(LUẬN án TIẾN sĩ) nghiên cứu các dạng đột biến gen gây bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu 21 hydroxylase

T Ổ NG QUAN

Định nghĩa, cơ sở hóa sinh, sinh lý b ệ nh h ọ c c ủa tăng sản thượ ng th ậ n

thận bẩm sinh thiếu 21-OH

1 2.1 Định nghĩa TSTTBS và các enzym tham gia t ổ ng h ợ p cortisol

Tăng sản thượng thận bẩm sinh (TSTTBS) hay còn gọi là congenital adrenal hyperplasia (CAH) là một nhóm bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường, gây ra bởi sự thiếu hụt một phần hoặc hoàn toàn các enzym cần thiết cho việc tổng hợp cortisol từ cholesterol tại tuyến thượng thận Biểu hiện lâm sàng và hóa sinh của bệnh phụ thuộc vào loại khiếm khuyết enzym cụ thể và mức độ giảm hoạt động của enzym đó.

Các enzym tham gia tổng hợp cortisol vỏ thượng thận bao gồm P450scc (CYP11A1), P450c17 (CYP17A1), P450c21 (CYP21A2), P450c11 (CYP11B1) và 3βHSD (HSD3B2) Quá trình tổng hợp steroid bắt đầu khi cholesterol được vận chuyển vào ty thể nhờ protein StAR (steroidogenic acute regulatory protein) Đặc biệt, đột biến bất hoạt gen POR mã hóa enzym P450 oxidoreductase có thể dẫn đến các triệu chứng của TSTTBS, bao gồm thiếu hụt P450c17 và P450c21.

OH (CYP21A2) và 11β-hydroxylase (CYP11B1) gây tổn thương trong tổng hợp steroid thượng thận, trong khi thiếu 17α-hydroxylase (CYP17A1) và 3β-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 (HSD3B2) ảnh hưởng đến tổng hợp steroid ở tuyến sinh dục.

1 2.2 Cơ sở hóa sinh c ủ a TSTTBS

Cytochrome P450 là một nhóm enzym oxy hóa với khoảng 500 axit amin và một nhóm HEME đơn độc, được gọi là P450 do khả năng hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 450 nm Hệ gen người chứa 57 enzym thuộc nhóm này, và đã có nhiều hệ thống danh pháp quốc tế được đề xuất trong các thập kỷ qua Hiện tại, các gen này được gọi là CYP với một hệ thống danh pháp hợp lý cho các enzym và gen đã được mô tả, trong đó các protein được mã hóa bởi các gen có thể có cùng tên nhưng không viết nghiêng.

Sinh tổng hợp steroid bắt đầu từ cholesterol không ester hóa, một phân tử 27 carbon lấy từ lipoprotein phân tử thấp (LDL) trong tuần hoàn.

Cholesterol được vận chuyển từ bào tương vào màng trong của ty thể thông qua protein phosphor (steroidogenic acute regulatory protein - StAR) [13]

Enzym CYP450scc (CYP11A1) chuyển đổi cholesterol thành pregnenolone thông qua quá trình hydroxyl hóa carbon 20 và 22, sau đó tách liên kết giữa hai carbon này Pregnenolone không phải là cơ chất trong ty thể, do đó di chuyển ra lưới nội bào để được chuyển hóa thành các steroid đặc hiệu dưới tác động của enzym và yếu tố đồng vận Tuyến thượng thận, với vai trò thiết yếu cho sự sống, sản xuất steroid tại phần vỏ, được chia thành ba lớp: lớp cầu, lớp bó và lớp lưới, mỗi lớp có hoặc thiếu các enzym cần thiết cho tổng hợp steroid Lớp cầu thiếu 17α-hydroxylase dẫn đến sản xuất mineralocorticoid 21 carbon là aldosterone, trong khi lớp bó có 17α-hydroxylase cho phép sản xuất cortisol (21 carbon), và hoạt động của 17,20-lyase ở lớp lưới cho phép sản xuất steroid 19 carbon như dehydroepiandrosterone (DHEA) và testosterone.

Sản xuất steroid thượng thận được kích thích bởi hormon adrenocorticotroph (ACTH) từ thùy trước tuyến yên Hoạt động này được điều chỉnh bởi hormon giải phóng corticotropin (CRH), do vùng dưới đồi sản xuất, theo nhịp sinh học.

1.2.3 Sinh lý b ệ nh c ủ a TSTTBS do thi ế u 21-OH

Khi thiếu hụt enzym steroid 21-hydroxylase (P450c21), nồng độ cortisol giảm dẫn đến việc sản xuất quá mức CRH ở vùng dưới đồi và ACTH ở tuyến yên, kích thích tuyến thượng thận và gây tăng sinh mô tuyến Hơn 95% bệnh nhân mắc hội chứng thiếu hụt enzym này gặp phải tổn thương trong việc tổng hợp các hormon steroid, tùy thuộc vào enzym bị thiếu hụt.

21-hydroxylase (21-OH) catalyzes the conversion of 17-hydroxyprogesterone (17-OHP) into 11-deoxycortisol, a precursor of cortisol, and transforms progesterone into deoxycorticosterone, a precursor of aldosterone This enzyme functions in the adrenal cortex by hydroxylating steroids at the 21 position A deficiency in 21-OH leads to impaired cortisol synthesis and a concurrent deficiency in mineralocorticoids, particularly in severe cases Consequently, steroid precursors like progesterone and 17-OHP accumulate and redirect towards adrenal androgen synthesis, resulting in excessive adrenal androgen production.

Hình 1.1 A) Tổng hợp steroid thượng thận ởthai nhi bình thường

B) Tổng hợp steroid trong trường hợp thiếu 21-OH

Enzym 21-OH thượng thận, hay P450c21, đóng vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp aldosterone và cortisol Tuyến thượng thận cũng có khả năng sản xuất một lượng nhỏ testosterone nhờ vào tác động của enzym 17β-HSD.

B) trong trường hợp thiếu hoạt độ 21-OH của P450c21 thì có ba con đường dẫn đến tổng hợp androgen: i/ con đường từ cholesterol đến DHEA vẫn còn hoạt động, tăng sản xuất DHEA sẽ dẫn đến một lượng DHEA bị chuyển thành testosterone và dihydrotestosterone (DHT) ii/ lượng lớn 17- OHP được sản xuất ởthượng thận bệnh nhân TSTTBS sẽ cho phép một lượng 17-OHP chuyển thành androstenedione và sau đó thành testosterone iii/ con đường phụ thuộc vào 5α và 3α reduction của 17-OHP thành 17OH- allopregnanolone Steroid này dễ dàng được chuyển thành androstanediol, mà sau đó có thể bị oxy hóa thành DHT bởi enzym 3α-HSD [11]

Hình 1.2 Các phản ứng xúc tác bởi P45021A2 (21-hydroxylase) [19]

Bảng 1.1 Các thể bệnh TSTTBS và thiếu hụt tổng hợp cortisol do thiếu enzym vỏthƣợng thận [3]

Enzym thi ế u h ụ t Gen/ NST T ỷ l ệ m ớ i m ắ c và ch ủ ng t ộ c

Tri ệ u ch ứ ng lâm sàng D ấ u ấ n sinh h ọ c

G ặ p nhi ều hơn ở Ashkenazi Jews, và Yupik Eskimos

Suy thượ ng th ậ n ở th ể c ổ điể n, nam hóa ở các m ức độ khác nhau

1:100 000 ở ch ủ ng t ộ c da tr ắ ng; 1:7000 ở Moroccan Jews

Tăng huyế t áp ở h ầ u h ế t các b ệ nh nhân; h ạ kali máu; nam hóa

Hi ế m M ất nướ c, h ạ natri máu và tăng kali máu.

46,XX: nam hóa 46,XY: nam hóa kém

Pregnenolone, 17OH- pregnenolone, DHEA, DHEAS 17-hydroxylase/

1:50 000 toàn th ế gi ớ i, ph ổ bi ế n hơn ở Bra-xin và châu Á

Cao huy ế t áp, h ạ kali máu, thi ểu năng sinh d ụ c 46,XX; 46,XY: nam hóa kém, tinh hoàn trong ổ b ụ ng

Steroidogenic acute regulatory protein (StAR)

Hi ế m, ph ổ bi ế n hơn ở Nh ậ t B ả n, Palestine, Hàn Qu ố c

Suy thượ ng th ậ n, thượ ng th ận phì đạ i, thượ ng th ậ n b ị thâm nhi ễ m lipid, c ả hai gi ớ i có b ộ ph ậ n sinh d ụ c ngoài gi ố ng n ữ

Cholesterol side- chain cleavage enzym (P450scc)

Hi ế m Suy thượ ng th ậ n, có th ể không có tuy ế n thượ ng th ậ n

Gi ả m th ể tích tu ầ n hoàn, dị tật xương (Antley-Bixler); nam

M ức độ cao khác nhau, thiếu hụt m ộ t ph ầ n nhi ề u

46,XX: nam hóa nh ẹ đế n trung bình

46,XY: nam hóa kém steroid

DOC, 11-deoxycorticosterone; AD, androstenedione; T, testosterone; DHEA, dehydroepiandrosterone; DHEAS, DHEA sulfate; LH, luteinizing hormone; FSH, follicle stimulating hormone

Trong thai nhi gái bình thường, không có hormon kháng thể Muller (AMH), dẫn đến sự biệt hóa của cấu trúc Muller thành vòi trứng, tử cung, cổ tử cung và 2/3 trên của âm đạo Mô tinh hoàn và androgen cũng không tồn tại, khiến cấu trúc Wolffian thoái triển và buồng trứng nằm ở vị trí tiểu khung Tuy nhiên, trong trường hợp thiếu 21-OH, thai nhi gái vẫn không có hormon kháng thể Muller, do đó sự phát triển của cấu trúc Muller vẫn diễn ra bình thường, và buồng trứng vẫn ở vị trí tiểu khung Testosterone có thể tăng lên từ nguồn androgen của thượng thận, không phải từ tế bào Leydig của tinh hoàn Sự tích tụ các tiền chất steroid do thiếu hụt enzym (21-OH) sẽ chuyển hướng sang tổng hợp testosterone, với mức độ rối loạn enzym quy định mức độ chuyển hướng này Nồng độ cao testosterone trong tuần hoàn sẽ dẫn đến nam hóa bộ phận sinh dục ngoài ở thai nhi gái, với mức độ khác nhau theo phân loại của Prader.

Ki ể u hình lâm sàng và t ỷ l ệ m ớ i m ắ c c ủ a TSTTBS do thi ế u 21-OH

1.3.1 Ki ể u hình lâm sàng c ủ a TSTTBS do thi ế u 21-OH

Mức độ nặng của triệu chứng lâm sàng phụ thuộc vào hoạt độ 21-OH còn lại, với các biểu hiện kiểu hình được chia thành thể cổ điển (nặng) và thể không cổ điển (nhẹ) Thể cổ điển lại được phân thành thể cổ điển mất muối (MM) và nam hóa đơn thuần (NHĐT), phản ánh mức độ thiếu hụt aldosterone Trong đó, thể cổ điển MM chiếm 75% các ca mắc thể cổ điển.

Thiếu hụt hoàn toàn hoạt độ enzym gây nguy hiểm đến tính mạng và tử vong do mất nước, hạ natri máu Trẻ gái mắc thể nặng thiếu 21-OH có biểu hiện nam hoá bộ phận sinh dục ngoài từ thời kỳ bào thai, kết quả từ việc tiếp xúc với nồng độ androgene cao trong tử cung, là nguyên nhân phổ biến nhất của mơ hồ giới tính ở trẻ sơ sinh Triệu chứng đặc trưng bao gồm âm vật phì đại, hai môi lớn dính liền và niệu đạo cùng âm đạo đổ vào xoang niệu dục chung, trong khi cơ quan sinh dục bên trong của nữ bình thường bao gồm tử cung, vòi trứng, buồng trứng mà không có cấu trúc của ống Wolff Trẻ trai mắc thể cổ điển thường không có triệu chứng khi sinh, ngoại trừ xạm da kín đáo và dương vật có thể lớn hơn, dẫn đến tuổi chẩn đoán muộn hơn.

Mức độ nặng của thiếu hụt aldosterone dẫn đến triệu chứng khác nhau ở hội chứng MM Trẻ trai mắc thể cổ điển MM thường có triệu chứng như nôn, sụt cân, li bì, mất nước, hạ natri và tăng kali huyết thanh xuất hiện từ 7 - 14 ngày sau sinh, có thể kèm theo sốc Trong khi đó, trẻ gái mắc thể cổ điển MM nếu không được điều trị sớm có thể gặp triệu chứng suy thượng thận cấp và mất muối trong giai đoạn sơ sinh Sự mơ hồ giới tính khi sinh là yếu tố quan trọng giúp chẩn đoán và điều trị kịp thời Đối với trẻ trai mắc thể cổ điển NHĐT (không mất muối), triệu chứng nam hóa và dậy thì sớm ngoại biên có thể xuất hiện từ 2 tuổi.

Thể không cổ điển của tăng androgen có thể biểu hiện qua nhiều triệu chứng khác nhau, với mức độ tăng sản xuất cortisol và aldosterone từ vỏ thượng thận không đủ để ức chế sản xuất ACTH, dẫn đến tăng androgen trong máu Ở trẻ sơ sinh, bệnh nhân có bộ phận sinh dục bình thường và nồng độ 17-OHP trong giới hạn bình thường Các triệu chứng ở trẻ em có thể bao gồm lông mu sớm, trứng cá, tăng chiều cao nhanh và tuổi xương phát triển sớm, có thể dẫn đến chiều cao cuối cùng thấp Ở giai đoạn sau, các triệu chứng như rậm lông, rối loạn kinh nguyệt, trứng cá và vô sinh xuất hiện, chủ yếu do tăng androgen trong tuần hoàn Nam giới có thể không có triệu chứng rõ ràng, chỉ gặp phải trứng cá hoặc khó khăn trong sinh sản.

Tiêu chuẩn phân loại kiểu hình dựa trên triệu chứng lâm sàng và xét nghiệm hormon cho thấy nam hóa bộ phận sinh dục ngoài ở trẻ gái được đánh giá theo mức độ của Prader để chẩn đoán thể cổ điển, bao gồm thể MM và NHĐT Ở thể cổ điển MM, với hoạt độ 21-OH còn < 2%, bệnh nhân thường có triệu chứng như sụt cân, chậm tăng cân sau sinh, nôn, và dấu hiệu mất nước nghiêm trọng Theo khuyến cáo của Pang và Clark (1993), bệnh nhân được xếp vào thể MM khi Na+ huyết thanh < 130 mmol/l hoặc 130-135 mmol/l kết hợp với K+ > 5,5 mmol/l, hoặc khi có hoạt độ renin huyết thanh tăng bất thường Thể NHĐT có hoạt độ enzym tăng khoảng 1-2% so với thể cổ điển MM, bao gồm dậy thì sớm giả và tăng phát triển chiều cao Thể không cổ điển, với hoạt độ enzym còn 20-50%, được định nghĩa ở trẻ gái không có nam hóa bộ phận sinh dục ngoài lúc sinh hoặc có nam hóa nhẹ, và ở cả hai giới có lông mu và lông nách sớm Nồng độ 17-OHP ở điều kiện cơ sở và sau kích thích ACTH là tiêu chuẩn bổ sung cho chẩn đoán 17-OHP được sử dụng như dấu ấn sinh học để chẩn đoán và theo dõi điều trị TSTTBS thiếu 21-OH, được phân tích bằng kỹ thuật miễn dịch phóng xạ từ 1986 đến 1990 và bằng kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang từ 1991 trở đi.

