NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY LÊN SINH TRƯỞNG CỦA VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ PHỤC VỤ CHO SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH LUẬN VĂN THẠC SĨ

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Ngô Thị Hà NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY LÊN SINH TRƯỞNG CỦA VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ PHỤC VỤ CHO SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên - 2013 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC Ngô Thị Hà NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY LÊN SINH TRƯỞNG CỦA VI KHUẨN CỐ ĐỊNH NITƠ PHỤC VỤ CHO SẢN XUẤT CHẾ PHẨM VI SINH Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60420201 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS TĂNG THỊ CHÍNH Thái Nguyên - 2013 MỞ ĐẦU Việt Nam nƣớc nông nghiệp Sản xuất nông nghiệp lĩnh vực sản xuất quan trọng phát triển Việt Nam Trong trồng trọt giữ vai trị quan trọng số yếu tố gắn liền với trồng trọt phân bón nhằm nâng cao suất trồng cho mùa màng bội thu Theo thống kê Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, năm Việt Nam sử dụng triệu phân urê, khoảng 600 nghìn phân DAP lƣợng tƣơng đƣơng loại phân khác [18] Tuy nhiên theo đánh giá Viện Dinh dƣỡng Quốc tế, phân bón đóng góp khoảng 30 – 35% tổng trọng lƣợng trồng [19] Do đó, sử dụng phân bón hóa học không hợp lý gây ô nhiễm môi trƣờng Bên cạnh đó, sản phẩm phân bón vi sinh có ƣu điểm nhƣ: thân thiện với mơi trƣờng, giúp cân sinh thái, không nguy hại sức khỏe ngƣời Để hƣớng tới nơng nghiệp xanh thân thiện mơi trƣờng phân bón vi sinh lựa chọn hàng đầu Nhƣng việc áp dụng sản phẩm phân bón vi sinh vào nơng nghiệp cịn gặp nhiều khó khăn: hiệu khơng tức thì, quy mơ sản xuất chƣa đủ đáp ứng, chất lƣợng sản phẩm chƣa ổn định Vì vậy, nghiên cứu để hoàn thiện nâng cao chất lƣợng phân bón vi sinh việc làm cần thiết Trong đó, việc tuyển chọn đánh giá hoạt tính chủng vi sinh vật khâu quan trọng quy trình tạo chế phẩm phân bón vi sinh Để góp phần phát triển nông nghiệp nƣớc đồng thời bảo vệ môi trƣờng hƣớng tới nghiên cứu loại phân bón cố định đạm tự nhiên, thân thiện với môi trƣờng, giá thành phải tiến hành thực luận văn tốt nghiệp với tên đề tài: “ Nghiên cứu ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy lên sinh trưởng vi khuẩn cố định nitơ tự phục vụ cho sản xuất chế phẩm vi sinh” Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Nội dung nghiên cứu: - Tuyển chọn số chủng vi khuẩn cố định nitơ từ giống phịng Vi sinh vật mơi trƣờng - Nghiên cứu ảnh hƣởng nguồn dinh dƣỡng (nguồn cacbon, nồng độ cacbon, nguồn nitơ nồng độ CaCO3) lên khả sinh trƣởng hoạt tính cố định nitơ chủng vi khuẩn cố định nitơ tuyển chọn - Nghiên cứu ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy nhƣ nhiệt độ, pH, độ cấp khí lên khả sinh trƣởng hoạt tính cố định nitơ chủng vi khuẩn cố định nitơ tuyển chọn - Tiến hành thử nghiệm trồng phịng thí nghiệm Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài: - Ý nghĩa khoa học: + Giúp học viên củng