ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu, chất liệu nghiên cứu
Thỏ ta khỏe mạnh, có trọng lượng từ 2.0 - 2.5 kg, được nuôi nhốt trong điều kiện thí nghiệm trong một tuần Trong nghiên cứu này, 17 thỏ đã được sử dụng để thử nghiệm và xây dựng quy trình chọc hút tủy xương Sau khi hoàn thiện quy trình, 30 thỏ đã được sử dụng để thực hiện chọc hút chính thức nhằm thu thập dịch tủy.
- 30 mẫu dịch tủy xương thỏ sau chọc hút sử dụng để tách chiết tế bào gốc trung mô
Bài viết đề cập đến quy trình sử dụng 30 mẫu dịch chứa tế bào gốc trung mô được phân lập từ dịch tủy xương để nuôi cấy và tăng sinh Sau khi tăng sinh, 105 mẫu được chia nhỏ để tiến hành biệt hóa theo hướng tạo cốt bào Trong số đó, 15 mẫu được định danh sau quá trình biệt hóa, trong khi 90 mẫu còn lại được bảo quản lạnh.
Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu thực nghiệm trên động vật và trong phòng thí nghiệm (in vivo và in vitro)
Hình 2.1 Mô hình nghiên cứu
2.2.2 Dụng cụ, thiết bị và hóa chất nghiên cứu 2.2.2.1 Dụng cụ nghiên cứu
- Bộ dụng cụ gây mê thỏ
- Kim chọc tủy troca kích thước 2’’ – 13 gauge
- Chai nuôi cấy flask 25 cm 2
Khối tế bào đơn nhân
Tế bào gốc trung mô
Tế bào bảo quản lạnh
Thỏ cùng độ tuổi, cùng cân nặng
Nuôi cấy tăng sinh,biệt hóa,định danh tạo cốt bào
Nuôi cấy tăng sinh, định danh MSC Phân lập đạt tiêu chuẩn
Bảo quản lạnh Đánh gía bổ sung khả năng tạo xương trên ghép thực nghiệm
2.2.2.2 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
- Tủ an toàn sinh học cấp 2
- Tủ nuôi cấy tế bào
- Kính hiển vi soi ngược
- Kính hiển vi huỳnh quang
- Thiết bị đo dòng chảy tế bào FACS Calibure 2.2.2.3 Môi trường, hóa chất, thuốc nhuộm, kháng thể Hóa chất:
- Dung dịch đệm PBS (sigma)
- Dung dịch tách tế bào: Trypsin- EDTA 0,25% (sigma)
- Dung dịch phân lập tế bào: Ficoll-paque (do chúng tôi tự pha) Thuốc nhuộm:
- Alizarin red (sigma): 2g Nước cất
Trộn đều và chỉnh pH về 4,1 – 4,3 bằng 0,5% ammonium hydroxide
- Thuốc nhuộm Oil red O Oil red (sigma): 0,1g Isopropanol (sigma): 20ml Khuấy đều trong 10 phút ở 37 0 C, lọc bằng giấy lọc
Môi trường nuôi cấy, biệt hóa:
- Môi trường nuôi cấy MSC DMEMF12(sigma),10% FBS (Gibco),1% kháng sinh-kháng nấm (sigma)
- Môi trường biệt hóa xương DMEM low glucose (sigma), 10% FBS (Gibco), 1% kháng sinh- kháng nấm (sigma),50μg/ml Ascorbic (sigma), 0,1μM dexamethasone (sigma), 100mM β-glycerolphosphate (sigma)
- Môi trường biệt hóa mỡ DMEM low glucose (sigma), 10% FBS (Gibco), 1% kháng sinh-kháng nấm, 0,5μM dexamethasone, 0,2mM indomethacin, 0,5μM 3 isobutyl-1 methylxanthin –IBMX (sigma)
Kháng thể: sử dụng một số kháng thể định danh tế bào gốc trung mô (trên thỏ), tạo cốt bào biệt hóa …
Các kháng thể đơn dòng: Kháng thể kháng CD34 gắn P.E (Abcam), kháng thể kháng CD14, CD44 gắn P.E (Antigenix), kháng thể kháng CD90 gắn FITC (Thermo Fisher Scientific) Goat IgG P.E
2.2.3 Các bước tiến hành nghiên cứu
Nghiên cứu tiến hành theo các bước sau:
- Chọc hút lấy dịch tủy xương, ly tâm tách lấy tế bào đơn nhân
- Nuôi cấy tăng sinh, định danh khẳng định tế bào gốc trung mô
- Biệt hóa tế bào gốc trung mô thành tạo cốt bào
- Định danh tạo cốt bào
- Thử nghiệm bổ sung đánh giá khả năng tạo xương trên động vật
- Bảo quản lạnh sau biệt hóa
2.2.3.1 Chọc hút tủy xương, tách chiết, phân lậptế bào gốc trung mô
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn một trong ba phương pháp giảm đau hiệu quả nhất cho quy trình chọc hút, bao gồm gây mê bằng thuốc thiopental, gây tê tại chỗ đơn thuần và gây mê phối hợp với gây tê tại chỗ Mỗi phương pháp được thử nghiệm trên 5 con thỏ (n=5) để đánh giá hiệu quả và tính an toàn của từng phương pháp.
Vị trí chọc hút tủy xương thử nghiệm tại 3 vị trí: ụ ngồi, mấu chuyển lớn xương đùi, mào chậu Mỗi vị trí thử nghiệm 5 thỏ ( n=5)
Hình 2.2 Vị trí giải phẫu chọc tủy xương trên thỏ
Chọc hút tủy xương là một quy trình y tế quan trọng, đòi hỏi phải đảm bảo điều kiện vô trùng để thu thập dịch tủy xương với đủ số lượng cho nghiên cứu Các bước thực hiện cần được tiến hành một cách cẩn thận để đảm bảo tính chính xác và an toàn cho bệnh nhân.
Để thực hiện việc chọc hút tủy xương ở thỏ, trước tiên cần cố định thỏ ở tư thế ngồi để xương mào chậu nhô lên, xác định vị trí chọc hút Vùng da nơi chọc hút cần được vô trùng, có thể rạch da và bóc nhẹ màng xương Sử dụng kim chọc tủy troca loại 2’’-13 gauge, với góc chọc hơi chếch ra trước 30 độ, kim được đẩy qua da và lớp xương cứng của khung chậu cho đến khi đầu kim nằm trong lớp xương xốp chứa tủy xương Cuối cùng, dịch tủy xương được hút bằng xilanh 10ml, và xilanh cần được rửa bằng dung dịch đệm sau mỗi lần hút.
Mào chậu là một phần quan trọng trong quy trình lấy dịch tủy xương Để chống đông, cần sử dụng 100ml PBS kết hợp với 650 đơn vị heparin Mỗi lần hút dịch tủy xương, lượng dịch thu được dao động từ 0,5-1ml, với tổng lượng dịch tủy xương khoảng 10ml cho mỗi con thỏ.