Bảng 1.2 Biểu hiện lâm sàng của bệnh nhân TSTTBS thiếu 21-OH [28]

Biểu hiện lâm sàng Thể bệnh thiếu 21-OH

Thể cổđiển Thể không cổđiển

Nam hóa trước sinh Biểu hiện ở trẻ gái Không có Nam hóa sau sinh Cả trẻ gái và trẻ trai Mức độ khác nhau

Mất muối 75% các ca Không

Thiếu cortisol 100% các ca Hiếm

Dữ liệu từ các chương trình sàng lọc sơ sinh cho thấy TSTTBS do thiếu 21-OH là một trong những bệnh di truyền đơn gen phổ biến, với tỷ lệ mới mắc khoảng 1:15.000 trẻ đẻ sống ở thể cổ điển, dựa trên kết quả sàng lọc từ 6,5 triệu sơ sinh ở 13 quốc gia như Mỹ, Pháp, và Nhật Bản Tỷ lệ người lành mang gen của thể cổ điển ước tính là 1:60, và tỷ lệ mới mắc có sự khác biệt tùy thuộc vào chủng tộc và vùng địa lý Thể nhẹ hơn hoặc thể không cổ điển phổ biến hơn nhiều, với tỷ lệ khoảng 1:500 - 1:1000 ở các chủng tộc khác nhau; một nghiên cứu tại New York cho thấy thể không cổ điển phổ biến hơn ở người gốc Do Thái Đông Âu, người gốc La Tinh và gốc Nam Tư, với tỷ lệ từ 1,0 - 3,7%.

Cơ sở di truy ề n phân t ử c ủ a b ệ nh TSTTBS do thi ế u 21-OH

1.4.1 Gen CYP21A2 và c ấ u trúc RCCX (RP-C4-CYP21-TNX)

Thiếu hụt 21-OH là do đột biến gen CYP21A2, trước đây được gọi là CYP21 hoặc CYP21B (GeneID 1589, GenBank NC_000006.10) Gen này nằm trong vùng HLA class III của phức hợp hòa hợp mô chủ yếu (MHC) trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể 6 (6p21.3), cùng với các giả gen.

CYP21A1P, trước đây gọi là CYP21P hoặc CYP21A, có sự tương đồng cao với gen chức năng, nằm cách nhau khoảng 30 kb Cả hai gen này đều có 10 exon, kích thước 3,4 kb, và có trình tự giống nhau đến 98% ở các exon và khoảng 96% ở các intron Tuy nhiên, CYP21A1P là gen không hoạt động do mang một số đột biến gây mất chức năng Đơn vị C4/CYP21 nằm xen kẽ với gen này.

Gen RP (serine threonine nuclear protein kinase) nằm ở phía telomer và gen TNX ở phía centromere tạo thành module RCCX (RP-C4-CYP21-TNX) RP1 mã hóa cho protein nhân tương tự chuỗi xoắn DNA với chức năng chưa rõ, được gọi là serine-threonine kinase 19 (STK19) RP2 là một dạng cắt ngắn không có chức năng như RP1 TNXB mã hóa cho protein đệm ngoại bào tên là tenascin X, nằm cạnh gen CYP21A2, trong khi gen TNXA là bản sao bị cắt cụt của TNXB và nằm cạnh CYP21A1P ở phía đối diện Hầu hết haplotype có dạng bimodular, bao gồm hai bộ bốn gen sắp xếp theo thứ tự: RP1 - C4A - CYP21A1P - TNXA - RP2 - C4B - CYP21A2 - TNXB Số lượng module có thể thay đổi từ 1 đến 4.

Khoảng 70% người da trắng có cấu trúc di truyền với 2 module, bao gồm một module chứa gen CYP21A2 và một module chứa gen CYP21A1P Cấu trúc 3 module chiếm 14% các nhiễm sắc thể, với hầu hết trường hợp mang 2 bản sao của CYP21A1P và 1 bản sao của CYP21A2 Tuy nhiên, cũng đã ghi nhận trường hợp 2 bản sao của CYP21A2 và 1 bản sao của CYP21A1P Haplotype của đơn vị RCCX với số lượng lớn hơn một gen CYP21A2 được tìm thấy ở nhiều chủng tộc khác nhau, như 12,5% ở người Tunisia, 7% ở người Tây Ban Nha, dưới 2% ở người Thụy Điển, 13,2% ở người Áo, và 1% ở người Hà Lan.

Trung Quốc 2,5% (trong số 200 nhiễm sắc thể) [35],[36],[37],[38],[39]

Theo dữ liệu từ ngân hàng gen GeneBank (AF019413 và AL049547), chiều dài trình tự của bimodule trong vùng RCCX khoảng 120 kb Gen CYP21A2 chịu trách nhiệm mã hóa cho một protein có 494 acid amin, với trọng lượng phân tử đạt 55 Kilo Dalton (kDa).

Hình 1.3 Vùng nhiễm sắc thể 6p21.3 bao gồm gen CYP21A2 của cấu trúc

1.4.2 L ị ch s ử nghiên c ứ u v ề di truy ề n phân t ử c ủ a b ệ nh TSTTBS trên th ế gi ớ i

Năm 1986, White và cộng sự đã nghiên cứu về cloning và biểu hiện gen, phát hiện cDNA tương ứng với 21-OH dài 2 kb, với protein có 494 acid amin và trọng lượng phân tử 55.000 Dalton Enzym này cho thấy tính đồng nhất cao (28%) so với các enzym cytochrome P450 khác Cùng năm, Higachi và cộng sự đã phân tích cấu trúc gen, chỉ ra rằng gen mã hóa cho 21-OH bao gồm 10 exon, trong khi các gen mã hóa cho enzym P450 khác có cấu trúc khác biệt.

7, 8 hoặc 9 exon Gen bất hoạt A có đột biến 8 bp (base pair) ở vị trí mã hóa

110 và 112 gây nên lệch khung dịch mã và ngừng phiên mã tại vị trí 130 Hai gen P450C21 có 9 intron và có chiều dài khoảng 3,4 kb [41]

Nghiên cứu về mapping gen, đặc biệt là nghiên cứu của Carrol và cộng sự, đã xác định hai gen 21-OH nằm cạnh các gen C4A và C4B trong phức hợp gen MHC class III White và cộng sự (1985) đã cung cấp bằng chứng về sự tồn tại của hai gen mã hóa steroid 21-OH ở vùng gen C4, với gen 21-OH B và vùng tiếp giáp gen C4B bị mất đoạn trên nhiễm sắc thể mang HLA-Bw47, dẫn đến thể mất muối do thiếu 21-OH Ngược lại, nhiễm sắc thể mang haplotype HLA-A1; B8; DR3 không liên quan đến thiếu 21-OH, và kết luận của White dựa trên phân tích enzym giới hạn cho thấy có thể có mất đoạn của các gen C4A và 21-OH A, gợi ý rằng gen A không có chức năng Higashi và cộng sự (1986) cũng đề xuất rằng cấu trúc đặc biệt của hệ gen có thể dẫn đến đột biến chức năng do hoán vị gen hoặc xóa đoạn gen thông qua tái tổ hợp đồng nhất và trao đổi chéo không cân xứng.

Nghiên cứu di truyền phân tử của Rodrigues và cộng sự (1987) xác nhận rằng gen 21-OH A là giả gen do có ba đột biến ở exon So sánh với các công bố về trình tự gen cho thấy gen 21-OH B là dạng đa hình Các tác giả cũng đề xuất rằng bốn thể lâm sàng riêng biệt của thiếu 21-OH, bao gồm thể NHĐT, MM, xuất hiện muộn và thể kín đáo, rất có thể là kết quả của các đột biến allele khác nhau của gen 21-OH B.

Matteson và cộng sự (1987) đã sử dụng nhiều enzyme hạn chế để phân tích gen mã hóa cho 21-OH ở 10 gia đình, mỗi gia đình có từ 2 người mắc bệnh trở lên Kết quả nghiên cứu cho thấy rằng xóa đoạn là một loại đột biến phổ biến ở bệnh nhân TSTTBS, có thể liên quan đến hiện tượng hoán vị gen và trao đổi chéo không cân, thay vì chỉ là các xóa đoạn đơn thuần Harada và cộng sự (1987) cũng đã áp dụng phương pháp phân tích Southern blot DNA để nghiên cứu hệ gen sử dụng đầu dò DNA của 21-OH.

Các tác giả đã phát hiện sự vắng mặt của đoạn giới hạn 21-OH, chứng minh rằng nguyên nhân không phải do xóa đoạn gen mà là do hoán vị giữa gen chức năng và giả gen Olney và cộng sự (2002) đã phát triển kỹ thuật “real-time quantitative PCR” để phát hiện sự xóa đoạn này.

Kỹ thuật CYP21A2 cho phép phát hiện xóa đoạn gen dị hợp tử với sai số alpha < 5% và lực phát hiện > 95% So với kỹ thuật “allele-specific PCR”, phương pháp này có thể phân tích 9 đột biến phổ biến trong vòng 2 giờ từ mẫu máu Turkel và cộng sự (2003) đã áp dụng kỹ thuật “allele-specific PCR” cho 8 đột biến điểm phổ biến nhất của CYP21 ở 31 gia đình có người thiếu 21-OH, với tỷ lệ allele đột biến phổ biến nhất như I2g (22%), p.I172N (11,4%), p.R356W (9,6%) và p.Q318X (8%) Kharrat và cộng sự (2004) đã sử dụng kỹ thuật cắt enzym giới hạn và giải trình tự gen CYP21A2 cho 51 bệnh nhân thể cổ điển của thiếu 21-OH, phát hiện đột biến ở 94% các nhiễm sắc thể phân tích, với p.Q318X là đột biến phổ biến nhất, theo sau là xóa đoạn lớn (35,3%), I2g (17,6%) và p.I172N (10,8%) Bốn đột biến mới cũng được phát hiện ở 4 bệnh nhân thể MM.

Các nghiên cứu về nguồn gốc của các đột biến bao gồm:

Mornet và cộng sự (1991) ước tính rằng hoán vị gen gồm các đoạn nhỏ DNA chiếm 74% ở bệnh nhân thiếu 21-OH, trong khi xóa đoạn hoàn toàn của gen chiếm khoảng 20% ở thể cổ điển Việc xóa hoàn toàn CYP21A2 liên quan đến thể MM tương tự như mất 8 bp trên exon 3, và đột biến p.V281L trên exon 7 liên quan đến thể xuất hiện muộn Ghanem và cộng sự (1990) cho rằng khoảng 70% các đột biến ở gen CYP21A2 gây bệnh thể cổ điển và không cổ điển là các đột biến điểm Vùng gen này có số lượng đơn vị lặp lại C4/21-OH khác nhau về chiều dài giữa các halotype, với những halotype mang một đơn vị C4/21-OH cùng với gen.

CYP21A1P thì mắc thể nặng của thiếu 21-OH Haglund-Stengler và cộng sự

(1991) phát hiện sự kết hợp giữa 3 đơn vị lặp lại của C4/21-OH và thể nhẹ của thiếu 21-OH [52]

Tajima và các cộng sự (1993) chỉ ra rằng khoảng 90% các đột biến ở bệnh nhân thiếu 21-OH xuất phát từ các đột biến ở giả gen hoặc do xóa đoạn, trong khi chỉ có khoảng 10% là do các đột biến không có mặt trên giả gen.

Araujo và cộng sự (2007) nghiên cứu vùng promoter/điều hòa của gen

Nghiên cứu về gen CYP21A2 ở 17 bệnh nhân mắc thể không cổ điển của thiếu 21-OH và 50 trường hợp đối chứng đã phát hiện các đột biến vùng promoter Trong đó, một bệnh nhân có dị hợp tử kép với đột biến p.V281L và một bệnh nhân khác với đột biến I2g Các tác giả kết luận rằng các hoán vị nhỏ giữa promoter của CYP21A2 và CYP21A1P có thể dẫn đến thể không cổ điển Do đó, việc phân tích promoter của CYP21A2 là cần thiết trong nghiên cứu di truyền TSTTBS.

Các độ t bi ế n c ủ a gen CYP21A2 gây thi ế u 21-OH

Các đột biến ở gen CYP21A2 gây bệnh TSTTBS được chia làm ba nhóm: i/ hiện tượng hoán vị nhỏ của giả gen CYP21A1P sang gen chức năng

CYP21A2; ii/ các đột biến tự phát sinh tại gen chức năng CYP21A2; iii/ đơn vị RCCX ở dạng kết hợp (chimeric RCCX module) bao gồm: dạng kết hợp của

Các đột biến phổ biến của gen CYP21A2 được phát hiện ở hơn 95% bệnh nhân TSTTBS do thiếu 21-OH, trong đó khoảng 20-25% là xóa đoạn gen CYP21A2 và trạng thái chimera của gen CYP21A1P/CYP21A2 Hiện tượng này xảy ra do trao đổi chéo không cân xứng ở vùng RCCX Hầu hết các đột biến ở CYP21A2 là kết quả của hoán vị nhỏ từ CYP21A1P sang CYP21A2 trong quá trình gián phân và giảm phân, chiếm khoảng 70-80% các đột biến gây bệnh của gen này.

Gen CYP21A2 chứa 7 đột biến điểm, một đột biến xóa 8 bp ở exon 3, và một nhóm 3 đột biến điểm trên exon 6 Hơn 100 đột biến tự phát tại gen CYP21A2 không liên quan đến giả gen đã được ghi nhận trong dữ liệu của ủy ban danh pháp "Cytochrome P450 allele" cho con người Các đột biến hiếm hoặc mới phát sinh tại gen CYP21A2 chiếm khoảng 3-5% tổng số allele đột biến, theo các nghiên cứu trên một số lượng lớn bệnh nhân thiếu 21-OH.

Khoảng 1% các đột biến không di truyền từ bố mẹ (de novo mutation)

CYP21A2 được phân loại thành các nhóm khác nhau dựa trên hoạt độ 21-OH qua nghiên cứu in vitro, cho thấy mối tương quan chặt chẽ giữa kiểu gen và kiểu hình với giá trị dự báo dương tính cao Lịch sử phát hiện và nghiên cứu chức năng protein của các đột biến phổ biến từ giả gen cùng với tương quan kiểu hình được tóm tắt trong bảng 1.3.