cố hệ thống lại kiến thức học nghiên cứu khoa học + Biết đƣợc phƣơng pháp nghiên cứu vấn đề khoa học, xử lý phân tích số liệu, cách trình bày báo cáo khoa học - Ý nghĩa thực tiễn: + Tuyển chọn đƣợc chủng vi khuẩn cố định nitơ có hoạt tính cố định nitơ cao để sản xuất phân hữu vi sinh + Từ kết ban đầu đề tài tạo tiền đề cho nghiên cứu khoa học Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Chƣơng – TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đại cƣơng vi khuẩn cố định nitơ tự Cố định nitrogen – khả đồng hóa nitơ phân tử số vi sinh vật dùng nitrogen để cấu tạo lên tất hợp chất chứa nitrogen tế bào Khả có nhiều vi sinh vật sống tự đất nƣớc: loài thuộc giống Clostridium, Azotobacter, Pseudomonas, Bacillus, Aerobacter, vi khuẩn dinh dƣỡng quang năng, vi khuẩn sinh metan, vi khuẩn khử sulfat, số Mycobabacterium, Proactinomyces, Actinomyces nấm, tảo lam (vi khuẩn lam – ND) v.v Ngoài khả cố định nitơ vi khuẩn nốt sần (giống Rhizobium) sống cộng sinh rễ họ đậu có ý nghĩa quan trọng việc làm giàu nitơ cho đất Ngồi vi khuẩn nốt sần lồi giống Azotobacter Clostridium có khả cố định nitơ tự do.[2][3] 1.1.1 Vi khuẩn cố định nitơ hiếu khí (Azotobacter) Các lồi Azotobacter thuộc lồi vi sinh vật cố định nitơ hoạt động Trong số lồi Azotobacter đƣợc miêu tả lồi đƣợc nghiên cứu nhiều Az chroococcum, Az agilis Az vinelandii Az chroococcum loài chủ yếu đất đồng cỏ Trong ao hồ thƣờng gặp Az agilis Các lồi nói khác đặc điểm sinh trƣởng mơi trƣờng đặc, kích thƣớc, hình thái tế bào số đặc điểm sinh lý học Az chroococcum tạo khuẩn lạc nhầy, lồi lan, lúc đầu khơng màu, sau biến thành màu nâu tối, trí đến đen nhƣng khơng làm nhuộm màu môi trƣờng khuẩn lạc Đặc điểm Az vinelandii Az agilis có khuẩn lạc trong, nhầy, sinh sắc tố huỳnh quang màu vàng – lục lam – lục, sắc tố khuếch tán vào môi trƣờng [9][10], [12] Khi cịn non tế bào Azotobacter có khả di động, hình que đầu trịn, đứng riêng rẽ hay xếp thành đôi, đồng chất, tế bào chất nhuộm màu Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ đồng Chiều dài tế bào thay đổi từ – μm đến - 6μm Các tế bào Az agilis có kích thƣớc lớn (5-6μm) Dần tế bào hình que chuyển thành hình cầu hay hình bầu dục lớn với đƣờng kính lên tới 4μm, hình dạng khơng cố định Khi có tiêm mao rụng tế bào trở lên bất động, bọc bao nhầy, tế bào chất xuất cấu tạo dạng hạt, tế bào trịn phủ lớp vỏ dày chuyển thành kén Hình dạng tế bào Azotobacter chu kì biến đổi chúng phụ thuộc vào tuổi giống điều kiện phát triển.[25] Hình1.1 Azotobacter Tất lồi Azotobacter sống dị dƣỡng Để dùng nguồn cacbon, chúng sử dụng nhiều nguồn hữu khác – monosaccarit, disaccarit, số polysaccarit nhiều rƣợu, axit hữu bao gồm hợp chất thơm Nguồn nitơ Azotobacter khơng nitơ phân tử mà cịn muối ammon, nitrat, nitrit, aminoaxit Tùy thuộc vào hợp chất chứa nitơ có mơi trƣờng mà q trình cố định nitơ môi trƣờng bị ức chế nhiều hay Azotobacter có nhu cầu lớn photpho canxi Để cố định nitơ phân tử cách mạnh mẽ chúng cần có molybden bor Azotobacter nhận đƣợc lƣợng từ q trình oxy hóa hợp chất hữu thành CO2 