wang X (2008), "Cloning, characterization and expression of the extracellular lipase gene from Aureobasidium pullulans HN2-3 isolated from sea saltern." Antonie van Leeuwenhoek 94(2): 245-255 25 Mitsuhashi M., Yoneyama M and Sakai S (1990), "Growth promoting agent for bacteria containing pullulan with or without dextran." European Patent Specification 26 Padmanaban S., Balaji N., Muthukumaran C and Tamilarasan K (2015), "Statistical optimization of process parameters for exopolysaccharide production by Aureobasidium pullulans using sweet potato based medium." Biotech 5(6): 1067-1073 27 Park D (1982), "Inorganic nitrogen nutrition and yeast-mycelial dimorphism in Aureobasidium pullulans." Transactions of the British Mycological Society 78(3): 385-388 28 Prasongsuk S., Berhow M., Dunlap C., Weisleder D., Leathers T., Eveleigh D and Punnapayak H (2007), "Pullulan production by tropical isolates of Aureobasidium pullulans." Journal of industrial microbiology & biotechnology 34(1): 55-61 29 Prasongsuk S., Lotrakul P., Ali I., Bankeeree W and Punnapayak H (2018), "The current status of Aureobasidium pullulans in biotechnology." Folia microbiologica 63(2): 129-140 30 Sheng L., Tong Q and Ma M (2016), "Why sucrose is the most suitable substrate for pullulan fermentation by Aureobasidium pullulans CGMCC1234?" Enzyme and Microbial Technology 92: 49-55 31 Singh R., Gaur R., Pandey P., Jamal F., Pandey L., Singh S., Kewat H., Tiwari S., Biswas P and Gaur M (2018), "A Novel Media Optimized for Production of Pullulan in Flask Type Fermentation System." Int J Curr Microbiol Appl Sci 7(04): 53-61 32 Singh R., Gaur R., Tiwari S and Gaur M (2012), "Production of pullulan by a thermotolerant Aureobasidium pullulans strain in non-stirred fed batch fermentation process." Brazilian Journal of Microbiology 43(3): 1042-1050 33 Singh R and Kaur N (2015), "Microbial biopolymers for edible film and coating applications", Advances in Biotechnology India: IK International Publishing: 187-216 34 Singh R., Kaur N and Kennedy J (2015), "Pullulan and pullulan derivatives as promising biomolecules for drug and gene targeting", Carbohydrate polymers 123: 190-207 35 Singh V., Sharma R and Sharma P (2015), "Isolation, screening and optimization of amylase producing Bacillus sp from soil", Asian Pac J Health Sci 2(3): 86-93 36 Sugumaran K., Sindhu R., Sukanya S., Aiswarya N and Ponnusami V (2013), "Statistical studies on high molecular weight pullulan production in solid state fermentation using jack fruit seed", Carbohydrate polymers 98(1): 854-860 37 Trivedi N., Gupta V., Kumar M., Kumari P., Reddy C and Jha B (2011), "An alkali-halotolerant cellulase from Bacillus flexus isolated from green seaweed Ulva lactuca", Carbohydrate polymers 83(2): 891-897 38 Vijayaraghavan P and Vincent S (2013), "A simple method for the detection of protease activity on agar plates using bromocresolgreen dye", J Biochem Technol 4(3): 628-630 39 West T and Reed-Hamer B (1991), "Ability ol Aureobasidium pullulans to synthesize pullulan", Microbios 67: 117-124 40 West T and Reed-Hamer B (1994), "Elevated polysaccharide production by mutants of the fungus Aureobasidium pullulans", FEMS microbiology letters 124(2): 167-171 41 Yang J., Zhang Y., Zhao S., Zhou Q., Xin X and Chen L (2018), "Statistical optimization of medium for pullulan production by Aureobasidium pullulans NCPS2016 using fructose and soybean meal hydrolysates", Molecules 23(6): 1334 42 Yatmaz E and Turhan I (2012), "Pullulan production by fermentation and usage in food industry", GIDA-Journal o Food 37(2): 95-102 ... kháng sinh chăn nuôi, đề tài luận văn thạc sĩ xác định ? ?Phân lập tuyển chọn chủng Aureobasidium pullulans từ số loại sinh tổng hợp β -glucan tan ngoại bào để bổ sung sản xuất thức ăn chăn nuôi? ?? Trong. .. NGHIỆP NGÔ THU THUỶ PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CHỦNG AUREOBASIDIUM PULLULANS TỪ MỘT SỐ LOẠI QUẢ SINH TỔNG HỢP ? ?GLUCAN TAN NGOẠI BÀO ĐỂ BỔ SUNG TRONG SẢN XUẤT THỨC ĂN CHĂN NUÔI LUẬN VĂN THẠC SĨ Chuyên... tiêu chung: Chọn lọc 01 chủng thuộc chi Aureobasidium có khả sinh tổng hợp β -glucan tan ngoại bào cao từ số loại sinh tổng hợp ? ?glucan Mục tiêu cụ thể: - Phân lập, tuyển chọn 01 chủng định danh