Bảng 1.3 Các đột biến phổ biến ở CYP21A2 gây thiếu 21-OH

Các độ t bi ế n V ị trí % ho ạt độ enzym in vitro

M ức độ n ặ ng Tham kh ả o

Xóa đoạ n l ớ n 0 N ặ ng White PC 1984 [60] c.89C>T (p.P30L) Exon 1 30 - 60 Nh ẹ Tusie-Luna MT 1991 [61] c.290-13A/C>G (I2g) Intron 2 < 5 N ặ ng Higashi Y 1991 [62] del 8 bp E3 (E38bp) Exon 3 0 N ặ ng White PC 1994 [63] c.515T>A (p.I172N) Exon 4 1 V ừ a Amor M 1988 [64]

Tusie-Luna M 1990 [65] c.841G>T (p.V281L) Exon 7 20 - 50 Nh ẹ Tusie-Luna M 1990 [65]

Speiser PW 1988 [66] c.952C>T (p.Q318X) Exon 8 0 N ặ ng Globerman H 1988 [67] p.R356W (c.1066C>T) Exon 8 0 N ặ ng Chiou SH 1990 [68]

Đột biến xóa đoạn lớn dẫn đến mất toàn bộ gen CYP21A2 và sự hoán vị gen chiếm khoảng 95% alleles trong bệnh TSTTBS ở hầu hết các chủng tộc Tần suất các đột biến cụ thể có sự khác biệt giữa các chủng tộc, bao gồm các đột biến từ giả gen như p.P30L (c.89C>T), I2g (IVS2-A/C>G hay c.290-13A/C>G), del 8 bp E3 (c.329_336delGAGACTAC), p.I172N (c.515T>A), Cluster E6 (c.707T>A+710T>A+716T>A), p.V281L (c.841G>T), p.L307FfsX6 (c.920_921insT), p.Q318X (c.952C>T), và p.R356W (c.1066C>T) Đột biến p.P453S (c.1357C>T) cũng xuất hiện với tỷ lệ thấp ở CYP21A1P và chuyển sang gen chức năng với cơ chế tương tự Ngoài các đột biến từ giả gen, còn có những đột biến hiếm phát sinh ở gen chức năng, thường xuất hiện trong các gia đình riêng biệt hoặc ở những chủng tộc đặc biệt.

CYP21A1P là một gen không hoạt động do các đột biến làm bất hoạt gen, và những đột biến này có thể được chuyển sang CYP21A2 thông qua quá trình tái tổ hợp hoặc hoán vị gen.

1.5.1 Các độ t bi ế n xóa đoạ n và hoán v ị l ớ n c ủ a gen

Đoạn lớn chứa C4B và CYP21A2 bị xóa chiếm khoảng 20-25% allele ở bệnh nhân thiếu 21-OH thể cổ điển, phổ biến ở nhiều chủng tộc nhưng hiếm gặp ở một số nước châu Mỹ La tinh Nhiều allele xóa đoạn liên quan đến haplotype HLA A3; Bw47; DR7, với kích thước khoảng 30 kb nằm giữa exon 3 và exon 8 của CYP21A1P, kéo dài đến C4B và tiếp tục đến gen CYP21A2 Đột biến xóa đoạn này tạo ra một gen không mã hóa enzym hoạt động, dẫn đến tất cả bệnh nhân mang đột biến đồng hợp tử xóa đoạn có kiểu hình thể cổ điển MM.

Sự trao đổi chéo không cân xứng có thể xảy ra ở bất kỳ vị trí nào trong vùng lặp đoạn 30-kb, bao gồm các gen RP, C4 và TNX Thường gặp ở các nhiễm sắc thể với 1 hoặc 3 bản sao của vùng này, tái cấu trúc được phát hiện ở 16% và 12% trên các nhiễm sắc thể 6 Chỉ những điểm gẫy xảy ra trao đổi chéo nằm giữa hoặc ở đầu 3' của gen.

CYP21A2 gây thiếu 21-OH; các điểm gẫy ở các gen C4 sẽ xoá đoạn gen

CYP21A1P và một trong số các gen C4 và được xác định ở các haplotype

HLA phổ biến là A1; B8; DR3 (hình 1.5 và 1.6) [59],[69]

Hình 1.5 Hiện tƣợng tái cấu trúc gen CYP21A 2

Các gen lặp lại và vùng RCCX có sự biến đổi đáng kể do sự sắp xếp lại của các gen Sự hình thành các dạng gen khác nhau phụ thuộc vào vị trí bị đứt gãy.

Hình 1.6 Xóa đoạn của gen CYP21A2

Hiện tượng tái sắp xếp trong quá trình giảm phân dẫn đến việc xóa đoạn 30 kb, gây ra tình trạng kết hợp (chimera) giữa CYP21A1P và CYP21A2 Đến nay, đã xác định được 9 dạng kết hợp (CH1-CH9) với các vị trí nối khác nhau giữa hai gen Các exon của CYP21A1P và CYP21A2 được ký hiệu bằng các hộp trắng và đen tương ứng.

1.5.2 Các độ t bi ến vô nghĩa và độ t bi ế n gây l ệ ch khung d ị ch mã (nonsense và frameshift mutations)

Đột biến ở gen CYP21A1P dẫn đến thiếu hụt hoàn toàn tổng hợp enzym, gây ra thể MM khi xuất hiện ở CYP21A2, đặc biệt là các đột biến vô nghĩa tại mã 318 (p.Q318X) và xóa đoạn 8 bp ở exon 3 Đột biến thêm 1 nucleotid ở exon 7 (c.920_921insT) thường không được phát hiện đơn độc trong bệnh nhân thiếu 21-OH.

Đột biến A hoặc C thành G ở intron 2, cụ thể là tại vị trí cách 13 bp từ đầu tận cùng của intron 2 (nt 656 trên genome), là một biến thể phổ biến nhất trong gen gây thiếu 21.

Đột biến OH thể cổ điển gây tổn thương gắn nối ở intron 2, dẫn đến việc giữ lại 19 nucleotid thường bị loại khỏi mRNA, làm lệch khung dịch mã Mặc dù hầu hết mRNA bị thay đổi trong quá trình gắn nối, vẫn tồn tại một lượng nhỏ mRNA gắn nối bình thường trong tế bào nuôi cấy, cho phép sản xuất một ít enzym nếu không có đột biến nặng khác Mặc dù không xác định được tỷ lệ mRNA gắn nối bình thường ở thượng thận của bệnh nhân, hầu hết bệnh nhân đồng hợp tử hoặc mang đột biến này đều có kiểu hình MM, cho thấy sự thiếu hụt nghiêm trọng hoạt độ enzym cần thiết để tổng hợp aldosterone Một số bệnh nhân có thể gặp biểu hiện mất muối muộn hơn vài tháng sau sinh.

Khả năng người mang đồng hợp tử đột biến này được coi là không có biểu hiện triệu chứng cũng đã được báo cáo [72]

Đột biến Pro-30Leu (p.P30L) dẫn đến hoạt độ enzym giảm 30-60% so với bình thường và nhanh chóng mất hoạt tính khi tế bào bị dung giải, cho thấy enzym này không ổn định Bệnh nhân mang đột biến này có biểu hiện nam hoá nặng hơn so với bệnh nhân mang đột biến p.V281L phổ biến hơn, với tỷ lệ phát hiện cao hơn ở bệnh nhân Nhật Bản Đột biến Ile-172Asn (p.I172N) là đột biến duy nhất liên quan đến thể lâm sàng NHĐT, với hoạt độ enzym chỉ còn khoảng 1% so với bình thường, nhưng ái lực cơ chất vẫn bình thường Đột biến này có thể làm phá vỡ sự tương tác kỵ nước và giảm sự kết hợp của enzym với lưới nội bào, dẫn đến tính ổn định của cấu trúc enzym bị ảnh hưởng và enzym trở nên nhạy cảm với protease.

Bình thường thì aldosterone được bài tiết với một lượng nhỏ hơn 100-

Hoạt độ 21-OH có thể giảm xuống mức rất thấp, chỉ còn 1% so với bình thường, mà vẫn đủ để tổng hợp aldosterone và ngăn ngừa mất muối ở hầu hết bệnh nhân Điều này cho thấy rằng mức độ cortisol có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình tổng hợp aldosterone.

Các đột biến p.I235N; p.V236E và p.M238K trên exon 6:

Nhóm đột biến này bao gồm ba biến thể sai nghĩa ở xoắn G, dẫn đến sự phá hủy hoạt độ enzym và có khả năng gây ra bất thường trong việc gắn kết với cơ chất, dựa trên sự bảo tồn trình tự với các enzym cytochrome P450 khác Tuy nhiên, giả thuyết này chưa được xác nhận qua mô hình hóa phân tử CYP21 dựa trên cấu trúc tinh thể của CYP102 Đột biến Val-281Leu (p.V281L) được phát hiện ở hầu hết các bệnh nhân thể không cổ điển thiếu 21-OH mang haplotype.

Nghiên c ứ u v ề vai trò c ủa phân tích độ t bi ế n gen CYP21A2

Kiểu hình của bệnh nhân thiếu 21-OH liên quan chặt chẽ đến hoạt độ enzym, với các đột biến gây thiếu 21-OH là yếu tố chính dự đoán mức độ nặng của bệnh, ít nhất là khả năng giữ muối Krone và cộng sự (2000) đã đề xuất một phương pháp thực hành để đánh giá tương quan kiểu gen - kiểu hình, phân loại các đột biến thành 4 nhóm (null hay 0, A, B, và C) dựa trên dự đoán chức năng và giá trị dự đoán dương tính (PPV) cho từng nhóm.

Dự báo kiểu hình cho thấy sự kết hợp giữa các nhóm 0 và A tạo thành thể cổ điển MM, trong khi nhóm B đại diện cho thể cổ điển NHĐT, và nhóm C là thể không cổ điển.

MM kết hợp với các allele đột biến xóa đoạn hoặc hoán vị gen, cùng với các đột biến điểm có hoạt độ enzym dưới 1% so với bình thường, tạo ra các thể lâm sàng khác nhau Các allele đột biến với hoạt độ enzym tăng dần từ 1-5% liên quan đến thể cổ điển NHĐT (đột biến nhóm B) và từ 15-60% đối với thể không cổ điển (đột biến nhóm C).

Hình 1.7 Hoạt độ enzym theo các nghiên cứu in vitro của gen CYP21A2

Các nhóm đột biến theo phân loại của Krone và cộng sự (2000) [57]

Bảng 1.4 Biểu hiện nam hoá bộ phận sinh dục ngoài theo mức độ nặng của Prader (0-V) của từng nhóm kiểu gen

Tác gi ả M ấ t mu ố i Nam hóa đơn thuầ n

Speiser 1992 [109] II-IV (IV) III-V (IV) I-IV (III) 0-IV (0)

Wedell 1994 [7] III-IV II-V I-IV

Krone 2000 [57] III-V (IV) II-V (IV) II-V (III) 0-IV (0)

Nhóm đột biến C cho thấy khả năng dự đoán cao về việc không có nam hoá bộ phận sinh dục ngoài, trong khi các nhóm đột biến „0‟, „A‟, và „B‟ không có khả năng dự đoán rõ ràng về mức độ nam hoá Thực tế cho thấy mức độ nam hoá có thể nghiêm trọng.

Th ể lâm sàng M ấ t mu ố i Nam hoá đơn thuầ n Không c ổ điể n

Các đột biến như p.L307PfsX6, p.Q318X, p.R356W, p.V281L, p.P453S, p.P30L và p.I172N thường xuất hiện ở bệnh nhân có kiểu gen nặng nhất, với mức độ nam hóa từ Prader II đến V được ghi nhận ở mỗi nhóm đột biến Việc đánh giá mối tương quan giữa các đột biến mới và kiểu hình bệnh nhân là một thách thức, vì phần lớn các đột biến này là đột biến sai nghĩa Để xác định chức năng của protein liên quan đến các đột biến mới, cần thực hiện thử nghiệm gây đột biến và phân tích biểu hiện gen in vitro, tuy nhiên, các phương pháp này khó thực hiện trong các phòng thí nghiệm thông thường Thay vào đó, nghiên cứu dựa trên máy tính có thể giúp đánh giá tác động cấu trúc và chức năng của các đột biến CYP21A2 trên protein P450c21 Các phân tích này không chỉ dự đoán cấu trúc và chức năng của enzym đột biến mà còn hỗ trợ nghiên cứu mối tương quan kiểu gen/kiểu hình, giúp phân biệt giữa thể không cổ điển và thể cổ điển của bệnh NHĐT.

Hầu hết bệnh nhân mắc bệnh là dị hợp tử kép, mang từ hai đột biến trở lên trên hai allele khác nhau Mức độ nặng của bệnh chủ yếu phụ thuộc vào đột biến gây tổn thương hoạt độ enzym nhẹ nhất.

Đột biến thứ hai có vai trò quan trọng đối với bệnh nhân có kiểu gen dị hợp tử kép, trong đó sự kết hợp giữa một đột biến nhẹ và một đột biến nặng thường dẫn đến kiểu hình lâm sàng nghiêm trọng hơn so với bệnh nhân mang hai allele đột biến nhẹ.

Một số bệnh nhân có kiểu gen và kiểu hình không tương quan có thể do các yếu tố như trạng thái ẩn của allele, đặc biệt là với đột biến đồng hợp tử trên intron 2 (I2g); sự khác biệt về số lượng bản sao của lặp đoạn CYP21A2, dẫn đến thiếu sót trong việc đánh giá các allele thiếu 21-OH; và việc không phân tích vùng promoter kết hợp với đột biến p.P30L, gây ra sự chuyển biến kiểu hình nặng hơn của bệnh.

Kiểu gen phân tử của CYP21A2 có liên quan đến nồng độ metanephrine, một chỉ số đánh giá chức năng tủy thượng thận, với nồng độ metanephrine (≤ 18,5 pg/ml) dự đoán các đột biến nặng Khám nghiệm mô bệnh học từ ba bệnh nhân TSTTBS cho thấy sự tăng sinh vỏ thượng thận và thâm nhiễm quá mức của vùng vỏ cùng các tế bào chromaffin Thiếu hụt cortisol ở bệnh nhân TSTTBS dẫn đến sự phát triển bất thường của tủy thượng thận và thiếu hụt epinephrine, có thể là yếu tố góp phần gây hạ đường máu ở bệnh nhân suy thượng thận cấp.

Nghiên cứu mối tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình mang lại thông tin quý giá để hiểu rõ hơn về các thể lâm sàng Điều này đặc biệt quan trọng trong việc phân biệt giữa thể không cổ điển và thể NHĐT ở một số trẻ trai, cũng như giữa thể NHĐT và các thể khác.

MM được phát hiện qua sàng lọc sơ sinh ở một số bệnh nhân trước khi có triệu chứng mất muối Các đột biến nhóm “null” liên quan đến rối loạn chức năng của tủy thượng thận và rất quan trọng để ngăn ngừa hạ glucose máu trong các tình huống căng thẳng.

