red.(x 500). Tế bào và mơ nền gian bào có vùng bắt màu đỏ cam (mũi tên), có
biểu hiện dương tính với Alizarin red. Tạo cốt bào
Dưới kính hiển vi điện tử quét cho thấy các tế bào đang biệt hố có dạng hình đa giác với các nhánh bào tương ngắn. Càng về sau, các tế bào được cảm ứng biệt hóa càng trở nên thơ nhám do hiện tượng canxi tích tụ nhiều ở bề mặt tế bào. Ở giai đoạn 30 ngày sau biệt hóa các tế bào có hình dạng đặc trưng của tế bào xương nuôi cấy in vitro và chất nền ngoại bào cũng khống hóa rõ nét. Các tinh thể khống tập trung thành đám trên bề mặt hoặc lân cận tế bào đang biệt hố (Hình 3.22), (Hình 3.23).
Hình 3.22.Tế bào gốc trung mơ sau biệt hóa 30 ngày dưới HVĐT qt (mũi tên).
Hình 3.23.Tế bào gốc trung mơ sau biệt hóa 30 ngày dưới HVĐT qt. Tinh thể
khống hình thành rõ nét
Osteocalcin là protein được tổng hợp nhiều trong tế bào tạo xương và được xem là marker của tế bào tạo xương. Để xác định marker tế bào sau biệt hóa bằng phương pháp nhuộm hóa mơ miễn dịch với kháng thể kháng osteocalcin. Kết quả cho thấy các tế bào sau biệt hóa dương tính với kháng thể kháng osteocalcin biểu hiện tế bào bắt màu đỏ (Hình 3.24).
Hình 3.24. Hình ảnh các tế bào sau biệt hóa 15 ngày trong mơi trường cảm ứng tạo xương (nhuộmHMMD biểu hiện dương tính với marker
osteocalcin (x200)).
Tóm lại,15 mẫu tế bào gốc trung mơ được biệt hóa theo hướng tạo cốt bào, sau biệt hóa định danh bằng 3 phương pháp đặc hiệu với phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên cho thấy 100% các mẫu đã được biệt hóa thành cơng.
3.2.2. Kết quả ghép tế bào gốc trung mơ biệt hóa theo hướng tạo cốt bào trên thực nghiệm
Nhằm xác định khả năng tạo xương của tạo cốt bào được biệt hóa từ tế bào gốc trung mơ tủy xương theo quy trình thực nghiệm, ngồi việc định danh dựa theo các tiêu chuẩn, chúng tôi đánh giá thêm khả năng tạo xương của chúng trên thực nghiệm có đối chứng. Sau ghép tế bào vào ổ khuyết xương thỏ, đánh giá sự phát triển của xương ở các thời điểm 3 tuần và 6 tuần trên các tiêu bản vi thể nhuộm bằng 2 phương pháp Hematoxylin Eosin và Masson’s. Kết quả cho thấy trên các tiêu bản của nhóm nghiên cứu (bơm mơi trường có tế bào) có dấu hiệu của sự tạo xương mới mạnh mẽ hơn như diện tích vùng xương mới nhiều hơn, có nhiều tạo cốt bào hơn nhóm đối chứng (bơm mơi trường khơng có tế bào). (Hình 3.25 và 3.26).
A B Hình 3.25: Hình ảnh vi thể tại vùng xương ghép tế bào (A) và không
ghép tế bào (B) sau 3 tuần (ảnh trên: H.E và Masson’s ảnh dưới). NB: xương mới hình thành.