A Chọc kim vào vị trí B Hút tủy
Hình 2.3 Chọc hút tủy từ xương mào chậu thỏ
- Phân lập tế bào gốc trung mô từ dịch tủy xương
Tế bào đơn nhân được tách bằng phương pháp gradient tỷ trọng thông qua ly tâm dịch tủy xương sau khi pha loãng với chất chống đông, đặt trên lớp Ficoll có tỷ trọng 1,077g/cm³ Trong quá trình ly tâm, hồng cầu và bạch cầu sẽ lắng xuống đáy ống, trong khi các tế bào có tỷ trọng thấp hơn sẽ lắng ở lớp giữa Ficoll và huyết tương, tạo thành phân đoạn chứa tế bào gốc Kỹ thuật này được áp dụng theo nghiên cứu của tác giả Shahdadfar A (2005).
Dịch tủy xương được pha loãng với PBS theo tỷ lệ 1:4, bằng cách hút 10ml dịch tủy xương đã pha loãng vào ống facol 15ml đã chuẩn bị sẵn 4ml dung dịch Ficoll, chú ý không làm xáo trộn bề mặt tiếp xúc giữa hai dung dịch Sau đó, ly tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 30 phút và hút lớp tế bào đơn nhân (khoảng 3-4ml) vào ống Facon 15ml mới, lớp này nằm giữa dung dịch Ficoll (màu trắng) và huyết tương (màu hồng) Tiếp theo, rửa khối tế bào đơn nhân trong 5ml PBS, ly tâm ở 1500 vòng/phút trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi và thu lấy cặn tế bào Cuối cùng, tạo huyền phù khối tế bào trong 5ml môi trường, đếm số lượng tế bào và xác định mật độ, rồi cho dịch huyền phù vào chai nuôi cấy có diện tích 25cm2.
Hình 2.4 Hình ảnh dịch tủy xương trước (A) và sau ly tâm (B)
Chú ý: Lớp tế bào đơn nhân thu nhận thành công phải thấy được bằng mắt thường, ranh giới rõ, có màu trắng đục (Hình 2.4)
2.2.3.2 Nuôi cấy tế bào gốc trung mô
- Nghiên cứu lựa chọn giá thể nuôi cấy:
Chúng tôi tiến hành nuôi cấy bằng giá thể chính là chai nuôi flask 25 cm 2, đồng thời thử nghiệm nuôi cấy trên giá thể 3D từ mảnh mô xương xốp người.
Lựa chọn xương xốp nhằm tạo ra giá thể 3D chứa tế bào gốc có khả năng cấy ghép trực tiếp vào mô xương và khớp là một giải pháp tiềm năng trong y học.
Lớp tế bào đơn nhân Huyết tương
Nghiên cứu này sử dụng các mảnh xương nhỏ được lấy từ các đoạn xương hiến tặng cho Labo Công nghệ mô ghép nhằm mục đích điều trị.
Giá thể truyền thống: chai nuôi flask 25cm2 của hãng BD
Giá thể xương xốp được tạo ra bằng cách cắt xương xốp thành các mẫu nhỏ kích thước 3x3x3mm Quy trình xử lý bao gồm làm sạch tủy, mỡ và protein, cũng như khử khoáng bằng cách ngâm trong dung dịch hydroxy peroxyt 30% trong 4 giờ và sau đó ngâm trong HCL 0.5N trong 30 phút Cuối cùng, các mẫu được rửa nhiều lần trong nước cất vô trùng và thực hiện rửa siêu âm để đảm bảo độ sạch.
Qui trình loại bỏ hoàn toàn các yếu tố độc hại và miễn dịch cho tế bào nuôi cấy bao gồm việc đông khô trong điều kiện áp suất 0.04 mbar và nhiệt độ -56 độ C.
- Tiến hành nuôi cấy Nuôi cấy được tiến hành theo 2 giai đoạn, sơ cấp và thứ cấp
Huyền phù khối tế bào đơn nhân sau khi ly tâm được cho vào chai flask và bổ sung 5ml môi trường nuôi cấy MSC, sau đó đặt trong tủ nuôi ở nhiệt độ 37°C với 5% CO2 Sau 48 giờ, khi tế bào đã bám đáy, cần thay môi trường cũ bằng môi trường mới Quá trình thay môi trường cần thực hiện 2-3 ngày một lần, mỗi lần 5ml Khi tế bào phát triển đạt 70-80% diện tích đĩa nuôi cấy, tiến hành cấy chuyển.
Nuôi cấy thứ cấp (cấy chuyển): o Nuôi cấy trong chai flask:
Hút bỏ môi trường cũ và rửa hai lần bằng PBS Sau đó, thêm 2 ml trypsin/EDTA vào mỗi chai và để trong 3-5 phút Quan sát dưới kính hiển vi; khi tế bào co tròn, hãy bất hoạt trypsin bằng môi trường DMEM có 10% huyết thanh Thu dịch huyền phù vào ống falcon 15ml và ly tâm với tốc độ 1500 vòng/phút trong 10 phút Sau đó, thu lấy tế bào và pha loãng vào môi trường mới với tỉ lệ 1/3, rồi cho tế bào vào chai flask và đặt trong tủ nuôi ở 37°C với 5% CO2.
Sau 5-7 ngày nuôi cấy thứ cấp, tế bào đạt 70-80% diện tích đáy chai nuôi và có hình dạng tương tự như tế bào trong nuôi cấy sơ cấp Nghiên cứu này áp dụng phương pháp chọn lọc MSC theo phương pháp của Shahdadfar A (2005) và tiến hành thử nghiệm nuôi cấy trên giá thể xương xốp.
Giá thể xương xốp sau khi xử lý cần được ủ trong 24 giờ trong môi trường nuôi cấy, sau đó bơm chậm tế bào vào giá thể với mật độ 10^5 tế bào/ml Sau khi đưa giá thể chứa tế bào vào môi trường nuôi cấy với đầy đủ điều kiện về khí và nhiệt độ, cần thực hiện việc thay môi trường và theo dõi sự phát triển của tế bào giống như nuôi trong chai flask Do việc quan sát tế bào trong giá thể khó khăn hơn, nên cần chú ý quan sát kỹ, đặc biệt là những tế bào phát triển bên cạnh giá thể.
Chỉ tiêu nghiên cứu
Để đạt hiệu quả tối ưu trong việc giảm đau, cần xác định phương pháp giảm đau phù hợp nhất, lựa chọn vị trí chọc hút chính xác và áp dụng kỹ thuật chọc hút hiệu quả Điều này đảm bảo thu thập đủ số lượng dịch tủy xương với chất lượng cao, từ đó tách chiết tế bào một cách hiệu quả.