1.7.2 Tính ph ứ c t ạ p c ủa tư vấ n di truy ền đố i v ớ i thi ế u 21-OH

Sự biến đổi về số lượng bản sao ở locus của gen CYP21A2 gây khó khăn trong việc xác định allele ở bệnh nhân và người lành mang gen, ảnh hưởng đến tư vấn di truyền Hầu hết các nhiễm sắc thể có 3 modules RCCX chứa 2 bản sao của giả gen CYP21A1P và 1 bản sao của gen CYP21A2 Tuy nhiên, một halotype đặc biệt với 1 bản sao của CYP21A1P và 2 bản sao của CYP21A2 cũng đã được ghi nhận, nhấn mạnh tầm quan trọng của việc hiểu rõ đột biến của gen CYP21A2 trên cùng một nhiễm sắc thể.

Một trường hợp cụ thể cho thấy allele với gen CYP21A2 mang đột biến nặng p.Q318X và một gen CYP21A2 bình thường trên cùng nhiễm sắc thể là hiếm gặp theo các nghiên cứu trước đây, nhưng nghiên cứu gần đây cho thấy tỷ lệ này lên tới 7% Sử dụng phương pháp MLPA, Balsamo A và cộng sự (2010) cũng ghi nhận tình trạng tương tự Do đó, khi phát hiện đột biến p.Q318X, cần xem xét khả năng tồn tại một gen CYP21A2 bình thường.

Lặp đoạn của giả gen kết hợp với đột biến p.V281L ở 78% các allele, điều này cần được xem xét khi áp dụng các kỹ thuật xác định số lượng bản sao của gen như MLPA hoặc Southern blot, cũng như trong việc xác định tình trạng kết hợp CYP21A2/CYP21A1P Ngoài ra, lặp đoạn của gen CYP21A2 được xem là yếu tố nguy cơ cho đột biến mới xuất hiện Sự phức tạp này nhấn mạnh tầm quan trọng của việc phân tích cấu trúc RCCX bằng các kỹ thuật hiện đại để tránh nhầm lẫn trong chẩn đoán và đánh giá nguy cơ bệnh cho các thành viên trong gia đình.

1.7.3 Vai trò c ủ a di truy ề n phân t ử đố i v ới chương trình sà ng l ọc sơ sinh TSTTBS

Sàng lọc sơ sinh là phương pháp quan trọng trong chẩn đoán thể cổ điển của TSTTBS Tuy nhiên, việc đánh giá kết quả dương tính với 17-OHP đơn thuần ở trẻ sơ sinh không có triệu chứng có thể gặp khó khăn.

Nghiên c ứ u v ề di truy ề n phân t ử trên các b ệ nh nhân TSTTBS ở Vi ệ t

Nghiên cứu về đột biến gen CYP21A2 trên bệnh nhân TSTTBS tại Việt Nam bắt đầu từ đầu những năm 2000 Các nhà nghiên cứu như Võ Kim Huệ và cộng sự (2000) cùng Thái Thiên Nam (2002) đã áp dụng kỹ thuật PCR để phát hiện đột biến mất 8 bp ở bệnh nhân và các thành viên gia đình của họ.

Trần Kiêm Hảo và cộng sự (2006) đã áp dụng kỹ thuật PCR để sàng lọc các đột biến phổ biến ở bệnh nhân TSTTBS tại Bệnh viện Nhi Trung ương Nghiên cứu này cũng phát hiện dị hợp tử và thực hiện chẩn đoán trước sinh cho các bệnh nhân TSTTBS tại Trung tâm nghiên cứu Gen.

Protein, Trường Đại học Y Hà Nội và tại Bệnh viện Nhi Trung ương từ năm

Năm 2008, việc chẩn đoán trước sinh đã trở thành thực hành lâm sàng thường quy Nghiên cứu của Ngô Thu Hương và cộng sự (2015) đã chỉ ra rằng có thể phát hiện người lành mang gen, từ đó giúp chẩn đoán cho các bà mẹ có nguy cơ sinh con bị hội chứng Down (thiếu nhiễm sắc thể 21).

Các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại như MLPA và giải trình tự gen đã được áp dụng để phát hiện đột biến xóa đoạn và đột biến điểm ở bệnh nhân, thành viên gia đình, cũng như DNA từ bệnh phẩm nước ối trong chẩn đoán và điều trị trước sinh Nghiên cứu về các kiểu hình hiếm, đặc biệt là khối u thượng thận, cũng đã được thực hiện ở bệnh nhân TSTTBS thiếu 21.

OH đã được khẳng định bằng kết quả phân tích đột biến gen CYP21A2 [142]

Trong những năm gần đây, nghiên cứu về điều trị cho các lứa tuổi khác nhau đã được tiến hành, đặc biệt là ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán và điều trị từ giai đoạn bào thai đến giai đoạn trưởng thành Một điểm đáng chú ý là trong số hơn 400 bệnh nhân nữ mắc TSTTBS tại Bệnh viện Nhi Trung ương, đã có 3 mẹ mắc bệnh sinh con khỏe mạnh Các nghiên cứu về đột biến gen CYP21A2 không chỉ tập trung vào chẩn đoán mà còn vào điều trị trước và sau sinh, bên cạnh đó, các nghiên cứu di truyền phân tử và kiểu hình cũng được thực hiện đối với các thể hiếm của TSTTBS như thiếu 11β-hydroxylase và thiếu 3β-hydroxysteroid dehydrogenase typ 2 Những nghiên cứu này đã cung cấp cái nhìn toàn diện về các thể bệnh TSTTBS do thiếu các enzym khác nhau đang tồn tại ở Việt Nam, với công bố của Vũ Chí Dũng và cộng sự về chẩn đoán phân loại thể thiếu các enzym đặc hiệu trên 715 bệnh nhân TSTTBS.

Tại Bệnh viện Nhi Trung ương, trong số 715 trẻ em, có 375 trẻ trai (52%) và 340 trẻ gái (48%) Trong đó, 703 bệnh nhân (98,3%) mắc thể thiếu 21-OH, 9 bệnh nhân (1,3%) thiếu 11-OH, và 3 bệnh nhân (0,4%) mắc thể hiếm của thiếu 3β-hydroxysteroid dehydrogenase typ 2, được khẳng định qua phân tích đột biến gen.

Đột biến đồng hợp tử của gen HSD3B2 đã được phát hiện ở một nhóm bệnh nhân, bổ sung dữ liệu ngân hàng gen cho các bệnh hiếm Đến nay, chỉ có khoảng 60 bệnh nhân mắc thể TSTTBS hiếm do đột biến HSD3B2 được ghi nhận trong tài liệu y khoa toàn cầu.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U

Trang thi ế t b ị , d ụ ng c ụ và hóa ch ấ t s ử d ụ ng cho phát hi ện độ t bi ế n gen

 Máy điện di: Mupid (Nhật Bản)

 Máy soi gel và chụp ảnh tựđộng (Dolphin Chemi Wealtec, USA)

 Máy quang phổ kế Nano- Drop (Nhật Bản)

 Máy ly tâm lạnh Beckman (USA) và ly tâm các loại (Đức)

 Tủ lạnh âm sâu: -30 o C và - 80 o C (Sanyo-Nhật Bản))

 Máy đọc trình tự gen 3100-Avant Genetic Analyzer của hãng ABI-PRISM

Dụng cụđược vô trùng tuyệt đối bằng hấp ướt 120 o C trong 20 phút

 Pipet, đầu côn các loại

2.2.3 Hóa ch ấ t nghiên c ứ u 2.2.3.1.Hóa chất tách chiết DNA từ máu ngoại vi:

 Dung dịch phenol: cloroform: isoamyl có tỷ lệ: 25: 24: 1

 Dung dịch cloroform: isoamyl có tỷ lệ: 24: 1

 Ethanol tuyệt đối (100%) và Ethanol 70%

 Dung dịch TE để hòa tan DNA và bảo quản DNA sau khi tách

2.2.3.2 Hóa chất cho phản ứng PCR

 Các cặp mồi (xuôi và ngược),

 Dung dịch TBE 10X (Khi sử dụng pha thành 1X): Tris 0,89 M, Acid Boric 0,89 M, EDTA 0,02M, dung dịch Ethydium bromide

2.2.3.4 Hóa chất giải trình tự gen

Sử dụng kit giải trình tự cho máy ABI 3100

Sử dụng SALSA kit bao gồm 9 thành phần sau

 Đệm hòa loãng enzym - Enzym dilution buffer: 250.1

 Probemix: 160.1 (đặt trước theo trình tự đoạn gen đích).

Phương pháp nghiên cứ u

Nghiên cứu này thực hiện một loạt các ca bệnh để đánh giá kiểu hình tại thời điểm chẩn đoán, cũng như theo dõi tiến cứu và hồi cứu Nghiên cứu tập trung vào việc phát hiện đột biến gen CYP21A2, phân tích kiểu gen và mối tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình Mẫu được chọn theo phương pháp thuận tiện, dựa trên bệnh nhân đáp ứng đủ tiêu chuẩn lựa chọn và các tiêu chuẩn loại trừ.

Kiểu hình lâm sàng: được tiến hành tại Khoa Nội tiết – Chuyển hóa –

Tại Bệnh viện Nhi Trung ương, mỗi bệnh nhân được lập hồ sơ nghiên cứu riêng, bao gồm việc vẽ phả hệ gia đình và khai thác tiền sử bệnh Quy trình khám lâm sàng toàn diện bao gồm đo chiều cao cho trẻ từ 2 tuổi trở lên và chiều dài nằm cho trẻ dưới 2 tuổi hoặc trẻ không thể đứng, sử dụng thước SECA Bên cạnh đó, việc cân nặng, phát hiện các triệu chứng như xạm da, mất nước, và khám bộ phận sinh dục ngoài cũng rất quan trọng Đặc biệt, việc phân loại mức độ nam hóa theo Prader và đánh giá các giai đoạn dậy thì của Tanner, như phát triển lông mu, tuyến vú ở bệnh nhân nữ, cũng như đo chiều dài, chu vi dương vật và thể tích tinh hoàn bằng bộ dụng cụ orchidometer, là các bước không thể thiếu Ngoài ra, cần chú ý đến các biểu hiện khác như giọng ồm, ria mép ở bệnh nhân nữ và sự phát triển cơ bắp, mụn trứng cá ở cả hai giới.

Di truyền tế bào là một phương pháp quan trọng trong việc xác định giới tính, đặc biệt khi có sự mơ hồ về giới Tại Khoa Xét nghiệm Di truyền, Bệnh viện Nhi Trung ương, karyotype băng G được thực hiện với mẫu bệnh phẩm là 2 ml máu ngoại vi, được bảo quản bằng heparin.

Khoa chẩn đoán hình ảnh tại Bệnh viện Nhi Trung ương cung cấp các dịch vụ siêu âm tiểu khung để phát hiện tử cung và buồng trứng cho trẻ mơ hồ giới tính, siêu âm thượng thận, cùng với chụp X-quang để xác định tuổi xương cho trẻ.

> 3 tuổi và nhận định kết quả dựa trên atlat của Greulich và Pyle

Tại Khoa Sinh hóa, Bệnh viện Nhi Trung ương, các xét nghiệm sinh hóa được thực hiện với mẫu máu 2 ml chống đông heparin trước khi điều trị hormon thay thế Các chỉ số điện giải huyết thanh như Na+, K+ và Cl- được xác định bằng phương pháp điện cực chọn lọc ion gián tiếp trên máy Beckman Coulter AU2700/AU680 Định lượng các hormon ACTH, cortisol, testosterone và androstenedione sử dụng các kit thương mại Đối với hormon 17-OHP, xét nghiệm được thực hiện ở điều kiện cơ bản và sau khi kích thích ACTH (1 giờ sau tiêm tĩnh mạch 250 µg ACTH tổng hợp – Cortrosyn) ở những bệnh nhân có kết quả không rõ ràng, sử dụng phương pháp ELISA với kit của hãng DRG và máy đọc Elx808.

Phân tích đột biến gen CYP21A2 được thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein thuộc Trường Đại học Y Hà Nội và Khoa Di truyền của Bệnh viện Nhi Trung ương, theo quy trình như hình 2.1.

Thu thập mẫu máu của BN, tách chiết DNA

PCR khuếch đại gen CYP21A2

Giải trình tự xác định đột biến điểm

BN chỉ có đột biến dị hợp tử xóa đoạn hoặc không có đột biến xóa đoạn Có đột biến đồng hợp tử xóa đoạn

Phân tích MLPA để xác định đột biến xóa đoạn gen CYP21A2

Lựa chọn 212 BN TSTTBS thể thiếu 21-OH thuộc 204 gia đình BN

Có đột biến điểm gen CYP21A2

Các dạng đột biến gen CYP21A2

Bản đồ đột biến gen CYP21A2

Phân tích mối tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

2.3.1 Thu th ậ p và tách chi ế t m ẫ u nghiên c ứ u 2.3.1.1 Quy trình thu thập mẫu máu tĩnh mạch

Đối tượng nghiên cứu bao gồm bệnh nhân (proband), anh chị em ruột có triệu chứng lâm sàng và kết quả xét nghiệm TSTTBS thiếu 21-OH, cùng với bố mẹ bệnh nhân và nhóm đối chứng Mẫu máu tĩnh mạch 2 ml được thu thập, sử dụng chất chống đông EDTA 1,5 mg/mL, đảm bảo quy trình vô trùng tuyệt đối.

2.3.1.2 Kỹ thuật tách chiết DNA tổng số từ máu ngoại vi

DNA được tách chiết theo phương pháp thường quy Phenol/Chloroform

Cho 0,5 ml máu toàn phần chống đông EDTA vào ống Eppendorf 1,5 ml và thêm 0,5 ml dung dịch lysis buffer Để hỗn hợp này trên đá trong 10 phút, sau đó ly tâm ở 8000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ 4 độ C Cuối cùng, loại bỏ dịch và thu cặn.

- Cho vào 0,5 ml dung dịch K, ly tâm 8000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 o C, loại bỏ dịch và thu cặn

- Cho vào 0,5 ml lysis buffer; 12,5àl SDS 10%; 10 àl Protease K; ủ ở 56 o C trong 23 giờ Cho 0,5 ml dung dịch Phenol: Chloroform : Isoamyl; ly tâm

Quá trình chiết xuất DNA diễn ra bằng cách quay với tốc độ 10.000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ 4 độ C Hỗn hợp được phân chia thành ba lớp: lớp dung dịch phía trên chứa DNA, lớp giữa bao gồm các thành phần tế bào, và lớp dưới cùng là dịch chiết Để đảm bảo mẫu DNA sạch, phần dịch trên cùng chứa DNA được hút ra và quá trình chiết suất này được lặp lại một lần nữa nhằm loại bỏ hoàn toàn tạp chất.