H2O Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Phần lớn Azotobacter phát triển pH lớn khơng gặp chúng đất chua Đặc trƣng đất chua lồi Az indicum Chúng phát triển mơi trƣờng có pH Azotobacter cần có độ ẩm cao so với nhiều vi khuẩn khác, gặp chúng vùng khơ hạn Phần lớn chủng Azotobacter phân lập đƣợc từ thiên nhiên có khả cố định đƣợc 10mg N2 tiêu thụ hết 1g hợp chất cacbon Một số chủng Azotobacter điều kiện thích hợp có khả đồng hoá đƣợc đến 300 mg N2/1g hợp chất cacbon Nhiều nghiên cứu cho biết phát triển chung với số vi khuẩn khác Azotobacter có hoạt động cố định nitơ cao so với nuôi cấy riêng rẽ Azotobacter đem phần nitơ đồng hoá đƣợc đƣa vào môi trƣờng dƣới dạng NH4+, axit amin protein Sự phát triển cố định nitơ Azotobacter đất chịu ảnh hƣởng mật thiết khu hệ vi sinh vật đất Bên cạnh nhóm vi sinh vật có ảnh hƣởng tốt phát triển Azotobacter (tổng hợp chất hoạt động sinh học, phân giải thức ăn hữu bền vững) cịn có nhiều nhóm vi sinh vật có khả làm ức chế phát triển Azotobacter (cạnh tranh thức ăn, sản sinh chất kháng sinh,…) Đã có nhiều cơng trình nghiên cứu đề cập đến mối quan hệ Azotobacter trồng Azotobacter thƣờng xuyên có mặt vùng rễ trồng với số lƣợng cao nhiều so với vùng rễ Số lƣợng chúng biến đổi phụ thuộc vào loại cây, giai đoạn phát triển nhiều yếu tố sinh thái, địa lý khác Ngƣời ta chứng minh đƣợc Azotobacter không phát triển bề mặt rễ mà phát triển đất xung quanh rễ Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Azotobacter có tác dụng làm tăng nguồn thức ăn nitơ cho trồng Trung bình tiêu thụ hết 1g chất sinh lƣợng, Azotobacter có khả đồng hố đƣợc khoảng 10-15 mg nitơ phân tử Phân bón vi sinh vật Azotobacter đƣợc coi phân bón vi sinh vật đƣợc ứng dụng sớm Sau trình nghiên cứu, nhà khoa học khám phá Azotobacter khơng có khả cố định nitơ mà cịn có khả sinh tổng hợp hoạt chất kích thích sinh trƣởng thực vật, số vitamin hoạt chất ức chế sinh trƣởng số vi nấm gây bệnh vùng rễ số trồng Sản phẩm phân bón vi sinh vật cố định nitơ tự từ chủng vi khuẩn Azotobacter đƣợc sản xuất Mỹ, Úc Nga đƣợc sử dụng nhiều nơi giới mang lại hiệu kinh tế xã hội tƣơng đối cao Ở Việt Nam, sản phẩm phân bón vi sinh vật chứa vi khuẩn cố định nitơ tự (Azotobacter) đƣợc khảo nghiệm hiệu lực trồng đồng ruộng đƣợc đƣa vào danh mục loại phân bón đƣợc phép sử dụng Việt Nam [26] 1.1.2 Vi khuẩn cố định nitơ kỵ khí Clostridium Nhiều loại thuộc giống Clostridium có khả cố định nitơ khơng khí: Cl Pastuerianum, Cl Butỷium, Cl Acetobutylicum, Cl Felsineum Chúng thuộc nhóm phân loại, nhƣng khác đặc điểm hình thái học sinh lý sinh hóa học Cl Pasteurianum có khả đồng hóa nitơ phân tử mạnh mẽ Tế bào loại trực khuẩn lớn, dài 1,5 - 8μm rộng 0,8 – 1,3μm [7, 8] Đây nhóm dị dƣỡng hóa hữu cơ, nguồn hữu chúng sử dụng: monosaccarit, disaccarit, số polysaccarit nhiều rƣợu, axit hữu bao gồm hợp chất thơm Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 1.1.3 Vi khuẩn cố định nitơ cộng sinh Rhizobium Trong hệ thống cố định nitơ sinh học, cố định nitơ cộng sinh vi khuẩn nốt sần (Rhizobium) họ đậu quan trọng nhất, ƣớc tính đạt 80 triệu năm, tƣơng đƣơng với lƣợng phân đạm vơ tồn giới sản xuất năm 1990 Trong hệ thống cố định nitơ sinh học này, nốt sần nhà máy phân đạm mini, chủ vừa chỗ trú ngụ đồng thời nguồn cung cấp lƣợng cho trình cố định nitơ vi khuẩn nhận lại lƣợng đạm từ trình cố định nitơ để cung cấp cho trình tổng hợp đạm thân, lá, hoa quả.