Xác định kỹ thuật xử lý mẫu dịch tủy xương cho kết quả tốt nhất
Lấy đủ 30 mẫu dịch tủy xương sau chọc hút đủ tiêu chuẩn: vô trùng, không đông, khối lượng 1.5 – 2.0ml/mẫu
Lấy đủ 30 mẫu dịch tế bào đơn nhânsau phân lập, tách chiết có mật độ
10 6 tế bào đơn nhân/ml
Nuôi cấy tăng sinh thành công 30 mẫu tế bào gốc trung mô
Định danh 10 mẫu bằng hai kỹ thuật: kỹ thuật đo dòng chảy tế bào (flow cytometry), n=5 và kỹ thuật hóa mô miễn dịch (n=5)
Biệt hóa thành công 15 mẫu tế bào gốc trung mô thành tạo cốt bào
Bài viết này định danh 15 mẫu khẳng định cốt bào thông qua ba phương pháp khác nhau Cụ thể, có 5 mẫu được phân tích bằng kỹ thuật hóa mô miễn dịch cho kết quả dương tính với marker tế bào tạo xương Tiếp theo, 5 mẫu khác được khảo sát bằng kỹ thuật quan sát trên tiêu bản siêu cấu trúc, cho thấy sự lắng đọng tinh thể khoáng Cuối cùng, 5 mẫu còn lại được nhuộm bằng Alizarin red, cho thấy sự lắng đọng canxi rõ rệt.
Ghép trên thực nghiệm cho 15 thỏ tế bào được biệt hóa định hướng tạo cốt bào để nhận xét khả năng tạo xương trên in vivo
Bảo quản 90 mẫu tạo cốt bào với tỷ lệ tế bào sống sau bảo quản đạt trên 80% Sau khi nuôi cấy, các tế bào này tiếp tục phát triển, đạt hơn 100% số mẫu ban đầu.
Địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiện tại Bộ môn Mô-Phôi, Trường Đại học Y Hà Nội, khoa huyết học, bệnh việnTrung ương quân đội 108.
Xử lý số liệu
Số liệu thu nhận được xử lý bằng phần mềm xử lý thống kê SPSS
Phương pháp xử lý số liệu T-test, anova, kiểm định tương quan Pearson.
Đạo đức trong nghiên cứu
Nghiên cứu thực nghiệm thường không đề cập đến vấn đề đạo đức, tuy nhiên, chúng tôi cam kết hạn chế tối đa việc sử dụng động vật Trước khi thực hiện các thủ thuật, chúng tôi luôn tiến hành gây mê và gây tê để giảm đau cho chúng.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Kết quả phân lập, nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc trung mô từ tủy xương thỏ
3.1.1 Kết quả chọc hút, phân lập tế bào gốc trung mô từ tủy xương thỏ 3.1.1.1 Kết quả lựa chọn phương pháp giảm đau
Bảng 3.1 Kết quả lựa chọn phương pháp giảm đau
Khả năng thao tác chọc hút
Gây tê tại chỗ Kém Khó 0/5
Gây mê Tốt Dễ làm, nhiều nguy cơ thỏ tử vong 3/5
Gây tê phối hợp gây mê Tốt Dễ làm, mau tỉnh 5/5
Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp gây tê tại chỗ cho thỏ thường gặp khó khăn trong việc chọc hút do sự cử động của chúng Trong khi đó, phương pháp gây mê mặc dù dễ thực hiện nhưng lại khiến thỏ lâu tỉnh và có nguy cơ ngừng thở Đặc biệt, việc kết hợp giữa gây mê và gây tê tại chỗ mang lại hiệu quả tốt nhất, giúp thao tác chọc hút diễn ra dễ dàng hơn, rút ngắn thời gian hồi phục cho động vật và nâng cao tỷ lệ thành công trong việc chọc hút tủy xương.
3.1.1.2 Kết quả lựa chọn vị trí chọc dịch tủy xương
Bảng 3.2 Kết quả lựa chọn vị trí chọc dịch tủy xương
Vị trí Khả năng thao tác
Mức độ tổn thương Thành công
Mấu chuyển lớn Khó quan sát Nặng 0/5 Ụ ngồi Khó quan sát Nặng 0/5
Mào chậu Dễ quan sát Nhẹ 5/5
Kết quả nghiên cứu cho thấy vị trí mấu chuyển lớn gặp khó khăn trong quan sát và thao tác, dẫn đến tổn thương nặng Ngược lại, vị trí mào chậu dễ quan sát và thao tác hơn, với bản xương rộng nhất, mức độ tổn thương nhẹ và tỷ lệ hút tủy xương cao nhất.
3.1.1.3 Kết quả số lượng và chất lượng dịch tủy xương sau chọc hút Bảng 3.3 Kết quả số lượng, chất lượng dịch tủy xương sau chọc hút, ly tâm, tách chiết
Thông số nghiên cứu Lượng dịch tủy xương (ml)
Tổng tế bào đơn nhân sau ly tâm(x10 6 )/1ml tủy xương thỏ
Kết quả từ bảng trên chỉ ra rằng lượng tủy xương chọc hút trung bình đạt 12 ± 4.3 ml, với số lượng tế bào đơn nhân thu được là 6,7 x10^6 tế bào/ml.
Các mẫu dịch tủy xương này sử dụng để nuôi cấy tăng sinh.
3.1.2 Kết quả nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc trung mô tủy xương 3.1.2.1 Kết quả nuôi cấy sơ cấp
Nghiên cứu này trình bày 30 mẫu tế bào đơn nhân được chọc hút từ 30 con thỏ, sử dụng phương pháp nuôi cấy và tăng sinh theo hai bước: nuôi cấy sơ cấp (lần đầu) và nuôi cấy thứ cấp (cấy chuyển) Kết quả của quá trình nuôi cấy sơ cấp sau 15 ngày được thể hiện trong bảng dưới đây.
Bảng 3.4 Kết quả MSC thu được ở giai đoạn nuôi cấy sơ cấp (P0)
Tổng số tế bào đơn nhân sau ly tâm (x10 6 )/1ml tủy xương thỏ
Tổng tế bào bám dính đĩa nuôi cấy (x10 4 )/ tổng tế bào đơn nhân
Nhận xét: Qua bảng 3.4 nhận thấy số lượng tế bào gốc trung mô ở giai đoạn sơ cấp (P0) là 12.04 x 10 4 tế bào/tổng tế bào đơn nhân
Tế bào được phân lập từ tủy xương có hình dạng cầu và kích thước đa dạng khi quan sát dưới kính hiển vi soi ngược Sau khi nuôi cấy, có thể nhận biết và phân biệt một số loại tế bào qua hình dạng của chúng Trong mẫu, vẫn còn sót lại một ít hồng cầu có hình đĩa lõm 2 mặt, trong khi tế bào đơn nhân có kích thước nhỏ hơn và hình tròn đều.