- Cho vào dung dịch mẫu DNA 0,5 ml chloroform: Isoamyl, ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút ở 4 o C Hút lấy phần dịch trên cùng và tiến hành lặp lại một lần nữa

- Tủa DNA bằng 1ml alcol tuyệt đối, thêm 50 μl Na acetat, để lạnh qua đêm ở - 20°C Ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 4 o C, bỏ dịch trên, thu tủa

Để rửa tủa DNA, sử dụng cồn 70° Tủa DNA được hòa tan bằng 50 microlit nước tinh khiết hoặc TE Độ tinh sạch của dung dịch DNA sẽ được kiểm tra bằng phương pháp đo mật độ quang ở bước sóng 260/280 nm.

2.3.2 Xác định độ t bi ế n gen CYP21A2 2.3.2.1 Kỹ thuật PCR

Toàn bộ chiều dài gen CYP21A2 được khuếch đại bằng phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu P1-P10; P3-P5; P6-P4

Hình 2.2 Vị trí các mồi sử dụng cho PCR và giải trình tự gen

- Thành phần phản ứng: thể tớch 20 àl gồm: 100  150 ng DNA, 5 pmol primer, 200 àmol/l dNTP, 2 đơn vị enzym Taq polymerase và 2 àl GeneAmp

- Chu tr nh nhiệt: 94 o C/5phút, 94 o C/1phút, 60 o C/1phút, 72 o C/1phút x 35 chu kỳ, 72 o C/2 phút, giữ ở 15 o C

Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1%, 90V trong 30 phút

2.3.2.2 Kỹ thuật giải trình tự gen

Sản phẩm PCR sau khi điện di trên gel agarose cần được tinh sạch bằng Gel purification Kit trước khi tiến hành giải trình tự gen Để giải trình tự toàn bộ gen CYP21A2, sử dụng các mồi được mô tả trong bảng 2.1 Quy trình giải trình tự được thực hiện theo phương pháp BigDye terminator sequencing (Applied).

Kết quả giải trình tự gen được phân tích bằng phần mềm CLC Main Workbench, trong đó mẫu DNA của bệnh nhân được so sánh với mẫu DNA đối chứng và trình tự CYP21A2 trên GeneBank (Accession number NM_0005002).

Bảng 2.1 Trình tự mồi dùng cho phản ứng PCR và giải trình tự gen

Trong phản ứng MLPA (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification), việc thiết kế các probe gắn đặc hiệu với các đoạn DNA đích là rất quan trọng Mỗi probe thường bao gồm hai phân tử oligonucleotid có kích thước khác nhau, điều này giúp tăng cường độ chính xác trong quá trình phân tích.

+ Phân tử oligonucleotid ngắn gồm 2 đoạn:

Đoạn 1 của probe có trình tự nucleotid đặc hiệu, cho phép nó lai với DNA đích trong quá trình phản ứng lai Đoạn này thường có độ dài từ 21 đến 30 nucleotid và nằm ở đầu 3' của probe.

Đoạn 2, nằm ở đầu 5', dài khoảng 19 nucleotid, có trình tự nucleotid đồng nhất cho tất cả các probe Vị trí này là nơi gắn với mồi Y để khuếch đại probe trong quá trình phản ứng PCR.

S ả n ph ẩ m khu ế ch đạ i c ủ a các probe đượ c phân tách b ằ ng điệ n di, s ố lượ ng s ả n ph ẩ m khu ế ch đạ i c ủ a m ỗ i probe t ỷ l ệ thu ậ n v ớ i s ố b ả n sao c ủ a đoạ n DNA đ ích

Hình 2.3 Các giai đoạn của kỹ thuật MLPA

(Schouten JP và cộng sự 2002) [87]

+ Phân tử oligonucleotid dài gồm 3 đoạn:

 Đoạn 1‟ chứa 2543 nucleotid, gắn đặc hiệu với DNA đích ởđầu tận 5‟.

 Đoạn 2‟ gồm 36 nucleotid ởđầu 3‟, trình tự nucleotid giống nhau cho các probe Đây là vị trí gắn với mồi X đặc hiệu để khuếch đại probe

Đạo đứ c trong nghiên c ứ u

Lợi ích cho người bệnh bao gồm việc có chẩn đoán chính xác và xác định kiểu gen trong gia đình, từ đó tạo nền tảng vững chắc cho việc điều trị suốt đời bằng liệu pháp hormone thay thế Điều này cũng hỗ trợ cho tư vấn di truyền, cũng như chẩn đoán và điều trị trước sinh.

Nghiên cứu này sẽ cung cấp bằng chứng khoa học về đột biến gen CYP21A2 ở người Việt Nam mắc TSTTBS, góp phần làm phong phú thêm dữ liệu về đột biến gen này trong ngân hàng gen.

Nghiên cứu này mang lại giá trị lớn cho công tác đào tạo và thực hành lâm sàng, giúp bác sĩ có cơ sở vững chắc trong việc điều trị và quản lý bệnh nhân Dữ liệu y học chứng cứ từ nghiên cứu sẽ hỗ trợ trong việc nâng cao chất lượng đào tạo Hơn nữa, kết quả kiểu gen sẽ cho phép các nhà lâm sàng cá thể hóa phương pháp điều trị, đáp ứng tốt hơn nhu cầu riêng biệt của từng bệnh nhân.

Đề tài nghiên cứu đã nhận được sự chấp thuận từ hội đồng Y đức của Bệnh viện Nhi Trung ương, với sự đồng ý của bệnh nhân (người trưởng thành), cha mẹ hoặc người chăm sóc Đồng thời, nghiên cứu cũng cam kết đảm bảo tính bí mật cho tất cả các đối tượng tham gia.

K Ế T QU Ả

K ế t qu ả xác định độ t bi ế n gen CYP21A2 và b ản đồ độ t bi ế n gen

CYP21A2 của bệnh nhân TSTTBS thể thiếu 21-OH

3.1.1 Đặc điể m chung c ủ a nhóm nghiên c ứ u

Nghiên cứu này đã phân tích gen CYP21A2 để xác định đột biến ở 212 bệnh nhân thuộc 204 gia đình, trong đó có 8 gia đình có hai con mắc bệnh Kết quả cho thấy 30 trong số 204 gia đình (14,7%) có ít nhất hai con mắc bệnh, với 25 gia đình có hai con, 3 gia đình có ba con và 2 gia đình có số lượng con mắc bệnh nhiều hơn.

Trong số 212 bệnh nhân thiếu 21-OH được phân tích đột biến gen

CYP21A2 thì có 97 bệnh nhân nam (45,8%) và 115 bệnh nhân nữ (54,2%);

Trong nghiên cứu, kiểu hình thể cổ điển chiếm ưu thế với 96,7% tổng số bệnh nhân, tương đương 205/212 bệnh nhân Trong đó, thể cổ điển MM chiếm 78,5% (161/205) và NHĐT chiếm 21,5% (44/205) Chỉ có 4/212 bệnh nhân (1,9%) được xác định là thể không cổ điển, trong khi 3/212 bệnh nhân (1,4%) chưa xác định được thể lâm sàng Tóm lại, 209 bệnh nhân đã được xác định kiểu hình.

Phân bố về giới, tuổi chẩn đoán, các biểu hiện lâm sàng chính của từng kiểu hình trong số 209 bệnh nhân được trình bày tóm tắt tại bảng 3.1

Bảng 3.1 Đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu

Tu ổ i ch ẩn đoán (ngày); trung v ị (Min – Max)

Tu ổ i ch ẩn đoán theo gi ớ i (ngày); trung v ị (Min - Max)

Suy thượ ng th ậ n c ấ p lúc chẩn đoán

Sàng l ọ c/ch ẩ n đ oán s ớ m < 5 ngày tu ổ i

Tiền sử gia đình/xét nghi ệ m di truy ề n

Nghiên cứu cho thấy trẻ gái thường được chẩn đoán mắc thể NHĐT nhiều hơn trẻ trai, trong khi thể cổ điển MM lại có tỷ lệ chẩn đoán sớm hơn ở trẻ gái Đặc biệt, trẻ gái cũng được chẩn đoán sớm hơn trẻ trai trong thể MM Tỷ lệ suy thượng thận cấp tại thời điểm chẩn đoán ở trẻ trai cao hơn so với trẻ gái (p = 0,017; test  2) Hơn nữa, tỷ lệ chẩn đoán sớm dưới 5 ngày tuổi ở trẻ gái cũng cao hơn trẻ trai trong thể MM (p = 0,0001; test Fisher‟s exact).

3.1.2 K ế t qu ả xác định độ t bi ế n gen CYP21A2 c ủ a b ệ nh nhân TSTTBS 3.1.2.1 Kết quả tách chiết DNA

Các mẫu DNA từ bệnh nhân nghiên cứu có nồng độ từ 100 đến 891 ng/μl và độ tinh sạch ở bước sóng 260/280nm trong khoảng 1,8 đến 2,0, cho thấy chất lượng tốt để phục vụ cho các quy trình phân tích gen tiếp theo.

3.1.2.2 Kết quảxác định đột biến gen CYP21A2

Nghiên cứu đã xác định đột biến gen CYP21A2 trên 212 bệnh nhân mắc hội chứng thiếu 21-hydroxyase (21-OH) Kỹ thuật MLPA được sử dụng để phát hiện các đột biến xóa đoạn, trong khi kỹ thuật giải trình tự trực tiếp được áp dụng để phát hiện các đột biến điểm.

Kết quảxác định đột biến xóa đoạn bằng kỹ thuật MLPA

Phát hiện được 8 dạng đột biến xóa đoạn khác nhau gồm các đột biến xóa một đến một vài exon hoặc có xóa đoạn toàn bộ gen CYP21A2

B ệnh nhân có độ t bi ến xóa đoạ n t ừ exon 1 đế n exon 3 gen CYP21A2:

Hình 3.1 Hình ảnh xóa đoạn exon 1-3 (exon 1-3 del) gen CYP21A2

(1) Mẫu người b nh thường; (2) Mẫu bệnh nhân mã số 52

 Ex1, Ex3, Ex4, Ex6, Ex8, là các đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, 3, 4,

 E1P, I2P, E10P là các đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, intron 2, và exon 10 của gen CYP21A1P

 C4A, C4B là đỉnh tương ứng với gen C4A, C4B

 Y là đỉnh tương ứng với NST Y

Kết quả phân tích MLPA cho bệnh nhân mã số 52 cho thấy có sự đột biến xóa đoạn gen từ exon 1 đến exon 3 của gen CYP21A2, được xác định bằng việc không xuất hiện các đỉnh tương ứng với exon 1 và exon 3 của gen CYP21A2 cũng như gen C4B khi so sánh với mẫu đối chứng.

B ệnh nhân có độ t bi ến xóa đoạ n t ừ gen C4B đế n exon 8 c ủ a gen CYP21A2:

Hình 3.2 Hình ảnh xóa đoạn từ gen C4B đến exon 8 của gen CYP21A2

(1) Mẫu người b nh thường; (2) Mẫu bệnh nhân số 90

 Ex1, Ex3, Ex4, Ex6, Ex8, là các đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, 3,

 E1P, I2P, E10P là các đỉnh tương ứng với vị trí exon 1, intron 2 và exon 10 của gen CYP21A1P

 C4A, C4B là đỉnh tương ứng với gen C4A, C4B

 Y là đỉnh tương ứng với NST Y

Kết quả phân tích MLPA cho bệnh nhân mã số 90 cho thấy có sự xóa đoạn gen CYP21A2 từ gen C4B đến exon 8 Điều này được xác nhận bởi việc không xuất hiện các đỉnh tương ứng với gen C4B và các exon 1, 3, 4, 6, 8 của gen CYP21A2 khi so sánh với mẫu đối chứng.

Để xác định đột biến điểm trong gen CYP21A2, quy trình bắt đầu bằng việc khuếch đại toàn bộ 10 exon của gen này bằng ba cặp mồi P4-P6, P3-P5 và P1-P10 Sản phẩm PCR sau đó được điện di trên gel agarose 1,5% Hình ảnh minh họa kết quả PCR cho thấy sự khuếch đại thành công các sản phẩm PCR của gen CYP21A2 tương ứng với các cặp mồi đã sử dụng.

Hình 3.3 Hình ảnh sản phẩm PCR khuyếch đại gen CYP21A2

Sản phẩm PCR bao gồm đoạn gen P6-P4, P3-P5, và P1-P10, với các mẫu kiểm tra được đánh dấu: M là marker 100 bp và 1kb, mẫu nước (-) và mẫu đối chứng (+), cùng với 5 mẫu bệnh nhân.

Nh ậ n xét: Kết quả cho thấy, sản phẩm PCR của các mẫu bệnh nhân từ 1 đến 5 đều thu được vạch đặc hiệu tương tựnhư mẫu đối chứng

Sản phẩm PCR được sử dụng để giải trình tự gen nhằm xác định các đột biến điểm, phát hiện nhiều dạng đột biến như đột biến sai nghĩa, vô nghĩa, và đột biến ở vùng không mã hóa gen Kết quả cho thấy bệnh nhân có thể có đột biến đồng hợp tử tại một vị trí hoặc dị hợp tử, đồng hợp tử với 2 hoặc 3 vị trí đột biến Nghiên cứu cũng đã phát hiện 6 đột biến mới, bao gồm 2 đột biến tạo mã kết thúc sớm, 2 đột biến sai nghĩa, 1 đột biến lặp đoạn và 1 đột biến thêm nucleotid.

B ệ nh nhâ n có độ t bi ến đồ ng h ợ p t ử g.655A/C>G (I2g):

Người bình thường Bệnh nhân

Hình 3.4 Hình ảnh đột biến đồng hợp tử g.655A/C>G

(Hình ảnh giải trình tự gen theo chiều ngược)

Nh ậ n xét: Giải trình tự gen CYP21A2 phát hiện bệnh nhân mã số 111 có đột biến đồng hợp tử tại vị trí g.655A/C>G trên intron 2

B ệnh nhân có độ t bi ế n d ị h ợ p t ử p.I172N và p.R426C k ế t h ợ p:

Người bình thường Người bình thường Bệnh nhân

Hình 3.5 Hình ảnh đột biến dị hợp tử p.I172N và p.R426C kết hợp

Bài viết nhận xét về việc giải trình tự gen CYP21A2, trong đó phát hiện bệnh nhân mã số 57 có đột biến dị hợp tử p.I172N và p.R426C Cụ thể, đột biến đầu tiên là thay thế nucleotid 515T>A, dẫn đến bộ ba thứ 172 ATC mã hóa Isoleucin chuyển thành AAC mã hóa Asparagin (I172N) Đột biến thứ hai là thay thế nucleotid 1276C>T, ảnh hưởng đến cấu trúc gen.