NB
NB NB
Hình 3.26: Hình ảnh vi thể vùng xương có bơm tế bào sau 3 tuần. 1: Xương mới; 2: Vùng đang lắng đọng can xi; 3: Các tạo cốt bào;
4: mạch máu. (H.E)
Quan sát trên các tiêu bản nhuộm H.E và Masson’s lấy ngẫu nhiên giữa nhóm mẫu có và khơng ghép tế bào, chúng tơi nhận thấy:
Diện tích xương mới (NB) trên tiêu bản vùng xương cắt qua lỗ khoan có bơm tế bào của thỏ ni 3 tuần lớn hơn so với vùng xương không bơm tế bào. (Hình3.25)
Vùng mơ liên kết nơi chưa hình thành xương ở nhóm có bơm tế bào gốc có biểu hiện mạnh mẽ của sự tạo xương như tăng sinh mạch máu, lắng đọng can xi, xuất hiện các tế bào sụn, đảo sụn. Hiện tượng này xảy ra chậm chạp ở nhóm khơng ghép tế bào. (Hình 3.25)
Xuất hiện nhiều tạo cốt bào trên các vách xương ở nhóm có bơm tế bào, ít thấy hơn ở nhóm khơng bơm tế bào (Hình 3.26)
Trên hình ảnh siêu cấu trúc (Hiển vi điện tử quét), vùng xương có bơm tế bào xuất hiện các tế bào tham gia tạo xương mới khá rõ, trong đó có cả hủy cốt bào. (Hình 3.27) 1 3 2 3 4 1 3
A B
Hình 3.27: Hình ảnh siêu vi thể tại vùng xương ghép tế bào (A) và không ghép tế bào (B) sau 6 tuần (Hiển vi điện tử quét SEM). 3.3. Kết quả bảo quản tạo cốt bào sau biệt hóa
3.3.1.Tỷ lệ tế bào sống sau bảo ở các mơi trường có nồng độ huyết thanh khác nhau (MT1, MT2, MT3).
Chúng tôi tiến hành bảo quản 90 mẫu tế bào được phân lập từ tủy xương thỏ sau khi ni cấy biệt hóa định hướng dạng tạo cốt bào, môi trường bảo quản khác nhau MT1, MT2, MT3 có thay đổi tỷ lệ FBS: 0%, 15% và 30% Quy trình tiến hành như nhau cho các đợt thí nghiệm. Sử dụng các thiết bị, dụng cụ hóa chất đồng bộ trong q trình thí nghiệm. Mật độ tế bào, điều kiện ni là đồng nhất. Kết quả tỷ lệ tế bào sống sau bảo quản theo bảng, biểu đồ dưới đây:
Hủy cốt bào Vùng xương mới hình thành Vùng xương chủ
Bảng 3.8. Tỷ lệ tế bào sống trung bình sau rã đơng ở các môi trường MT1,MT2,MT3
Thông số nghiên cứu Môi trường bảo quản
Giá trị nhỏ nhất (min) Giá trị lớn nhất (max) Giá trị trung bình (Mean ± SD) p MT1 (n=30) 50,9 68,1 61,28 ± 3,89 P1,2<0.001 MT2 (n=30) 72,4 92,96 82,19 ± 5,45 P2,3 < 0.001 MT3 (n=30) 76 93,05 87,07 ± 4,18 P1,3 < 0.001
(1,2: MT1 so với MT2; 2,3: MT2 so với MT3; 1,3: MT1 so với MT3)
Biểu đồ 3.2. Biểu đồ biểu thị tỷ lệ tế bào sống sau bảo quản ở các môi trường khác nhau
Nhận xét: Từ bảng và biểu đồ ta thấy tỷ lệ tế bào sống trung bình sau bảo quản ở mơi trường 1 có tỷ lệ thấp nhất: 61,28 ± 3,89, mơi trường 2: 82,19 ± 5,45, mơi trường 3 có tỷ lệ tế bào sống cao nhất là 87,07 ± 4,18. Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,001).
Mối liên quan về tỷ lệ tế bào sống với các môi trường bảo quản khác nhau thể hiện ở các biểu đồ dưới đây:
Biểu đồ 3.3. Mối liên quan giữa tỷ lệ tế bào sống với tỷ lệ huyết thanh có trong mơi trường MT1 và MT2
Nhận xét: Tỷ lệ tế bào sống sau khi bảo quản ở mơi trường MT1, MT2 có mối tương quan tuyến tính thuận, ở mức độ trung bình với hệ số tương quan của tỷ lệ tế bào sống sau bảo quản ở 2 môi trường là r=0,437.