Hình 3.1.Tế bào đơn nhân phân lập từ tủy xương thỏ sau ly tâm, chưa nuôi cấy (KHV soi ngược x 100)
Sau 24 giờ nuôi, một số tế bào bám vào đáy chai nuôi cấy và trải ra giống nguyên bào sợi Bên cạnh đó còn nhiều tế bào nổi lơ lửng trong dịch nuôi Những tế bào bám dính được cho là tế bào gốc trung mô
Sau 5-10 ngày nuôi cấy, hầu hết tế bào có dạng tế bào gốc trung mô và bám vào đáy chai, tuy nhiên ở giai đoạn này còn các tế bào nổi lơ lửng (Hình 3.2), (Hình 3.3)
Hình 3.2 Quần thể tế bào sau nuôi cấy 5 ngày KHV soi ngược (x200)
Sau 5 ngày nuôi cấy ở giai đoạn sơ cấp, quan sát thấy có sự xuất hiện của một số tế bào đơn nhân bên cạnh các tế bào có hình dạng tương tự tế bào gốc trung mô Mật độ tế bào trong môi trường nuôi cấy khá thưa, chiếm khoảng 20% diện tích bề mặt chai nuôi cấy Các tế bào này phát triển đa hướng trên bề mặt đĩa nuôi cấy.
Hình 3.3 Quần thể tế bào đơn nhân sau nuôi cấy 10 ngày KHV soi ngược (x200)
Nhận xét: Các tế bào có mật độ tương đối cao (80% diện tích bề mặt chai nuôi cấy)
Trong giai đoạn này, tế bào dạng nguyên bào sợi trở nên chiếm ưu thế so với các tế bào khác Khi mật độ tế bào tăng cao, sự tăng sinh của chúng diễn ra chậm hơn Đôi khi, một số vị trí xuất hiện tế bào co tròn và nổi lên, cho thấy dấu hiệu chết tế bào do thiếu dinh dưỡng Do đó, việc cấy chuyển là cần thiết để cung cấp không gian và dinh dưỡng cho các tế bào.
3.1.2.2.Kết quả nuôi cấy thứ cấp (cấy chuyển)
- Nuôi cấy trong chai nuôi flask
Sau 7-10 ngày nuôi cấy sơ cấp, quần thể bắt đầu hợp dòng và chiếm 70-80% diện tích bề mặt bình nuôi Thời điểm này thích hợp cho cấy chuyển
Sau 3 đến 5 ngày cấy chuyển, tế bào phát triển thành các cụm giống nguyên bào sợi Đến ngày thứ 7-8, các tế bào hợp dòng đã phủ kín bề mặt nuôi cấy.
Hình 3.4.Quần thể tế bào cấy chuyển lần 3 (P3) sau nuôi cấy 3 ngày KHV soi ngược (x 200)
Đến giai đoạn cấy chuyển lần 3, hầu hết các tế bào hình tròn đã giảm, chỉ còn lại các tế bào giống nguyên bào sợi Mật độ tế bào hiện tại khá thưa thớt, chiếm khoảng 20% diện tích bề mặt của chai nuôi cấy.
Hình 3.5.Quần thể tế bào cấy chuyển lần 3 (P3) sau nuôi cấy 5 ngày KHV soi ngược (x 200)
Sau 5 ngày nuôi cấy ở lần cấy chuyển thứ 3, các cụm tế bào đã bắt đầu lan rộng trên bề mặt chai nuôi, với mật độ tế bào đạt hơn 50% diện tích bề mặt.
Hình 3.6.Quần thể tế bào cấy chuyển lần 3 (P3) sau nuôi cấy 10 ngày KHV soi ngược (x 200)
Nhận xét: Sau 10 ngày nuôi cấy tế bào phủ gần kín bề mặt chai nuôi cấy Quần thể tế bào có dạng nguyên bào sợi tương đối thuần nhất
3.1.2.3 Theo dõi tăng sinh của tế bào nuôi cấy Để theo dõi tốc độ phát triển của tế bào nuôi cấy, chúng tôi xây dựng đường cong tăng trưởng bằng hệ thống X-celligence với mẫu tế bào thu hoạch ở giai đoạn P4, cấy trên đĩa 96 giếng điện cực bằng vàng chuyên dụng Sự phát triển của tế bào được biểu thị trên Biểu đồ 3.1
Biểu đồ 3.1 Tốc độ tăng trưởng tế bào đo dưới hệ thống X-celligence
Biểu đồ 3.1 cho thấy trong khoảng thời gian từ 0 đến 2 giờ, tế bào mới được nạp lên đĩa vẫn lơ lửng và chưa bám vào đĩa Từ 2 giờ đến 49 giờ, đường cong biểu đồ có độ dốc lớn, cho thấy sự tăng trưởng mạnh mẽ của tế bào Sau 50 giờ, đường biểu diễn bắt đầu có xu hướng đi ngang, cho thấy sự ổn định trong quá trình phát triển của tế bào.
Kết quả biệt hóa tế bào gốc trung mô thành tạo cốt bào và kết quả bảo quản sau biệt hóa
3.2.1 Kết quả biệt hóa tế bào gốc trung mô thành tạo cốt bào in vitro
Bảng 3.7 Kết quả định danh sau biệt hóa tế bào gốc trung mô tủy xương thành tạo cốt bào
Số mẫu tế bào định danh
Hóa mô miễn dịch Hiển vi điện tử
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng 15 mẫu để định danh tế bào, bao gồm 5 mẫu được nhuộm bằng kỹ thuật Alizarin red, 5 mẫu sử dụng kỹ thuật nhuộm hóa mô miễn dịch, và 5 mẫu áp dụng kỹ thuật hiển vi điện tử quét Tất cả các mẫu đều được lấy ngẫu nhiên Sự biệt hóa của các tế bào được đánh giá dựa trên các phương pháp này.
- Hình thái vi thể tế bào
- Sự khoáng hóa trong chất nền
- Biểu hiện marker bề mặt tế bào Kết quả biểu hiện bảng trên cho thấy tỷ lệ dương tính 100% ở cả ba kỹ thuật
Trong môi trường nuôi cấy thông thường, các tế bào không định hướng biệt hóa có hình dạng sợi với kích thước không đồng đều Ranh giới giữa tế bào và bề mặt nhựa nuôi cấy rất rõ nét.
Hình 3.18 Tế bào gốc trung mô nuôi cấy không biệt hóa
Sau 4 ngày nuôi cấy trong môi trường cảm ứng biệt hóa, tế bào bắt đầu có sự thay đổi về hình dạng, mặc dù phần lớn vẫn giữ hình dáng thon dài.
Sau 7 đến 14 ngày, tế bào co ngắn lại và hình thành dạng sao nhánh với bào tương ngắn, cùng với hình dáng giống như hạt đậu, đây là đặc trưng của tế bào xương Hình ảnh này tương tự như tế bào gốc đã biệt hóa thành tế bào chức năng.