426 CGC mã hóa Arginin chuyển thành TGC mã hóa Cystein (p.R426C)

B ệnh nhân có độ t bi ến đồ ng h ợ p t ử p.Q318X và p.R356W k ế t h ợ p:

Người bình thường Người bình thường Bệnh nhân c.952C c.952C>T p.Q318X c.1066C>T p.R356W c.1066C

Hình 3.6 Hình ảnh đột biến đồng hợp tử p.Q318X và p.R356W

Bệnh nhân mã số 211 được phát hiện có đột biến đồng hợp tử ở gen CYP21A2, bao gồm hai vị trí quan trọng: (1) đột biến 952C>T dẫn đến sự thay thế bộ ba thứ 318 từ CAG (Glutamin) thành TAG (bộ ba kết thúc, Q318X); (2) đột biến 1066C>T khiến bộ ba thứ 356 chuyển từ CGG (Arginin) sang TGG (Tryptophan, R356W).

B ệnh nhân có độ t bi ế n d ị h ợ p t ử p.Q3 18X và đồ ng h ợ p t ử p.R356W t ạ i 2 v ị trí: c.952C c.952C>T p.Q318X

Bệnh nhân Người bình thường c.1066C>T p.R356W c.1066C

Bệnh nhân Người bình thường

Hình 3.7 Hình ảnh đột biến dị hợp tửp.Q318X và đồng hợp tử p.R356W

Giải trình tự gen CYP21A2 cho thấy bệnh nhân mã số 88 có hai đột biến đáng chú ý: (1) đột biến dị hợp tử p.Q318X do thay thế nucleotid 952C>T, dẫn đến việc bộ ba thứ 318 CAG mã hóa Glutamin chuyển thành TAG, tạo ra bộ ba kết thúc (Stop Codon), và (2) đột biến đồng hợp tử p.R356W do thay thế nucleotid 1066C>T, khiến bộ ba thứ 356 CGG mã hóa Arginin chuyển thành TGG, mã hóa Tryptophan.

B ệnh nhân có 3 độ t bi ế n d ị h ợ p t ử g.655A/C>G (I2g), p.Q318X và p.R356W:

Hình 3.8 Hình ảnh 3 đột biến dị hợp tử g.655A/C>G, p.Q318X và p.R356W

Giải trình tự gen CYP21A2 của bệnh nhân mã số 119 cho thấy có 3 đột biến dạng dị hợp tử, bao gồm g.655A/C>G (I2g), p.Q318X và p.R356W Đặc biệt, đột biến g.656A/C>G là một sự thay thế nucleotid xảy ra tại intron 2.

Đột biến thay thế nucleotid 952C>T dẫn đến việc bộ ba thứ 318 CAG mã hóa Glutamin chuyển thành TAG, tạo thành bộ ba kết thúc (Stop Codon) được ký hiệu là Q318X Ngoài ra, đột biến thay thế nucleotid 1066C>T làm cho bộ ba thứ 356 CGG mã hóa Arginin chuyển thành TGG, mã hóa Tryptophan, được ký hiệu là R356W.

B ệnh nhân có độ t bi ế n p.I236N, p.V237E, p.M239K d ạ ng cluster E6

Người bình thường Bệnh nhân c.707T; 710T; 716T c.707T>A; 710T>A; 716T>A p I236N; V237E; M239K (Cluster E6)

Hình 3.9 Hình ảnh đột biến p.I236N, p.V237E, p.M239K cluster E6

Nh ậ n xét: Giải trình tự gen CYP21A2 phát hiện bệnh nhân mã số

M ối tương quan giữ a ki ể u gen và ki ể u hình c ủ a b ệ nh nhân TSTTBS

3.2.1 Ki ể u hình c ủ a các nhóm ki ể u gen khác nhau và giá tr ị d ự báo dương tính

202 bệnh nhân chỉ điểm trong tổng số 210 bệnh nhân có đột biến

Gen CYP21A2 có 8 cặp anh chị em ruột với kiểu gen và kiểu hình đồng nhất Trong số đó, 3 bệnh nhân nữ không xác định được kiểu hình do được chẩn đoán và điều trị sớm trước 2 ngày tuổi Tổng cộng, 199 bệnh nhân đã được xác định kiểu hình và phát hiện đột biến, được phân loại vào các nhóm kiểu gen khác nhau như thể hiện trong bảng 3.4 và 3.5.

3.2.1.1 Tương quan kiểu gen - kiểu hình của các bệnh nhân có kiểu gen thuộc các nhóm “null‟, A, B, C và giá trị dự báo dương tính

Phân bố về tần số các bệnh nhân theo kiểu hình khác nhau của từng nhóm kiểu gen được trình bày ở bảng 3.4 và các biểu đồ 3.2; 3.3 và 3.4

Bảng 3.4 Kiểu gen - kiểu hình của bệnh nhân TSTTBS có kiểu gen thuộc nhóm “null”, A, B và C

Nhóm độ t bi ế n Ki ể u hình d ự báo

Ki ể u hình c ủ a các b ệ nh nhân nghiên c ứ u T ổ ng s ố

Nhóm Allele 1 Allele 2 MM NHĐT Không c ổ điể n

Ghi chú: 0 ( các độ t bi ế n xóa đoạ n gen; exon 6 cluster; p.L307FfsX6; p.Q318X; p.R356W ; các độ t bi ế n m ớ i gây l ệ ch khung d ị ch mã trên c ả 2 allele); A (I2g); B (p.I172N; promoter+ p.P30L); C (p.P30L; p.V281L)

Nhóm kiểu gen “null” và “A” chủ yếu biểu hiện kiểu hình thể MM, trong khi nhóm kiểu gen B chủ yếu có kiểu hình thể NHĐT Giá trị dự báo kiểu hình dương tính cho các nhóm kiểu gen “null”, A, B và C lần lượt đạt 99,8%; 96,5%; 90,6% và 100%.

Biểu đồ 3.2 Kiểu hình của các kiểu gen thuộc nhóm “null”

Trục hoành là các kiểu gen của nhóm “null” Trục tung là sốlượng bệnh nhân có kiểu hình MM (màu đỏ) và NHĐT (màu xanh)

Nh ậ n xét: 88/90 bệnh nhân có kiểu hình MM và chỉ 2/90 bệnh nhân (kiểu gen p.R356W/p.R356W và cluster 6/p.L307FfsX6) có kiểu gen nhóm

“null” có kiểu hình NHĐT

Biểu đồ 3.3 Kiểu hình của các kiểu gen thuộc nhóm A

Trục hoành là các kiểu gen khác nhau của nhóm A, trục tung là số bệnh nhân có kiểu hình cổđiển MM (màu đỏ) hoặc NHĐT (màu xanh)

Nh ậ n xét: 2/57 bệnh nhân kiểu gen I2g/I2g có kiểu hình NHĐT trong số các bệnh nhân có kiểu gen nhóm A

Biểu đồ 3.4 Kiểu hình của các kiểu gen thuộc nhóm B

Trục hoành là các kiểu gen thuộc nhóm B, trục tung là số bệnh nhân có kiểu

Trong một nghiên cứu với 32 bệnh nhân, 29 bệnh nhân có kiểu hình NHĐT, trong khi 3 bệnh nhân còn lại có kiểu hình MM Các bệnh nhân kiểu hình MM này có kiểu gen tương ứng là p.I172N/p.I172N, p.I172N/p.I172N+I2g, và Promoter+I2g+p.P30L/I2g, thuộc nhóm gen B.

3.2.1.2 Kiểu hình của các bệnh nhân có kiểu gen thuộc nhóm D

Nhóm kiểu gen D bao gồm các đột biến sai nghĩa đã được báo cáo hoặc các đột biến mới mà chưa được chứng minh chức năng protein in vitro Các kiểu gen này chỉ phát hiện một đột biến ở dạng dị hợp tử mà không tìm thấy allele đột biến thứ hai Tần số phân bố các kiểu hình khác nhau của mỗi kiểu gen được trình bày trong bảng 3.5.

Bảng 3.5 Kiểu gen và kiểu hình của các bệnh nhân có kiểu gen thuộc nhóm D

Ki ể u hình T ổ ng s ố b ệ nh nhân (n) %

Nh ậ n xét : Các đột biến phổ biến I2g; p.I172N; p.Q318X và p.R356W xuất hiện ở 7/9 kiểu gen khác nhau của nhóm D Đột biến sai nghĩa p.P401L kết hợp với p.R356W gây kiểu hình NHĐTở 1 bệnh nhân

3.2.2 Ki ể u gen ph ổ bi ế n c ủ a các ki ể u hình khác nhau

Các kiểu gen phổ biến cho mỗi kiểu hình riêng rẽ cũng được phân tích trên cơ sở dữ liệu được trình bày ở bảng 3.3 phần 3.1.2.4

Kiểu gen phổ biến của thể cổ điển MM bao gồm: Del/Del (29/153;

18,9%); I2g/I2g (27/153; 17,6%); Del/I2g (22/153; 14,4%); p.R356W/p.R356W (12/153; 7,8%); exon 1-3 del/exon 1-3 del (11/153;

Kiểu gen phổ biến của thể NHĐT bao gồm: Del/p.I172N (10/42; 23,8%); p.I172N/p.I172N (8/42; 19,1%) và I2g/p.I172N (4/42; 9,5%)

Kiểu gen phổ biến của thể không cổ điển là p.V281L/p.L307FfsX6 (3/4;

3.2.3 Tương quan kiể u gen - ki ể u hình c ủ a m ộ t s ố độ t bi ến điể m ph ổ bi ế n

Bảng 3.3 phần 3.2.1.4 cho thấy kiểu hình của các bệnh nhân có ít nhất một allele mang các đột biến điểm phổ biến như I2g, p.I172N hoặc p.R356W.

Tỷ lệ bệnh nhân có ít nhất 1 allele đột biến I2g, hoặc p.R356W, hoặc p.I172N tương ứng là 74/202 (36,6%); 35/202 (17,3%) và 34/202 (16,8%)

Kiểu hình của các bệnh nhân có ít nhất 1 đột biến trong số 3 đột biến này được trình bày tại biểu đồ 3.5

94,1 Mất muối nam hóa đơn thuần

Biểu đồ 3.5 Kiểu hình của các kiểu gen có ít nhất 1 trong 3 đột biến điểm phổ biến

Trục hoành đại diện cho các kiểu gen có ít nhất một allele đột biến như I2g, p.R356W hoặc p.I172N, trong khi trục tung thể hiện tỷ lệ bệnh nhân có kiểu hình MM (màu đỏ) và NHĐT (màu xanh).

Hầu hết bệnh nhân mang ít nhất một allele đột biến I2g hoặc p.R356W thể hiện kiểu hình MM, trong khi đó, đa số bệnh nhân có ít nhất một allele đột biến p.I172N lại có kiểu hình NHĐT.

3.2.4 Tri ệ u ch ứ ng lâm sàng và hóa sinh c ủ a các b ệ nh nhân không phù h ợ p gi ữ a ki ể u gen và ki ể u hình

Có 7/202 (3,5%) bệnh nhân không phù hợp giữa kiểu gen và kiểu hình

Kiểu gen, kiểu hình dự báo, kiểu hình thực tế và các triệu chứng lâm sàng, hóa sinh của các bệnh nhân này được trình bày tại bảng 3.6

Bảng 3.6 Triệu chứng lâm sàng và hóa sinh của các bệnh nhân không phù hợp giữa kiểu gen - kiểu hình

Ki ể u gen (ki ể u hình d ự báo)

Lâm sàng và xét nghi ệ m hóa sinh

Mơ hồ gi ớ i tính, m ất nướ c, m ấ t mu ố i (Na 122; K 5; Cl 100 mmol/l) 17- OHP 21 ng/ml

D ậ y thì s ớ m gi ả (cao 123 cm, gi ọ ng ồm, dương vậ t 6 cm, lông mu P2, th ể tích tinh hoàn 3 ml) 17-OHP 821 ng/ml; testosterone 11,47 nmol/l

ACTH 20,7 pg/ml Tu ổi xương 11 tu ổ i

D ậ y thì s ớ m gi ả (cao 116 cm, gi ọ ng ồm, dương vậ t 6 cm, lông mu P3, th ể tích tinh hoàn 2 ml); 17-OHP 167 ng/ml, tu ổi xương 11 tuổ i

Prader II-III; nôn; m ất nướ c; Na 125;

K 4,7; Cl 94 mmol/l; 17-OHP 40,8 ng/ml; testosterone 16,96 nmol/l

Prader III, x ạ m da Na 126; K 4,7; Cl 93,3 mmol/l; 17-OHP 17,2 ng/ml; cortisol 96,3 nmol/l

Prader III, x ạ m da, Na 142; K 3,7; Cl

106 mmol/l; 17-OHP 43,3 ng/ml; tu ổ i xương 13 tuổ i

D ậ y thì s ớ m gi ả (lông mu P3; dương v ậ t 8 cm; th ể tích tinh hoàn 1,5 ml);

17-OHP 725 ng/ml; testosterone 8,4 nmol/l; tu ổi xương 6 tuổ i

Nh ậ n xét: 2 bệnh nhân có kiểu gen nhóm “null” nhưng có kiểu hình NHĐT; 2 bệnh nhân nhóm A có kiểu hình NHĐT và 3 bệnh nhân nhóm B có kiểu hình MM

3.2.5 Ki ể u hình c ủ a các b ệ nh nhân c ó độ t bi ế n m ớ i c ủ a gen CYP21A2

6/202 bệnh nhân có đột biến mới gen CYP21A2 Kiểu gen, triệu chứng lâm sàng và hóa sinh của các bệnh nhân này được trình bày tại bảng 3.7

Bảng 3.7: Kiểu hình (triệu chứng lâm sàng và hóa sinh) của các bệnh nhân có đột biến mới của gen CYP21A2

TT Ki ể u gen Ki ể u hình

Tri ệ u ch ứ ng lâm sàng và hóa sinh

Prader III-IV Na 137; K 4,5; Cl 106 mmol/l 17-OHP 27,7 ng/ml; testosterone 16,3 nmol/l

Prader III M ấ t mu ố i lúc 12 ngày tu ổ i (Na 116; K 6,32; Cl 86 mmol/l)

X ạ m da, m ất nướ c Na 121; K 5,7; Cl

102 mmol/l; 17-OHP 221,4 ng/ml; testosterone 13,9 nmol/l; progesterone 64,9 nmol/l

Prader II, không suy thượ ng th ậ n c ấ p

Na 131; K 4,3; Cl 100 17-OHP 28,8 nmol/l; testosterone 1,41 nmol/l

Prader I-II Na 131; K 4,6; Cl 100 mmol/l; tu ổ i xương bằ ng tu ổ i th ự c

Bú kém, không tăng cân sau đẻ , m ấ t nướ c, x ạ m da Na 109; K 8,9 mmol/l;

17-OHP 35,4 ng/ml; testosterone 3,1 nmol/l

Đột biến mới p.S125X tạo mã kết thúc sớm và đột biến lệch khung dịch mã p.V352RfsX103 kết hợp với đột biến nhóm “null” dẫn đến kiểu hình MM Đồng thời, đột biến vô nghĩa p.Y112X kết hợp với kiểu gen nhóm “B” gây ra kiểu hình NHĐT.