Biểu đồ 3.4. Mối liên quan giữa tỷ lệ tế bào sống với tỷ lệ hyết thanh có trong mơi trường MT1 và MT3
Nhận xét: Tỷ lệ tế bào sống sau khi bảo quản ở môi trường MT1, MT3 có mối tương quan tuyến tính thuận, ở mức độ thấp với hệ số tương quan của tỷ lệ tế bào sống sau bảo quản ở 2 môi trường là r=0,262.
Biểu đồ 3.5. Mối liên quan giữa tỷ lệ tế bào sống với tỷ lệ hyết thanh có trong mơi trường MT2 và MT3
Nhận xét:Tỷ lệ tế bào sống sau khi bảo quản ở môi trường MT2, MT3 có mối tương quan tuyến tính thuận, ở mức độ trung bình với hệ số tương quan của tỷ lệ tế bào sống sau bảo quản ở 2 môi trường là r=0,316. Điều này chứng tỏ rằng FBS có tác dụng làm tăng tỷ lệ tế bào sống sau bảo quản nhưng ở mức độ trung bình.
3.3.2. Kết quả phát triển tiếp theo sau bảo quản
90 mẫu tế bào bảo quản được nuôi cấy tiếp, theo dõi 10 ngày sau kết quả cho thấy các tế bào vẫn tiếp tục phát triển bình thường.
Về hình dạng tế bào sau bảo quản: Không quan sát thấy sự bất thường về hình dạng tế bào sau bảo quản ở cả 3 nhóm (Hình 3.28), (Hình 3.29)
Hình 3.28. Hình dạng tế bào trước bảo quản (x150)
A B C
Hình 3.29.Hình dạng tế bào sau bảo quản ở các môi trường MT1 (A), MT2 (B), MT3(C)( x 150).
Sau rã đông và tiến hành nuôi cấy tiếp thấy tế bào vẫn phát triển như trước bảo quản.
Từ kết quả trên, chúng tôi rút ra nhận xét về các điều kiện tiến hành bảo quản lạnh tế bào như sau:
- Mật độ tế bào đưa vào bảo quản: 106 -107 TB/ml
- Môi trường bảo quản là mơi trường cơ bản có bổ sung DMSO 10% và FBS tối thiểu là15%.
- Nhiệt độ bảo quản - 135 độ C hoặc thấp hơn.
- Các đặc điểm về hình thái, khả năng phát triển tiếp theo không thay đổi sau bảo quản.
Chương 4 BÀN LUẬN BÀN LUẬN
4.1.Tách chiết, phân lập, nuôi cấy tăng sinh tế bào gốc trung mô tủy xương. 4.1.1. Về kết quả chọc hút tủy xương, tách chiết, phân lập tế bào gốc 4.1.1. Về kết quả chọc hút tủy xương, tách chiết, phân lập tế bào gốc
Chọc hút tủy xương để phân lập tế bào là giai đoạn đầu tiên nhưng có thể nói là quan trọng nhất. Nếu chọc hút khơng thành cơng sẽ khơng có hoặc không đạt chuẩn cho các mẫu tế bào nghiên cứu tiếp theo.
- Lựa chọn phương pháp giảm đau
Trong kỹ thuật chọc hút tủy xương, giảm đau là một khâu quan trọng. Giảm đau không tốt động vật cử động trong khi đang chọc hút có thể gây tắc kim, tổn thương xương vùng chọc. Giảm đau quá liều có thể gây chết động vật. Vì vậy, chúng tôi nghiên cứu lựa chọn 1 trong 3 phương pháp giảm đau phù hợp sau khi tham khảo thủ thuật này trên người, gây mê tĩnh mạch, gây tê tại chỗ, gây mê phối hợp gây tê. Chúng tôi nhận thấy:
- Gây tê tại chỗ bằng novocain không đủ giảm đau để chọc hút tủy xương. - Gây mê thỏ bằng thiopental với liều 20mg/kg cân nặng qua đường tĩnh mạch rìa tai đơn thuần đảm bảo được việc giảm đau cho thủ thuật chọc hút tủy xương. Tuy nhiên thực tế cho thấy, lượng thuốc mê cho thỏ thường khó kiểm sốt liều phù hợp; nếu gây mê sâu thỏ dễ bị chết hoặc lâu tỉnh; nếu gây mê chưa đủ sâu, thỏ bị căng cơ, giãy đạp và gây thất bại cho việc chọc hút tủy.