Hình 3.19 Tế bào gốc trung mô sau 12 ngày biệt hóa theo hướng tạo cốt bào - (x500) MSC
Hình 3.20.Tế bào gốc trung mô sau biệt hóa theo hướng tạo cốt bào 21 ngày (x750)
Khi nhuộm tế bào bằng Alizarin red, tế bào và chất nền sẽ có màu đỏ cam, cho thấy sự kết hợp của thuốc nhuộm với ion canxi có trong tế bào và chất nền ngoại bào Điều này chứng tỏ rằng các tế bào gốc trung mô (MSC) đã chuyển hóa thành tế bào tạo xương, với sự lắng đọng canxi trong tế bào và chất nền Sau 30 ngày, dưới kính hiển vi điện tử, có thể quan sát thấy sự xuất hiện của các tinh thể khoáng trong tế bào đã biệt hóa.
Hình 3.21 cho thấy tế bào gốc trung mô sau 21 ngày biệt hóa, được nhuộm bằng Alizarin red với độ phóng đại 500 lần Tế bào và mô nền gian bào xuất hiện vùng bắt màu đỏ cam (mũi tên), cho thấy sự biểu hiện dương tính với Alizarin red.
Dưới kính hiển vi điện tử quét, các tế bào đang biệt hóa có hình dạng đa giác với các nhánh bào tương ngắn Qua thời gian, các tế bào này trở nên thô nhám do canxi tích tụ nhiều ở bề mặt Đến giai đoạn 30 ngày sau biệt hóa, tế bào thể hiện hình dạng đặc trưng của tế bào xương nuôi cấy in vitro, và chất nền ngoại bào cũng khoáng hóa rõ nét Các tinh thể khoáng tập trung thành đám trên bề mặt hoặc gần các tế bào đang biệt hóa.
Hình 3.22.Tế bào gốc trung mô sau biệt hóa 30 ngày dưới HVĐT quét (mũi tên)
Hình 3.23.Tế bào gốc trung mô sau biệt hóa 30 ngày dưới HVĐT quét Tinh thể khoáng hình thành rõ nét Tinh thể khoáng
Osteocalcin là một protein chủ yếu được sản xuất bởi tế bào tạo xương và được coi là chỉ số quan trọng của quá trình tạo xương Để xác định sự hiện diện của marker tế bào sau quá trình biệt hóa, phương pháp nhuộm hóa mô miễn dịch với kháng thể kháng osteocalcin được sử dụng Kết quả cho thấy các tế bào sau biệt hóa có phản ứng dương tính với kháng thể này, thể hiện qua màu đỏ đặc trưng (Hình 3.24).
Hình 3.24 Hình ảnh các tế bào sau biệt hóa 15 ngày trong môi trường cảm ứng tạo xương (nhuộmHMMD biểu hiện dương tính với marker osteocalcin (x200))
Tóm lại, 15 mẫu tế bào gốc trung mô đã được biệt hóa thành cốt bào, và kết quả từ ba phương pháp xác định cho thấy 100% mẫu đã thành công trong quá trình biệt hóa.
3.2.2 Kết quả ghép tế bào gốc trung mô biệt hóa theo hướng tạo cốt bào trên thực nghiệm
Nghiên cứu nhằm xác định khả năng tạo xương của tạo cốt bào biệt hóa từ tế bào gốc trung mô tủy xương thông qua quy trình thực nghiệm Chúng tôi đã thực hiện đánh giá khả năng tạo xương trên các mẫu tế bào ghép vào ổ khuyết xương thỏ, với sự kiểm soát đối chứng Kết quả cho thấy sau 3 và 6 tuần, nhóm nghiên cứu (bơm môi trường có tế bào) thể hiện sự tạo xương mới mạnh mẽ hơn, với diện tích vùng xương mới lớn hơn và số lượng tạo cốt bào nhiều hơn so với nhóm đối chứng (bơm môi trường không có tế bào).
A B Hình 3.25: Hình ảnh vi thể tại vùng xương ghép tế bào (A) và không ghép tế bào (B) sau 3 tuần (ảnh trên: H.E và Masson’s ảnh dưới) NB: xương mới hình thành
Hình 3.26: Hình ảnh vi thể vùng xương có bơm tế bào sau 3 tuần 1:
Xương mới; 2: Vùng đang lắng đọng can xi; 3: Các tạo cốt bào;
4: mạch máu (H.E) Quan sát trên các tiêu bản nhuộm H.E và Masson’s lấy ngẫu nhiên giữa nhóm mẫu có và không ghép tế bào, chúng tôi nhận thấy:
Diện tích xương mới (NB) trên tiêu bản vùng xương cắt qua lỗ khoan có bơm tế bào của thỏ nuôi 3 tuần lớn hơn so với vùng xương không bơm tế bào, cho thấy tác động tích cực của việc bơm tế bào lên sự phát triển của xương.
Vùng mô liên kết chưa hình thành xương trong nhóm được bơm tế bào gốc thể hiện rõ sự tạo xương với các hiện tượng như tăng sinh mạch máu, lắng đọng canxi, và sự xuất hiện của các tế bào sụn cùng đảo sụn Ngược lại, hiện tượng này diễn ra chậm hơn ở nhóm không ghép tế bào.
Nhóm có bơm tế bào cho thấy sự xuất hiện nhiều tạo cốt bào trên các vách xương, trong khi nhóm không bơm tế bào ít thấy hơn Hình ảnh siêu cấu trúc từ hiển vi điện tử quét cho thấy rõ ràng sự hiện diện của các tế bào tham gia tạo xương mới trong vùng xương có bơm tế bào, bao gồm cả hủy cốt bào.
A B Hình 3.27: Hình ảnh siêu vi thể tại vùng xương ghép tế bào (A) và không ghép tế bào (B) sau 6 tuần (Hiển vi điện tử quét SEM).
Kết quả bảo quản tạo cốt bào sau biệt hóa
Chúng tôi đã bảo quản 90 mẫu tế bào được phân lập từ tủy xương thỏ sau khi nuôi cấy biệt hóa định hướng thành tạo cốt bào, sử dụng ba môi trường bảo quản khác nhau (MT1, MT2, MT3) với tỷ lệ FBS lần lượt là 0%, 15% và 30% Quy trình thí nghiệm được thực hiện đồng nhất cho tất cả các đợt, với việc sử dụng thiết bị và hóa chất đồng bộ Mật độ tế bào và điều kiện nuôi cấy cũng được duy trì ổn định Kết quả về tỷ lệ tế bào sống sau khi bảo quản được trình bày trong bảng và biểu đồ dưới đây.