3.2.6 Ki ể u hình c ủ a nh ữ ng b ệ nh nhân có ki ể u gen g ồm hơn 2 độ t bi ế n

12/202 (5,9%) bệnh nhân có kiểu gen phức tạp Kiểu gen và kiểu hình (lâm sàng, hóa sinh) của các bệnh nhân này được trình bày tại bảng 3.8

Bảng 3.8 Kiểu gen và kiểu hình của bệnh nhân có kiểu gen phức tạp

STT Ki ể u gen Ki ể u hình

Ng ạ t n ặ ng, x ạ m da, Prader II Na 130,9; K 5,1; Cl 97,4 mmol/l

M ất nướ c, x ạ m da, âm v ậ t phì đạ i Na 122; K 5; Cl 100 mmol/l;

100 mmol/l; tu ổi xương bằ ng tu ổ i th ự c; 17-OHP 59 ng/ml

Prader III M ấ t mu ố i lúc 12 ngày tu ổ i (Na 116; K 6,32; Cl 86)

Prader IV tu ổi xương 13,5 tuổ i

Prader II-III Na 125; K 4,7; Cl

Prader IV Na 132; K 7,9; Cl 102 mmol/l); 17-OHP 6,8 ng/ml

Prader IV, x ạ m da, m ấ t mu ố i lúc

STT Ki ể u gen Ki ể u hình

M ất nướ c, Na 115; K 9,2; Cl 88 mmol/l; 17-OHP 39,7 ng/ml

Prader IV, mất nước, Na 106; K 5,4 mmol/l; 17-OHP 59,9 ng/ml

Prader IV, mất nước, 17-OHP 287,7 ng/ml

Nh ậ n xét: 9/12 có kiểu hình MM; 7/12 bệnh nhân đều mang đột biến p.Q318X và 5/12 bệnh nhân mang đột biến p.R356W

3.2.7 Ki ể u gen và ki ể u hình c ủ a các b ệ nh nhân thi ế u 21-OH có kh ố i u v ỏ thượ ng th ậ n

Trong nghiên cứu, 1,9% bệnh nhân (4/202) đã phát hiện đột biến gen CYP21A2 có liên quan đến u vỏ thượng thận trong quá trình theo dõi điều trị, hoặc đã được chẩn đoán u vỏ thượng thận trước khi có chẩn đoán TSTTBS Thông tin về kiểu gen và triệu chứng lâm sàng, hóa sinh của các bệnh nhân này được trình bày chi tiết tại bảng 3.9.

Bảng 3.9 Kiểu gen và kiểu hình của các bệnh nhân có u vỏthƣợng thận khi chẩn đoán hoặc xuất hiện u trong quá trình điều trị

Tu ổ i Tri ệ u ch ứ ng lâm sàng và hóa sinh

S uy thượ ng th ậ n c ấ p lúc ch ẩn đoán Na 120; K 7,1; Cl 98 mmol/l; 17-OHP 51 ng/ml; testosterone 35 nmol/l U v ỏ thượ ng th ậ n ph ả i 41 x 30 mm lúc 8,5 tu ổ i

Nhi ều cơn suy thượ ng th ậ n c ấ p, u v ỏ thượng thận phải 45x21 mm lúc 14,5 tuổi

17-OHP 299 ng/ml; testosterone 11,29 nmol/l Na 105; K 5,2; Cl 95 mmol/l

Prader IV, nhi ều cơn suy thượ ng th ậ n c ấ p t ừ 1 tháng tu ổ i 17-OHP 35,3 ng/ml; u v ỏ thượ ng th ậ n trái 31x58 mm phát hi ện năm

S uy thượ ng th ậ n c ấ p lúc 1 tháng tu ổ i, d ậ y thì s ớ m gi ả t ừ 5 tu ổ i (chi ều dài dương vậ t

7 cm, lông mu P3, th ể tích tinh hoàn 3 ml)

U thượng thận phải 24x17 mm Tuổi xương 13 tuổ i, testosterone 12,4nmol/l;

Khoảng 75% bệnh nhân mắc u vỏ thượng thận có kiểu gen đồng hợp tử, trong khi 25% còn lại có kiểu gen dị hợp tử kép Tất cả bệnh nhân đều thuộc nhóm “null” và có kiểu hình thể MM.

3.2.8 Ki ể u gen - ki ể u hình th ể c ổ điể n MM c ủ a các b ệnh nhân đượ c ch ẩ n đoán sớ m < 5 ngày tu ổ i khi chưa có triệ u ch ứ ng m ấ t mu ố i

14/202 (6,9%) bệnh nhân kiểu hình MM nhưng được chẩn đoán sớm <

Tất cả các bệnh nhân được sàng lọc lâm sàng và sàng lọc sơ sinh trong 5 ngày tuổi, cùng với tiền sử gia đình Ngay khi vào viện, họ đã được điều trị hormon thay thế theo chẩn đoán Tuy nhiên, trong quá trình theo dõi điều trị, một số bệnh nhân đã xuất hiện tình trạng mất muối và suy thượng thận cấp Thông tin chi tiết về nhóm kiểu gen, kiểu gen cụ thể và triệu chứng lâm sàng, hóa sinh của từng bệnh nhân được trình bày trong bảng 3.10.

Bảng 3.10 Kiểu gen và diễn biến lâm sàng của các bệnh nhân kiểu hình

MM đƣợc chẩn đoán sớm khi chƣa có suy thƣợng thận cấp

Tu ổ i Di ễ n bi ế n lâm sàng

Prader III; x ạm da, chưa có mất nướ c và mu ố i lúc ch ẩn đoán (Na 137; K 5,1; Cl 108 mmol/l) M ấ t mu ố i lúc 2 tu ầ n tu ổ i (Na 132; K 6,4; Cl 101 mmol/l); 17-OHP 147,7 ng/ml

Prader III Na 145; K 4,0; Cl 112; 17-OHP 22,2 ng/ml; testosterone 52 nmol/l; progesterone 190 nmol/l S ố t, s uy thượ ng th ậ n c ấ p lúc 13 tháng tu ổ i (Na 122; K 6,1; Cl 94 mmol/l)

Prader IV, x ạ m da, điề u tr ị t ừ ngày đầu sau đẻ ,

M ấ t mu ố i lúc 5 tháng tu ổ i (Na 122; K 6,9; Cl 92 mmol/l)

Bệnh nhân mắc hội chứng Prader II, có dấu hiệu xạm da nặng nhưng chưa mất nước và muối khi được chẩn đoán với chỉ số natri 144, kali 5,07 và clo 114 Nồng độ 17-OHP là 31,7 ng/ml và progesterone là 63,5 nmol/l Tình trạng suy thận cấp đã xuất hiện khi bệnh nhân 40 ngày tuổi, với chỉ số natri giảm xuống 109, kali tăng cao 6,8 và clo 86 mmol/l.

25 giờ Điều trị ngay sau đẻ; 17-OHP 9638 ng/ml; mất muối lúc 4 tháng tuổi (Na 128; K 4,9; Cl 97 mmol/l)

Prader III, da x ạm, chưa mất nướ c và mu ố i lúc ch ẩn đoán (Na 137; K 4,4; Cl 106) Mấ t mu ố i lúc

2 tu ầ n tu ổ i (Na 122; K > 5,5; Cl 90); 17-OHP 406,2 ng/ml; testosterone 52 nmol/l; progesterone

Prader III; 17-OHP 233,4 ng/ml; testosterone 78,54 nmol/l Suy thượng thận cấp lúc 16 tháng (Na 124; K 6,6; Cl 94 mmol/l)

Prader IV, xạm da 17-OHP 433,75 ng/ml; testosterone 60,7 nmol/l M ấ t mu ố i lúc 43 ngày tuổi (Na 129; K 5,2; Cl 97 mmol/l)

Prader III-IV, x ạ m da toàn thân, c hưa mấ t mu ố i lúc ch ẩn đoán (Na 140,2; K 5; Cl 110 mmol/l);

17-OHP 96,1 ng/ml M ấ t mu ố i lúc 2,5 tháng (Na 126; K 5,4; Cl 95 mmol/l)

Prader III, chưa mấ t mu ố i lúc ch ẩn đoán (Na 138;

K 4,51; Cl 103) 17-OHP 26,8 ng/ml M ấ t mu ố i lúc 12 ngày tu ổ i (Na 116; K 6,32; Cl 86 mmol/l)

Prader III, chưa mất nướ c và m ấ t mu ố i khi ch ẩ n đoán (Na 145; K 4,0; Cl 112 mmol/l); 17-OHP 79,7 ng/ml; testosterone 47,5 nmol/l; progesterone 190 nmol/l Suy thượ ng th ậ n c ấ p lúc

2 tu ầ n tu ổ i (Na 120; K 6,7; Cl 93 mmol/l)

Prader II, chưa có mấ t mu ố i khi ch ẩn đoán (N a 136; K 5,3; Cl 103 mmol/l); 17-OHP 961 ng/ml; testosterone 9,2 nmol/l M ấ t mu ố i lúc 1,5 và 3 tháng tu ổ i ( Na 127; K 5,7; Cl 96 mmol/l)

X ạ m da , chưa mấ t mu ố i khi ch ẩn đ oán (Na 134;

K 3,55; Cl 103); 17-OHP 20,9 ng/ml M ấ t mu ố i lúc 6 ngày tu ổ i (Na 124,3; K 3,5; Cl 94,7 mmol/l)

Prader IV; chưa m ấ t mu ố i khi ch ẩn đoán (Na 142;

K 4,8; Cl 108); 17-OHP 301 ng/ml; testosterone 24,2 nm ol/l Suy thượ ng th ậ n c ấ p lúc 3 tháng tu ổ i (nôn nhi ề u, m ất nướ c, Na 130; K 5,1; Cl 100 mmol/l)

Trong một nghiên cứu, tất cả 14 bệnh nhân có kiểu gen nhóm “null” và “A” đã được chẩn đoán và điều trị trước 5 ngày tuổi, mặc dù chưa xuất hiện triệu chứng mất muối Tuy nhiên, trong quá trình theo dõi điều trị, tất cả đều phát triển triệu chứng mất muối và suy thượng thận cấp.

3.2.9 Tương quan giữ a m ức độ n ặ ng nam hóa Prader v ớ i ki ể u gen

Mức độ nặng của nam hóa ở trẻ gái theo phân loại Prader của các nhóm kiểu gen khác nhau được trình bày ở biểu đồ 3.6

Prader I-II Prader III Prader IV-V

Biểu đồ 3.6 Tỷ lệ (%) của các mức độ nam hóa theo phân loại Prader của từng nhóm kiểu gen khác nhau

Nhóm kiểu gen nặng có tỷ lệ nam hóa Prader nặng cao hơn đáng kể (p = 0,0001) Trong đó, nhóm kiểu gen “null” ghi nhận tỷ lệ bệnh nhân nam hóa nặng (Prader IV-V và Prader III) cao nhất Đặc biệt, nhóm A có tỷ lệ nam hóa Prader III lên tới 68,2%, trong khi nhóm kiểu gen B có tỷ lệ nam hóa Prader I-II và III đều đạt 40%.

3.2.10 Tương quan giữ a m ức độ m ấ t mu ối và tăng kali vớ i ki ể u gen

Bảng 3.11 trình bày các giá trị trung bình, tối đa, tối thiểu, độ lệch và trung vị của nồng độ Na+, K+ và Cl- trong huyết thanh của các nhóm kiểu gen.

Bảng 3.11 Nồng độ điện giải đồ huyết thanh của các nhóm kiểu gen Điện giải đồ

Kiểu gen A Kiểu gen B Kiểu gen C

Ghi chú: giá trị tham chiếu Na + 134-143; K + 3,5-5,0; Cl - 97-110 mmol/l

Nh ậ n xét: Nồng độ Na + huyết thanh ở các bệnh nhân có kiểu gen nhóm

“null” thấp hơn so với nhóm B (p = 0,0001) và nhóm C (p = 0,001); của nhóm A thấp hơn nhóm B (p = 0,0001) và nhóm C (p = 0,003) (test

Nồng độ K + huyết thanh ở các bệnh nhân có kiểu gen nhóm “null” cao hơn so với nhóm B (p = 0,0001) và nhóm C (p = 0,002); của nhóm A cao hơn nhóm B (p = 0,0001) và nhóm C (p = 0,006) (test ANOVA)

BÀN LUẬN

Các độ t bi ế n và b ản đồ độ t bi ế n gen CYP21A2 ở các b ệ nh nhân nghiên

Biểu đồ 3.1 cho thấy phân bố tần suất theo các dạng đột biến của gen

CYP21A2 có nhiều dạng đột biến khác nhau, bao gồm xóa đoạn lớn (34,48%), đột biến sai nghĩa (27,34%), đột biến vô nghĩa (3,7%), intron/promoter (29,31%), lệch khung dịch mã (4,68%) và lặp đoạn (0,69%) Nghiên cứu trên 202 bệnh nhân TSTTBS từ 202 gia đình cho thấy sự đa dạng của các đột biến gây bệnh Kết quả này phù hợp với dữ liệu từ Human Gene Mutation Database (HGMD), cập nhật đến tháng 2 năm 2016, ghi nhận 285 đột biến của gen CYP21A2, trong đó 229 đã được báo cáo Phân bố các dạng đột biến chủ yếu là sai nghĩa/vô nghĩa với 152 đột biến.

Đột biến gen CYP21A2 được phân loại thành nhiều nhóm, bao gồm 12 đột biến loại đột biến nhỏ, 1 đột biến điều hòa, 16 đột biến mất đoạn nhỏ, 12 đột biến thêm đoạn nhỏ, 3 đột biến small indel, 9 đột biến xoá đoạn lớn, 3 đột biến thêm hoặc lặp đoạn lớn, và 21 đột biến phức tạp Những đột biến này phát sinh từ hoán vị nhỏ từ giả gen CYP21A1P hoặc do trao đổi chéo không cân xứng trên nhiễm sắc thể 6 Trong số các đột biến được phát hiện, nhóm phổ biến nhất là các đột biến xoá đoạn lớn (34,48%) và các đột biến điểm, trong đó 13 đột biến có nguồn gốc từ giả gen chiếm 58,85% Tỷ lệ gặp các đột biến phổ biến lần lượt là: I2g (28,57%), p.R356W (12,31%), p.I172N (10,59%), p.Q318X (2,95%), p.L307FfsX6 (2,21%), p.V281L (0,74%), và các hoán vị gen vùng promoter (g.-113G>A; g.-110T>C; g.-103A>G) (0,74%) Ngoài ra, còn có 7 đột biến hiếm gặp khác đã được báo cáo trong y văn.