- Gây mê thỏ bằng thiopental, với liều 17mg/kg cân nặng qua đường tĩnh mạch rìa tai kết hợp gây tê tiêm tại chỗ bằng novocain là phương pháp giảm đau phù hợp nhất. Phương pháp này giúp giảm liều gây mê, giảm thời gian gây mê và giảm đau tốt.
- Lựa chọn vị trí chọc dịch tủy xương
Vị trí chọc hút rất quan trọng, vì nếu chọc khơng đúng sẽ không hút được tủy, lượng dịch tủy ít.
Năm thỏ được chúng tơi chọn để thử nghiệm chọc hút tủy xương tại vị trí ụ ngồi 2 bên, nhưng đều khơng thành cơng. Việc phẫu tích ụ ngồi sau đó cho thấy, ụ ngồi của thỏ có vị trí thấp, tư thế chọc rất khó; mặt khác, ụ ngồi có kích thước nhỏ, khi chọc dễ làm vỡ xương.
Vị trí chọc tại mấu chuyển xương đùi được thực hiện trên 5 thỏ cũng không thành cơng, do khó cố định vị trí chọc, lượng tủy ít, tổn thương nặng, lâu hồi phục.
Vị trí chọc tại mào chậu phù hợp nhất cho việc chọc hút tủy xương thỏ: mào chậu quan sát rõ khi thỏ ngồi; vị trí ở nơng, dễ xác định, dễ cố định, ít gây tổn thương khi chọc và phục hồi nhanh sau chọc. 30 thỏ trong nghiên cứu này đều được chọc hút tủy xương thành cơng tại vị trí mào chậu.
- Kỹ thuật chọc hút tủy xương
Sau khi lựa chọn điểm chọc hút, có thể rạch da khoảng 1cm. Để kim không bị trượt, theo kinh nghiệm chúng tơi dùng mũi dao bóc tách nhẹ màng xương bộc lộ xương xốp. Việc làm này tạo điều kiện cho kim khi chọc vào xương nhẹ nhàng, đúng hướng.
Dùng kim chọc tủy troca loại 2’’-13 gauge kèm nòng chọc hơi chếch ra trước và nghiêng khoảng 300 cho phù hợp đặc điểm giải phẫu của xương. Khi kim qua bản xương đặc, vừa chọc vừa xoay nhẹ tới độ sâu 8mm tới phần xốp của xương chậu, xoay nhẹ kim ngược với chiều xoay thông thường rồi rút kim ra khoảng 1mm, rút nòng của kim. Lưu ý: khơng được lắc kim vìsẽ làm rộng miệng lỗ chọc ở thành xương.
- Hút dịch tủy xương qua bơm tiêm (loại 3ml) đã tráng sẵn dung dịch chống đông. Số lượng dịch tủy xương mỗi lần hút từ 0,5-1ml sau đó thay bơm tiêm để làm giảm độ pha loãng với máu ngoại vi và chống hiện tượng đông máu.
Một số lưu ý: vỡ xương, nguyên nhân do: vị trí chọc bị lệch, chọc không chuẩn hướng, chọc sâu quá hoặc động tác chọc thô bạo.
Không hút được tủy xương hoặc hút được rất ít tủy có thể do chọc chưa tới, bị màng xương, vụn xương hoặc cục máu đơng bịt kín đầu kim. Khơng tạo được áp lực âm khi hút hoặc nhiều bọt do bơm tiêm gắn chưa chặt hoặc miệng lỗ chọc ở thành xương quá rộng.
- Dịch tủy xương lấy ra được cho vào ngay các ống Falcon loại 15ml đã có sẵn Heparine để chống đơng .
- Qui trình được lặp lại với bên mào chậu đối diện; thể tích dịch tủy xương chọc hút phù hợp khoảng 5ml/bên; tổng lượng dịch tủy xương khoảng 10ml/thỏ.
Lượng dịch tủy khoảng 10ml/thỏ phù hơp cho việc tách chiết và nuôi cấy tế bào và đảm bảo cho thỏ sống và hồi phục tốt. Kết quả của chúng tôi cũng phù hợp với nhận định của một số tác giả như Huang JW, Xie XH [85],[86].