Vùng xương mới hình thành
Bảng 3.8 Tỷ lệ tế bào sống trung bình sau rã đông ở các môi trường
Thông số nghiên cứu Môi trường bảo quản
Giá trị nhỏ nhất (min)
Giá trị lớn nhất (max)
Giá trị trung bình (Mean ± SD) p
MT2 (n0) 72,4 92,96 82,19 ± 5,45 P2,3 < 0.001 MT3 (n0) 76 93,05 87,07 ± 4,18 P 1,3 < 0.001 (1,2: MT1 so với MT2; 2,3: MT2 so với MT3; 1,3: MT1 so với MT3)
Biểu đồ 3.2 Biểu đồ biểu thị tỷ lệ tế bào sống sau bảo quản ở các môi trường khác nhau
Từ bảng và biểu đồ, tỷ lệ tế bào sống trung bình sau khi bảo quản ở môi trường 1 là thấp nhất với 61,28 ± 3,89 Trong khi đó, môi trường 2 ghi nhận tỷ lệ 82,19 ± 5,45, và môi trường 3 có tỷ lệ tế bào sống cao nhất là 87,07 ± 4,18 Sự khác biệt giữa các môi trường này có ý nghĩa thống kê với p < 0,001.
Mối liên quan về tỷ lệ tế bào sống với các môi trường bảo quản khác nhau thể hiện ở các biểu đồ dưới đây:
Biểu đồ 3.3 Mối liên quan giữa tỷ lệ tế bào sống với tỷ lệ huyết thanh có trong môi trường MT1 và MT2
Tỷ lệ tế bào sống sau khi bảo quản trong môi trường MT1 và MT2 cho thấy mối tương quan tuyến tính thuận, với hệ số tương quan trung bình là r=0,437.
Biểu đồ 3.4 Mối liên quan giữa tỷ lệ tế bào sống với tỷ lệ hyết thanh có trong môi trường MT1 và MT3
Tỷ lệ tế bào sống sau khi bảo quản trong môi trường MT1 và MT3 cho thấy mối tương quan tuyến tính thuận, mặc dù ở mức độ thấp, với hệ số tương quan là r=0,262.
Biểu đồ 3.5 Mối liên quan giữa tỷ lệ tế bào sống với tỷ lệ hyết thanh có trong môi trường MT2 và MT3
Tỷ lệ tế bào sống sau khi bảo quản trong môi trường MT2 và MT3 cho thấy mối tương quan tuyến tính thuận ở mức độ trung bình, với hệ số tương quan r=0,316 Điều này chứng minh rằng FBS có tác dụng tích cực trong việc tăng tỷ lệ tế bào sống sau bảo quản, mặc dù mức độ tác động chỉ ở mức trung bình.
3.3.2 Kết quả phát triển tiếp theo sau bảo quản
90 mẫu tế bào bảo quản được nuôi cấy tiếp, theo dõi 10 ngày sau kết quả cho thấy các tế bào vẫn tiếp tục phát triển bình thường
Về hình dạng tế bào sau bảo quản: Không quan sát thấy sự bất thường về hình dạng tế bào sau bảo quản ở cả 3 nhóm (Hình 3.28), (Hình 3.29)
Hình 3.28 Hình dạng tế bào trước bảo quản (x150)
A B C Hình 3.29.Hình dạng tế bào sau bảo quản ở các môi trường MT1 (A), MT2
Sau rã đông và tiến hành nuôi cấy tiếp thấy tế bào vẫn phát triển như trước bảo quản
Từ kết quả trên, chúng tôi rút ra nhận xét về các điều kiện tiến hành bảo quản lạnh tế bào như sau:
- Mật độ tế bào đưa vào bảo quản: 10 6 -10 7 TB/ml
- Môi trường bảo quản là môi trường cơ bản có bổ sung DMSO 10% và FBS tối thiểu là15%
- Nhiệt độ bảo quản - 135 độ C hoặc thấp hơn
- Các đặc điểm về hình thái, khả năng phát triển tiếp theo không thay đổi sau bảo quản.
BÀN LUẬN
Tách chiết, phân lập, nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc trung mô tủy xương
4.1.1 Về kết quả chọc hút tủy xương, tách chiết, phân lập tế bào gốc
Chọc hút tủy xương để phân lập tế bào là bước đầu tiên và cũng là bước quan trọng nhất trong quá trình nghiên cứu Việc chọc hút không thành công có thể dẫn đến việc không thu được mẫu tế bào hoặc mẫu không đạt tiêu chuẩn cho các nghiên cứu tiếp theo.
- Lựa chọn phương pháp giảm đau Trong kỹ thuật chọc hút tủy xương, giảm đau là một khâu quan trọng
Giảm đau không đúng cách có thể gây ra nhiều vấn đề cho động vật, bao gồm tắc kim và tổn thương xương tại vùng chọc hút Hơn nữa, việc sử dụng quá liều thuốc giảm đau có thể dẫn đến cái chết của động vật Do đó, chúng tôi đã nghiên cứu và lựa chọn một trong ba phương pháp giảm đau phù hợp, bao gồm gây mê tĩnh mạch, gây tê tại chỗ và gây mê phối hợp gây tê, sau khi tham khảo các thủ thuật này trên người Kết quả nghiên cứu cho thấy
- Gây tê tại chỗ bằng novocain không đủ giảm đau để chọc hút tủy xương
Gây mê thỏ bằng thiopental với liều 20mg/kg qua tĩnh mạch rìa tai giúp giảm đau cho thủ thuật chọc hút tủy xương Tuy nhiên, việc kiểm soát liều lượng thuốc mê cho thỏ thường gặp khó khăn; nếu gây mê quá sâu, thỏ có nguy cơ chết hoặc lâu tỉnh, trong khi nếu gây mê chưa đủ sâu, thỏ có thể căng cơ và giãy đạp, dẫn đến thất bại trong quá trình chọc hút tủy.
Gây mê thỏ bằng thiopental với liều 17mg/kg qua đường tĩnh mạch rìa tai, kết hợp với gây tê tiêm tại chỗ bằng novocain, là phương pháp giảm đau hiệu quả nhất Phương pháp này không chỉ giúp giảm liều gây mê mà còn rút ngắn thời gian gây mê và giảm đau một cách tối ưu.
- Lựa chọn vị trí chọc dịch tủy xương
Vị trí chọc hút rất quan trọng, vì nếu chọc không đúng sẽ không hút được tủy, lượng dịch tủy ít
Chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm chọc hút tủy xương tại vị trí ụ ngồi của thỏ, nhưng không đạt được kết quả thành công Phẫu tích sau đó cho thấy ụ ngồi của thỏ có vị trí thấp và kích thước nhỏ, khiến cho việc chọc rất khó khăn và dễ dẫn đến vỡ xương.
Vị trí chọc tại mấu chuyển xương đùi trên 5 thỏ không đạt được kết quả khả quan, do khó khăn trong việc cố định vị trí chọc, lượng tủy ít, gây tổn thương nặng và thời gian hồi phục kéo dài.
Vị trí chọc hút tủy xương ở mào chậu là lựa chọn tối ưu cho thỏ, vì nó dễ xác định và cố định, đồng thời ít gây tổn thương và cho phép phục hồi nhanh chóng Trong nghiên cứu này, 30 thỏ đã được thực hiện chọc hút tủy xương thành công tại vị trí này.