[3] Vi khuẩn Rhizobium tồn đất, xâm nhập vào lơng hút rễ đậu kích tác tạo thành nốt sần nên đƣợc gọi vi khuẩn nốt sần Giữa đậu vi khuẩn nốt sần hình thành mối quan hệ cộng sinh nghĩa quan hệ mà hai bên cần có dựa vào để phát triển, vi khuẩn nốt sần tổng hợp đạm từ nitơ khơng khí cung cấp cho ngƣợc lại trồng cung cấp dƣỡng chất cần thiết để vi khuẩn nốt sần tồn sinh trƣởng.[5] Hình dáng, kích thƣớc, màu sắc vị trí nốt sần khác nhau, phản ánh tình trạng liên kết vi khuẩn nốt sần hiệu cố định nitơ Căn vào hiệu cố định nitơ, hai loại nốt sần đƣợc phân biệt, nốt sần hữu hiệu nốt sần vơ hiệu Dựa vào số lƣợng, kích thƣớc màu sắc thịt nốt sần, đánh giá đƣợc hiệu trình cố định nitơ lạc chủng vi khuẩn tƣơng ứng Rễ có mật độ nốt sần hữu hiệu cao, chứng tỏ việc sử dụng phân vi khuẩn nốt sần mang lại hiệu tốt Số lƣợng khối lƣợng nốt sần đƣợc kiểm tra tốt vào thời kì hoa rộ Để đánh giá tác dụng biện pháp nhiễm vi khuẩn nốt sần khả nhiễm vi khuẩn đƣợc bón, cần kiểm tra nốt sần thời kỳ 4-5 tuần tuổi Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Vi khuẩn Rhizobium loại trực khuẩn gram âm không sinh nha bào, hiếu khí Kích thƣớc tế bào dao động 0,5-1,2.2,0-3,5, khuẩn lạc thuộc nhóm S, nhày lồi, màu trắng trắng đục, kích thƣớc khuẩn lạc dao động 2,3-4,5mm sau tuần ni mơi trƣờng thạch Vi khuẩn Rhizobium có tiên mao, có khả di động đƣợc, chúng thích hợp pH từ 6,5-7,5, nhiệt độ 25-28oC, độ ẩm 50-70% Khi già có số loại tạo đƣợc nang xác, khuẩn lạc chuyển sang màu nâu nhạt Vi khuẩn Rhizobium gồm nhiều loài khác nhau: Rh.leguminosarum, Rh.phaseoli, Rh.trifolii, Rh.japonicum, Rh.meliloti, Rh.cicer, Rh.simplese, Rh.vigna, Rh.robinii, Rh.lotus,… 1.2 Quá trình cố định nitơ sinh học Nitơ nguyên tố trơ khó liên kết hóa học với nguyên tố khác, khơng có chất xúc tác điều kiện đặc biệt khác, khơng ngừng bị chuyển hóa chu trình khép kín tác động sinh học hay hóa học khác Dƣới tác động hoạt động hóa học sinh học, nitơ phân tử chuyển thành đạm vô cơ, sau chuyển thành đạm thực vật động vật thơng qua q trình chuyển hóa Một phần đạm thực vật dƣới dạng tàn dƣ phần đƣợc trồng sử dụng, phần lại bị rửa trôi bay hoạt động vi sinh vật đất có khả phân giải đạm Quá trình đạm chịu ảnh hƣởng lớn chế độ canh tác Nitơ đồng thời yếu tố dinh dƣỡng vô quan trọng không với sinh vật bậc cao mà với sinh vật nhỏ bé mà mắt thƣờng khơng nhìn thấy đƣợc Trong tự nhiên nitơ phân tử tồn dƣới dạng khí chiếm 78% thể tích khơng khí[17], song chất nitơ lại sử dụng đƣợc làm nguồn dinh dƣỡng cho sinh vật Để trồng sử dụng nguồn tài nguyên làm chất dinh dƣỡng, nitơ khơng khí phải đƣợc chuyển hóa thơng qua q trình cố định nitơ (cố định đạm), nitơ phân tử đƣợc chuyển hóa thành amơni Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/