Sau chọc tủy lần 1 khoảng 1 tháng, thỏ có thể được chọc tủy lần 2 với số lượng dịch tủy thường chỉ đạt 60-80% so với lần 1. Theo kinh nghiệm của chúng tôi không nên chọc tủy lần 3 do lượng tủy chọc được thường rất ít bởi mơ liên kết đã xâm nhập và thay thế tủy xương sau những lần chọc.
Hình 4.1. Vị trí giải phẫu chọc tủy xương trên thỏ
Vấn đề xử lý dịch tủy xương sau khi hút được rất quan trọng.Yêu cầu
Mấu chuyển lớn Mào chậu Ụ ngồi Vị trí chọc phù hợp nhất
thao tác phải nhanh, dứt khoát, nếu chậm tủy sẽ bị đông, nếu bơm không đúng sẽ tạo bọt ảnh hưởng đến chất lượng tủy.
- Số lượng và chất lượng tủy xương sau chọc hút
Chúng tôi đã thực hiện thành công trên 30 mẫu: các mẫu dịch tủy xương không bị đông, lượng dịch tủy cũng như lượng tế bào đơn nhân thu được khá cao. Nghiên cứu của Jau- Wen Huang (2006) cho thấy lượng tủy xương chọc hút trên mỗi thỏ khoảng 10ml là phù hợp và đủ lượng tế bào trung mô cho nuôi cấy [85]. Việc hút quá nhiều dịch tủy xương sẽ làm lẫn nhiều tế bào máu ngoại vi và ảnh hưởng đến việc hồi phục sức khỏe của thỏ sau chọc hút. Theo chúng tôi, một thỏ chỉ nên chọc hút tối đa hai lần, cách nhau 4 tuần để đảm bảo chất lượng và số lượng tủy. Mặt khác, độ tuổi cũng có ảnh hưởng đế số lượng và chất lượng tủy xương. Nên cần lựa chọn thỏ nghiên cứu trong độ tuổi phù hợp.
Việc tách khối tế bào đơn nhân từ dịch tủy xương được chúng tôi thực hiện bằng phương pháp ly tâm theo gradient tỷ trọng tế bào, sử dụng dung dịch Ficoll có tỷ trọng 1,077 g/cm3[38]. Mỗi loại tế bào có tỷ trọng khác nhau sẽ nằm ở những lớp khác nhau của ống ly tâm. Sau ly tâm khối tế bào đơn nhân sẽ tạo ra một lớp nằm ngay trên lớp Ficoll và phân tách khỏi các loại tế bào khác.
Ly tâm theo gradient tỷ trọng phải được thực hiện trong một môi trường không làm suy yếu cũng như không làm hỏng tế bào sau khi được phân lập vì nó liên quan đến khả năng sống và những chức năng sinh học của chúng. Các quá trình phân lập và tinh sạch được xem là càng vơ hại thì càng tốt nếu chúng không chứa bất cứ trở ngại nào trong suốt quá trình thực hiện.Các thơng số về lực ly tâm, thời gian ly tâm, và loại rotor dùng để ly tâm có thể thay đổi khác nhau phụ thuộc vào u cầu phân tích mẫu. Một số mơi trường ly tâm theo gradient tỷ trọng thường được sử dụng là Percoll, Ficoll…
Phân lập MSC dựa vào kích thước tế bào thường áp dụng trên chuột. Dựa vào những nghiên cứu trên chuột người ta sử dụng phim lọc có kích thước lỗ lọc 70µm để lọc tế bào.Theo Nadri S (2007) phân lập MSC từ tủy xương chuột bằng phương pháp này. Những tế bào qua được lỗ lọc thì cho vào ni cấy cịn những tế bào khơng qua lỗ lọc thì loại bỏ. Phương pháp này thực hiện thu được tế bào có độ tinh sạch cao, dễ thực hiện [47].
Kết quả nghiên cứu của chúng tôi sau khi ly tâm lượng tế bào đơn nhân thu được của mỗi mẫu tủy xương là 6,7±3,8x106 tế bào (Bảng 3.3). Kết quả