Kỹ thuật chọc hút tủy xương yêu cầu chọn điểm chọc hút chính xác, sau đó rạch da khoảng 1cm Để đảm bảo kim không bị trượt, nên sử dụng mũi dao để bóc tách nhẹ màng xương, giúp lộ ra xương xốp Quy trình này tạo điều kiện thuận lợi cho việc chọc kim vào xương một cách nhẹ nhàng và đúng hướng.
Dùng kim chọc tủy troca loại 2’’-13 gauge kèm nòng chọc hơi chếch ra trước và nghiêng khoảng 30 0 cho phù hợp đặc điểm giải phẫu của xương
Khi kim được đưa qua bản xương đặc, cần chọc và xoay nhẹ cho đến khi đạt độ sâu 8mm vào phần xốp của xương chậu Sau đó, xoay nhẹ kim ngược chiều xoay thông thường và rút kim ra khoảng 1mm trước khi rút nòng kim Lưu ý rằng không nên lắc kim, vì điều này có thể làm rộng miệng lỗ chọc ở thành xương.
Hút dịch tủy xương được thực hiện bằng bơm tiêm 3ml đã được tráng sẵn dung dịch chống đông Mỗi lần hút, lượng dịch tủy xương thu được dao động từ 0,5-1ml Sau đó, bơm tiêm sẽ được thay mới để giảm thiểu độ pha loãng với máu ngoại vi, đồng thời ngăn ngừa hiện tượng đông máu.
Một số lưu ý: vỡ xương, nguyên nhân do: vị trí chọc bị lệch, chọc không chuẩn hướng, chọc sâu quá hoặc động tác chọc thô bạo
Việc không hút được tủy xương hoặc chỉ hút được một lượng rất ít có thể do nhiều nguyên nhân như kim chọc chưa tới vị trí cần thiết, bị cản trở bởi màng xương, vụn xương, hoặc cục máu đông làm tắc đầu kim Ngoài ra, không tạo được áp lực âm khi hút hoặc xuất hiện nhiều bọt có thể do bơm tiêm không được gắn chặt hoặc miệng lỗ chọc ở thành xương quá rộng.
- Dịch tủy xương lấy ra được cho vào ngay các ống Falcon loại 15ml đã có sẵn Heparine để chống đông
Quy trình chọc hút dịch tủy xương sẽ được thực hiện tương tự ở bên mào chậu đối diện, với thể tích dịch chọc hút khoảng 5ml mỗi bên, tổng lượng dịch tủy xương thu được khoảng 10ml cho mỗi con thỏ.
Lượng dịch tủy tối ưu cho việc tách chiết và nuôi cấy tế bào ở thỏ là khoảng 10ml, giúp đảm bảo sự sống sót và phục hồi tốt cho động vật Kết quả này cũng đồng nhất với nhận định của một số tác giả như Huang JW và Xie XH.
Sau lần chọc tủy đầu tiên khoảng một tháng, thỏ có thể được chọc tủy lần hai, nhưng lượng dịch tủy thu được chỉ đạt 60-80% so với lần đầu Theo kinh nghiệm, không nên thực hiện chọc tủy lần ba vì lượng tủy thu được thường rất ít do mô liên kết đã xâm nhập và thay thế tủy xương sau các lần chọc trước đó.
Hình 4.1 Vị trí giải phẫu chọc tủy xương trên thỏ Vấn đề xử lý dịch tủy xương sau khi hút được rất quan trọng.Yêu cầu
Vị trí chọc tủy cần được xác định chính xác và thao tác thực hiện phải nhanh chóng, dứt khoát Nếu chậm trễ, tủy có thể bị đông lại, và nếu bơm không đúng cách sẽ tạo ra bọt, ảnh hưởng đến chất lượng của tủy.
Biệt hóa tế bào gốc trung mô thành tạo cốt bào và bảo quản tế bào sau biệt hóa
4.2.1 Biệt hóa tế bào gốc trung mô thành tạo cốt bào in vitro 4.2.1.1 Môi trường biệt hóa
Môi trường nuôi cấy của chúng tôi bao gồm DMEM low glucose (sigma), 10% FBS (Gibico), 1% kháng sinh-kháng nấm (sigma), 50μg/ml Ascorbic (sigma), 0,1μM dexamethasone (sigma) và 100mM β-glycerolphosphate (sigma) Quy trình nuôi cấy được thực hiện theo phương pháp của tác giả Shahdadfar A (2005).
Sau 7-14 ngày nuôi cấy, tế bào có sự thay đổi hình thái và xuất hiện tinh thể khoáng Biệt hóa rõ rệt sau 30 ngày, với hình ảnh khoáng hóa được quan sát rõ dưới kính hiển vi điện tử (Hình 323) Kết quả nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với các nghiên cứu trước đó của một số tác giả.
Theo tác giả Noriko K (2005) biệt hóa MSCs thành dạng tạo cốt bào trong môi trường có 10 mM β-glycerophosphate disodium salt, 0.07 mM L- ascorbic acid 2 phosphate magnesium salt n- hydrate và 0.1 M Dexamethasone
Nhóm chứng môi trường nuôi cấy chỉ chứa 10mM β-glycerophosphate disodium salt và thời gian biệt hóa là 2 tuần Kết quả cho thấy nhóm nuôi cấy có dexamethasone dẫn đến sự khoáng hóa với lắng đọng canxi ở chất nền, trong khi nhóm không có dexamethasone không ghi nhận sự tạo khoáng.
Rogerio P (2011) môi trường biệt hóa có 10 -8 M dexamethasone, 50àg/ml ascorbic acid và 10mM β – glycerophosphate Thời gian biệt húa là 3 tuần [116]
Trong nghiên cứu của Jaiswal N (1997), môi trường biệt hóa được thiết lập với 100nM Dex, 10mM glycerolphosphate và 0,05mM ascorbic acid trong môi trường DMEM Quan sát vào ngày thứ 4 cho thấy hình thái tế bào chuyển từ hình con suốt sang hình đa diện, với khoảng 30-40% tế bào có phản ứng dương tính với Alkaline phosphatase (ALP) Sau 8 ngày, hầu hết các tế bào đều có hình lập phương hoặc hình đa diện, và hơn 80% tế bào có phản ứng dương tính ALP Vào ngày thứ 12, hiện tượng khoáng hóa bắt đầu xuất hiện, và đến ngày thứ 16, sự khoáng hóa trở nên rõ ràng, với hầu hết tế bào có phản ứng dương tính ALP và không còn hình thái của tế bào gốc trung mô (MSC).
Nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sử dụng Dex trong nồng độ từ 1-1000nM trong 16 ngày ảnh hưởng đến quá trình biệt hóa tạo xương của MSC Vào ngày thứ 8, MSC nuôi cấy trong môi trường tạo xương với nồng độ Dex từ 1-1000nM cho thấy hoạt tính ALP tăng từ 3-8 lần so với nhóm chứng Cụ thể, nồng độ 1nM Dex kích thích tạo ALP nhưng hình thái tế bào vẫn giống nguyên bào sợi mà không có sự khoáng hóa Ở nồng độ 10nM, hoạt tính ALP tăng rõ rệt và tế bào có hình thái giống tạo cốt bào, trong khi ở 100nM Dex, sự lắng đọng khoáng hóa rõ rệt hơn Cuối cùng, nồng độ 1000nM Dex dẫn đến sự khoáng hóa mạnh hơn so với 100nM, nhưng vào ngày thứ 16 có hiện tượng bong tế bào.
Bruder SP (1997) đã nghiên cứu quá trình nuôi cấy và biệt hóa tế bào gốc mesenchymal (MSC) thành tạo cốt bào trong môi trường có 100nM dex, 10mM β-GP và 0,05mM axit ascorbic Kết quả cho thấy sự thay đổi hình thái tế bào, với sự gia tăng hoạt tính alkaline phosphatase (ALP) và sự khoáng hóa trong chất nền Cụ thể, ALP tăng từ 30-40% vào ngày thứ 4 lên 90% vào ngày thứ 12, sau đó giảm dần vào ngày thứ 16 Sự giảm ALP ở giai đoạn cuối của quá trình biệt hóa liên quan đến sự gia tăng khoáng hóa và lắng đọng canxi trong chất nền của tế bào xương, trong khi hoạt tính ALP đạt đỉnh vào ngày thứ 8 trước khi giảm từ P1 đến P10.
Phương pháp kinh điển để biệt hóa tế bào gốc mesenchymal (MSC) thành tạo cốt bào là nuôi cấy MSC trong môi trường chứa dexamethason, acid ascorbic và β-glycerophosphate Sự bổ sung các yếu tố tăng trưởng như BMP vào môi trường nuôi cấy sẽ làm tăng cường quá trình biệt hóa tạo cốt bào của MSC.
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng vitamin D đóng vai trò quan trọng trong quá trình biệt hóa tạo cốt bào, cùng với việc điều hòa nhiều gene liên quan đến tạo cốt bào Các báo cáo cho thấy vitamin D (1,25D) không chỉ ức chế sự tăng sinh mà còn tăng cường biệt hóa của tạo cốt bào.
1,25-dihydroxyvitamin D đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa gen tạo cốt bào và biểu hiện protein chất nền xương như Runx2, là chìa khóa cho quá trình biệt hóa xương Trong giai đoạn tiền khoáng và khoáng hóa ở gà, có khoảng 0.6% gen được điều hòa bởi 1,25D3, cho thấy sự tăng cường phiên mã Vitamin D (1,25D3) cũng có tác dụng trong việc tạo ra các sản phẩm tinh thể khoáng nhỏ trong giai đoạn tiền khoáng hóa, làm thay đổi chất nền protein ngoại bào Sự khoáng hóa và đặc điểm sinh học của các tinh thể khoáng, cùng với tín hiệu từ 1,25D3, nhấn mạnh tầm quan trọng của các tinh thể khoáng trong việc duy trì sự chắc khỏe của xương thông qua trạng thái khoáng hóa tối ưu.
Vitamin D đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa hoạt động của tế bào tạo cốt, và ảnh hưởng của nó thay đổi tùy theo từng giai đoạn phát triển của tế bào này.
Gãy xương không tự hồi phục là một thách thức lớn trong phẫu thuật chấn thương chỉnh hình Quá trình lành xương phụ thuộc vào sự biệt hóa của MSC, cytokin và các yếu tố điều hòa, giúp tăng sinh và biệt hóa thành tế bào xương Tuy nhiên, một số tổn thương không thể liền lại, dẫn đến tình trạng gãy xương khó liền, gây hạn chế chức năng cho bệnh nhân.
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra vai trò quan trọng của tế bào gốc trong việc hồi phục gãy xương không tự hàn gắn, đặc biệt là việc biệt hóa tế bào gốc trung mô (MSC) thành tế bào gốc mô xương Khả năng này mở ra cơ hội ứng dụng liệu pháp tế bào gốc trong tái tạo mô xương, đồng thời cung cấp những bằng chứng khoa học có giá trị về vai trò định hướng dòng trong điều trị tái tạo xương.
4.2.1.2 Các yếu tố tham gia biệt hóa
Sự hợp dòng và biệt hóa của MSC thành dòng xương được điều hòa bởi nhiều yếu tố, trong đó MSC biệt hóa thành tiền tạo cốt bào có hình elip với nhân nằm dọc Giai đoạn đầu của biệt hóa tế bào vẫn duy trì tiềm năng tăng sinh và biểu hiện các yếu tố như Runx2, DLx5, MSx2 cùng với một số marker của tạo cốt bào như ALP, collagen type I và osteopontin (OPN), nhưng mức độ biểu hiện các marker này thấp hơn ở tạo cốt bào trưởng thành ALP là protein biểu hiện sớm và có vai trò quan trọng trong việc điều hòa sự khoáng hóa Quá trình biệt hóa từ tiền tạo cốt bào đến tạo cốt bào trưởng thành liên quan đến β-catenin, Runx2 và Osx, tạo ra các tế bào phẳng hình con suốt, biểu hiện protein chất nền xương như BSP và OPN.
Trong giai đoạn sau của quá trình tạo cốt bào trưởng thành, Runx2 bị ức chế, trong khi Osx xuất hiện ở giai đoạn cuối và kích thích sự biểu hiện của osteocalcin Khi tế bào hoàn tất quá trình biệt hóa, chúng có hình dạng khối và tiến hành khoáng hóa vào chất nền vô cơ Bên trong bào tương, bộ Golgi và lưới nội bào có hạt phát triển mạnh mẽ, dẫn đến việc gia tăng sản phẩm protein Mặc dù sự biểu hiện của OPN giảm ở cốt bào trưởng thành, nhưng các protein như P2X5, alkaline phosphatase, collagen typ I và osteocalcin lại tăng lên đáng kể.
Hình 4.2 Sự thay đổi hình thái và các yếu tố liên quan giai đoạn biệt hóa
MSC thành tạo cốt bào [48]
4.2.1.3 Định danh tế bào gốc trung mô sau biệt hóa thành tạo cốt bào
Sau ba tuần biệt hóa, tế bào chuyển từ hình dạng nguyên bào sợi giống hình sao sang hình hạt đậu Nhuộm hóa mô alizarin red cho thấy tế bào và chất nền có màu đỏ cam, chỉ ra sự lắng đọng canxi Quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét cho thấy sự hình thành tinh thể khoáng màu trắng Nhuộm hóa mô miễn dịch cho thấy tế bào biểu hiện dương tính với marker osteocalcin, chỉ ra sự hiện diện của tạo cốt bào.
Hình 4.3 Nhuộm hóa mô miễn dịch với marker osteocalcin của tạo cốt bào sau biệt hóa 18 ngày (x500)
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp tác giả Nadri S (2007)