Quan sát trên kính hiển vi thấy được các cụm tế bào khá rõ. Sau 7 ngày nuôi cấy mỗi cụm có trên 50 tế bào.
5 ngày 7 ngày 10 ngày
Hình 3.8. Khả năng tăng sinh, bám đáy và tạo cụm của tế bào nuôi cấy tăng dần theo thời gian
Bảng 3.5. Kết quả theo dõi sự biến đổi hình dạng, đặc tính tế bào gốc trung mô sau nuôi cấy
Mẫu nuôi cấy Số mẫu có tế bào giống nguyên bào sợi
Số mẫu có tế bào bám đáy
Số mẫu có tế
bào tạo cụm cụm tế bào Tổng số
n=10 (mật độ 200 tế
bào/cm2)
10/10 10/10 10/10 107± 25
Nhận xét: Chọn ngẫu nhiên 10 mẫu tế bào sau nuôi cấy với mật độ 200 tế bào/cm2 quan sát khả năng biến đổi về hình dạng, đặc tính của chúng. Kết quả cho thấy: 100% số mẫu có tế bào bám bề mặt chai,100% có hình dạng giống
ngun bào sợi, 100% số mẫu tạo cụm. Số cụm tế bào trung bình là 107 ± 25.
Kết quả cho thấy các tế bào nuôi cấy mang đặc điểm của tế bào gốc trung mô. Tuy nhiên, để đảm bảo chắc chắn, chúng tôi sử dụng kỹ thuật định danh với các marker đặc hiệu.
- Nuôi cấy tế bào trên giá thể xương xốp đông khô
Sau khi giá thể được bơm tế bào gốc và để trong môi trường nuôi cấy với đầy đủ các điều kiện như nuôi trong chai nuôi flask, theo dõi sự phát triển của tế bào và sự biến đổi của môi trường nuôi cấy. Ngày thứ 5, môi trường đổi màu và có nhiều tế bào lan xung quanh giá thể, thấy hình ảnh tế bào bình thường giống nguyên bào sợi, giống dạng tế bào bám trên đĩa ni thường. (Hình3.9). Tuy nhiên vì đây khơng phải là giá thể được lựa chọn chính nên chúng tơi khơng theo dõi sự phát triển của tế bào trên giá thể.
Hình 3.9.Tế bào gốc trung mô nuôi trên giá thể xương xốp
Nhận xét: MSC phát triển bình thường xung quang giá thể xương xốp. Tuy nhiên hơi khó quan sát thấy tế bào trên các vách xương.
3.1.2.5.Kết quả định danh tế bào gốc trung mơ
Ngồi các đặc tính như hình dạng, khả năng bám xuống đáy chai ni, phát triển tập trung thành các cụm tế bào, để đảm bảo chắc chắn là tế bào gốc trung mô, chúng tôi tiến hành một số kỹ thuật đặc hiệu nhằm phát hiện các marker của chúng và khả năng đa biệt hóa của tế bào gốc trung mơ.
Định danh bằng kỹ thuật đo dòng chảy tế bào (flow cytometry):
MSC được nuôi cấy đến giai đoạn P4 thu được quần thể tế bào tương đối thuần nhất, tiến hành xác định marker bề mặt tế bào bằng flow cytometry.
MSC Giá thể
Hình 3.10. Kết quả xác định marker của MSC bằng kỹ thuật đo dòng chảy tế bào
Bảng 3.6. Kết quả xác định tỷ lệ % dương tính một số marker của tế bào gốc trung mô tủy xương thỏ bằng kỹ thuật đo dòng chảy tế bào (flow
cytometry) Marker CD14(n=5) CD34 (n=5) CD44 (n=5) CD90 (n=5) % Dương tính 0,17±1,5 0,36±1,14 97,42±1,42 95,37±0,8
Kết quả cho thấy tỷ lệ dương tích trên 95% với marker CD90,CD44; biểu hiện âm tích dưới 2% với marker CD14, CD34.
Định danh bằng kỹ thuật nhuộm hóa mơ miễn dịch:
Kết quả 5 mẫu tế bào nuôi cấy ở giai đoạn P3, nhuộm hóa mơ miễn dịch với các marker CD44, CD90, CD14 và CD34 cho thấy các tế bào biểu hiện dương tính rõ với CD44, CD90 và âm tính với CD14, CD34 (Hình 3.10; 3.11; 3.12; 3.13).