Trong nghiên cứu của chúng tôi, gene CYP21A2 đã được phát hiện với một số đột biến như p.R426C (1,72%), p.R483PfsX58 (1,23%), p.E246GfsX11 (0,74%), p.M1I (0,25%), p.W19X (0,25%), p.H62L (0,25%) và c.1447_1448insC (p.R483PfsX40) (0,25%) Đặc biệt, chúng tôi cũng phát hiện 6 đột biến mới chưa từng được báo cáo trước đây ở gene CYP21A2 khi so sánh với các nguồn dữ liệu đột biến gene người như HGMD, uỷ ban danh pháp allele Cytochrome P450 và dữ liệu từ "1000 genomes" tại "MutationTaster".

Các đột biến mới được xác định bao gồm hai đột biến vô nghĩa p.S125X (0,25%) và p.I112X (0,25%), một đột biến lặp c.1375_1392dupCTGCCCTCCCTGCAGCCC (p.P459_L464dup) (0,49%), một đột biến thêm đoạn nhỏ c.del1054-1261insCGGCA (p.V352RfsX103) (0,25%), cùng với hai biến đổi chưa rõ hậu quả trên protein là p.T123I (0,49%) và p.P401L (0,25%) (bảng 3.2).

Tổng số các đột biến xóa đoạn lớn và đột biến điểm từ giả gen chiếm 93,33%, trong khi các đột biến hiếm tại CYP21A2 chỉ chiếm 6,67% (bảng 3.2) Kết quả này khẳng định rằng sự tái tổ hợp giữa CYP21A2 và CYP21A1P là nguyên nhân chính gây ra tình trạng thiếu hụt 21-hydroxylase.

Tỷ lệ phân bố các đột biến gen CYP21A2 trong nghiên cứu trên nhiều chủng tộc cho thấy sự nhất quán với các nghiên cứu trước đây Dữ liệu từ 3200 bệnh nhân TSTTBS cho thấy trong tổng số 6400 allele, có 340 allele (6%) chứa các đột biến hiếm.

Nghiên cứu của Wang R và cộng sự (2016) trên 230 bệnh nhân thiếu 21-OH người Trung Quốc cho thấy tổng cộng các allele đột biến điểm có nguồn gốc từ giả gen chiếm 67,6%, tỷ lệ này cao hơn so với nghiên cứu của chúng tôi (58,85%).

Các tác giả đã phát hiện 17 đột biến hiếm từ gen chức năng, chiếm 7,0%, tương đồng với nghiên cứu của chúng tôi (6,67%) De Carvalho DF và cộng sự (2016) ghi nhận tỷ lệ đột biến điểm cao hơn (86,7%) ở người Brazil khi nghiên cứu 856 allele đột biến, trong khi tỷ lệ xóa đoạn lớn chỉ chiếm 9% và các đột biến điểm hiếm chiếm 4,4% Sự khác biệt này có thể do trong nghiên cứu của họ, thể không cổ điển chiếm tỷ lệ lớn (206/480 bệnh nhân có kiểu hình thể không cổ điển) Nghiên cứu của Gidlof và cộng sự (2013) trên 800 allele đột biến của bệnh nhân thiếu 21- cũng cho thấy những kết quả đáng chú ý.

Nghiên cứu tại Thụy Điển cho thấy có 512 trong số 800 allele đột biến (chiếm 64%) có nguồn gốc từ giả gen Đồng thời, các tác giả cũng phát hiện 23 đột biến hiếm không xuất phát từ giả gen, trong đó 22/23 đột biến có tần suất allele rất thấp (< 0,5%) Những đột biến này xuất hiện ở 36 allele và chiếm 4,5% tổng số allele đột biến.

Vị trí của các đột biến trên bản đồ gen CYP21A2 (bảng 3.2 và hình 3.12) phát hiện được ở các bệnh nhân nghiên cứu phân bốở 8/10 exon (trừ exon 2 và

Trong nghiên cứu của chúng tôi về gen CYP21A2, đã phát hiện 15 đột biến điểm, bao gồm 3 đột biến ở vùng promoter, 1 đột biến tại intron 2, và 10 đột biến trong vùng mã hóa protein Cụ thể, có 3 đột biến ở exon 1, 3 đột biến mới ở exon 3, 1 đột biến ở exon 4, 3 đột biến ở exon 6 (cluster 6), 3 đột biến ở exon 7, 3 đột biến ở exon 8 (bao gồm 1 đột biến mới), 1 đột biến mới ở exon 9, và 4 đột biến ở exon 10 (trong đó có 1 đột biến mới) Các đột biến này phân tán ở hầu hết các exon và tập trung tại intron 2 cũng như vùng promoter Nhóm bệnh nhân nghiên cứu của chúng tôi đã phát hiện 13/15 đột biến có nguồn gốc từ giả gen được hoán vị sang gen chức năng.

Nghiên cứu của chúng tôi về phân bố vị trí các đột biến trên gen CYP21A2 tương đồng với nghiên cứu của Wang R và cộng sự (2016) trên 230 bệnh nhân TSTTBS người Trung Quốc Kết quả cho thấy các đột biến điểm ở vùng mã hóa của gen CYP21A2 phân bố chủ yếu trên hầu hết các exon, ngoại trừ exon 5 và 9.

Nghiên cứu của chúng tôi và của Wang cùng cộng sự cho thấy rằng với cỡ mẫu phân tích đủ lớn và tương tự, có thể khẳng định rằng đột biến tự phát sinh từ gen.

CYP21A2 hiếm xảy ra hơn ở exon 5 ở chủng tộc người Việt Nam và Trung

4.1.1 Độ t bi ế n xóa đoạ n l ớ n c ủ a gen CYP21A2 ở các b ệ nh nhân nghiên c ứ u

Bảng 3.2 trình bày các dạng đột biến, đặc biệt là các đột biến xóa đoạn lớn được phát hiện ở bệnh nhân nghiên cứu thông qua kỹ thuật MLPA Các dạng xóa đoạn bao gồm: mất toàn bộ gen (Del), exon 1 del, exon 1-2 del, exon 1-3 del, exon 1-6 del, exon 1-8 del, exon 4-6 del và exon 8 del Trong số này, xóa đoạn toàn bộ gen CYP21A2 chiếm tỷ lệ cao nhất với 25,37% các allele xóa đoạn lớn, tiếp theo là xóa đoạn từ exon 1-3 với tỷ lệ 5,67%.

Tổng tần suất các đột biến xóa đoạn lớn đạt 140, chiếm 34,48% tổng số đột biến Tỷ lệ cao nhất của đột biến xóa đoạn lớn trong nghiên cứu của chúng tôi tương đồng với nhiều nghiên cứu trên các chủng tộc khác nhau (bảng 4.1).

Chúng tôi đã xác định được 45 bệnh nhân có xóa đoạn đồng hợp tử, trong đó 2 bệnh nhân mang 2 allele đột biến xóa đoạn khác nhau (exon 1-6 del/exon 4-6 del) Cụ thể, 51 bệnh nhân có 1 allele xóa đoạn toàn bộ gen, trong khi allele còn lại là các đột biến điểm hoặc xóa đoạn nhỏ Xóa đoạn đơn độc của 1 exon rất hiếm gặp ở bệnh nhân TSTTBS Nghiên cứu của Wang R và cộng sự (2016) đã sử dụng kỹ thuật MLPA để phát hiện xóa đoạn exon 1-7 hoặc exon 1-8 của gen CYP21A2 ở 6 bệnh nhân Trung Quốc.

Ki ể u gen c ủ a các b ệ nh nhân thi ế u 21-OH

Bảng 3.3 cho thấy 55 kiểu gen khác nhau ở các bệnh nhân nghiên cứu và phổ biến nhất là các kiểu gen I2g/I2g (31/202; 15,35%), Del/Del (29/202;

Trong nghiên cứu này, tỷ lệ cao (49/55) các kiểu gen khác nhau có ít nhất một đột biến cho thấy sự hiện diện của xóa đoạn lớn và/hoặc đột biến điểm phổ biến từ giả gen Cụ thể, 37/55 kiểu gen có tất cả các allele đều là xóa đoạn lớn và/hoặc kết hợp với đột biến giả gen Kết quả chỉ ra sự đa dạng của kiểu gen ở bệnh nhân, phù hợp với nghiên cứu của New MI và cộng sự, trong đó ghi nhận tới 45 kiểu gen khác nhau với 9 đột biến phổ biến ở một hoặc cả hai allele, không phân biệt nguồn gốc từ bố hay mẹ.

Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy phân bố số lượng đột biến ở 202 bệnh nhân như sau: 102 bệnh nhân (50,5%) có kiểu gen đồng hợp tử, 74 bệnh nhân (36,7%) có kiểu gen dị hợp tử kép, 12 bệnh nhân (5,9%) có hơn hai đột biến, và 13 bệnh nhân (6,4%) chỉ phát hiện 1 đột biến dạng dị hợp tử mà không phát hiện allele đột biến kia Kết quả này không phù hợp với nghiên cứu của Finkielstain GP và cộng sự (2011), trong đó 79% các ca được xác định là dị hợp tử kép.

Nghiên cứu cho thấy tỷ lệ đột biến đồng hợp tử chiếm 43,1% và dị hợp tử kép chiếm 56,9% De Carvalho DF và cộng sự đã khảo sát 480 bệnh nhân tại Brazil, ghi nhận tỷ lệ kiểu gen dị hợp tử kép là 65,3% Chúng tôi giả thiết sự khác biệt này có thể do tỷ lệ cao các ca thể cổ điển MM trong nghiên cứu của mình, dẫn đến tỷ lệ cao các ca có đồng hợp tử đột biến xóa đoạn lớn Yếu tố chủng tộc cũng có thể ảnh hưởng đến sự khác biệt này Tỷ lệ cao các ca đồng hợp tử trong nghiên cứu của chúng tôi tương đồng với kết quả trên bệnh nhân người Hy Lạp, nơi có 66% bệnh nhân đồng hợp tử.

Trong nghiên cứu của chúng tôi, 102 trong số 202 bệnh nhân đồng hợp tử đã được xác định với 13 kiểu gen khác nhau Tỷ lệ cao nhất của các bệnh nhân mang đột biến đồng hợp tử thuộc về các kiểu gen I2g/I2g (31/102; 30,4%) và Del/Del (29/102).

Trong nghiên cứu, tỷ lệ gen đồng hợp tử cao nhất được ghi nhận là I2g/I2g với 35,5% (11/31) trong số 72 bệnh nhân Hàn Quốc, theo Choi và cộng sự Ngoài ra, các biến thể gen khác như exon 1-3 del (10,8%; 11/102), p.I172N (8,8%; 9/102) và p.R356W (6,4%; 13/202) cũng được ghi nhận, như thể hiện trong bảng 3.3.

Nghiên cứu của Wang R và cộng sự (2016) đã phát hiện 68 kiểu gen khác nhau ở 230 bệnh nhân thiếu 21-OH người Trung Quốc Trong số đó, các kiểu gen phổ biến nhất bao gồm I2g/I2g (11,7%), I2g/Del (12,1%) và I2g/p.I172N (9,1%).

Nghiên cứu cho thấy sự khác biệt về chủng tộc liên quan đến kiểu gen TSTTBS, với một số kiểu gen xuất hiện với tỷ lệ cao hơn ở các nhóm chủng tộc nhất định Cụ thể, kiểu gen I2g/I2g phổ biến hơn ở chủng tộc Trung Đông và cũng chiếm tỷ lệ cao trong nghiên cứu của chúng tôi, với 31 trong số 202 bệnh nhân, tương đương 15,35%.

Chúng tôi đã đề cập về sự phức tạp của việc phân tích đột biến gen

CYP21A2 là một gen quan trọng, với nghiên cứu của Wedell và cộng sự (1994) chỉ ra rằng các bệnh nhân có hơn hai đột biến thường do sự tồn tại của nhiều đột biến trên cùng một allele và sự hiện diện của nhiễm sắc thể mang nhiều trình tự CYP21A2 Trong nghiên cứu của chúng tôi, 12/202 (5,9%) bệnh nhân có kiểu gen với hơn 2 đột biến, trong đó 7/12 bệnh nhân mang đột biến p.Q318X và 5/12 có đột biến p.R356W Finkielstain GP và cộng sự (2010) phát hiện 5/182 bệnh nhân (2,7%) có lặp đoạn của CYP21A2, với đột biến p.Q318X được tìm thấy ở 4 trong 6 bố/mẹ của những bệnh nhân này Kleinle S và cộng sự (2009) cũng chỉ ra rằng đột biến nặng p.Q318X có liên quan đến các halotype lặp đoạn của gen CYP21A2.

Trong một nghiên cứu tại miền Nam nước Đức, 155 bệnh nhân đã phát hiện 2 đột biến trên cùng một allele xuất hiện ở 5 allele từ 4 bệnh nhân, trong đó có 3 allele với đột biến p.I172N+p.L307FfsX6, 1 allele với đột biến p.I172N+p.R356W, và 1 allele với đột biến p.V281L+p.R356W Nghiên cứu của Marino R và cộng sự (2011) trên 866 allele từ 454 bệnh nhân thiếu 21-OH đã phát hiện 35 allele đột biến (chiếm 4%) có hơn 1 đột biến gây bệnh Koppens PF và cộng sự (2002) cũng báo cáo về việc lặp đoạn CYP21A2 ở 6 trong số 365 nhiễm sắc thể Nghiên cứu của Gidlof S và cộng sự (2013) đã phân tích 800 allele đột biến ở các bệnh nhân thiếu.

Trong nghiên cứu của De Carvalho và cộng sự, 21-OH đã phát hiện 30/800 allele (3,8%) mang hơn 2 đột biến Allele phổ biến nhất là allele kết hợp 2 đột biến p.Q318X và p.R356W, chiếm 0,6% (5 allele) Ngoài ra, có 4 allele (0,5%) mang hai gen trên 1 nhiễm sắc thể với 2 đột biến I2g và p.Q318X Đặc biệt, có 2 allele chứa 8 đột biến khác nhau, trong đó có 3 đột biến của Cluster 6 Hơn nữa, 3 allele mang 6 đột biến khác nhau cũng bao gồm 3 đột biến của Cluster 6 Đáng chú ý, 17/30 (56,7%) allele phức tạp có hơn 2 đột biến mang đột biến p.Q318X và 8/30 (26,7%) allele phức tạp mang đột biến p.R356W.

Năm 2016, nghiên cứu cho thấy 6% trong số 856 allele đột biến của gen CYP21A2 mang ít nhất 2 hoặc nhiều hơn các đột biến điểm Dolzan V và cộng sự (2005) đã phát hiện tỷ lệ cao nhất lên đến 15,5% các allele có hơn hai đột biến ở bệnh nhân Slovania, trong đó nghiên cứu halotype được thực hiện để xác nhận sự phân ly của các đột biến trong gia đình.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi chưa xác định được tình trạng người lành mang gen (carrier) của tất cả các bố/mẹ của các bệnh nhân, do đó không thể khẳng định nguồn gốc các allele đột biến từ họ Nghiên cứu của Finkielstain GP và cộng sự (2011) cho thấy 2/213 bệnh nhân từ 182 gia đình có mang đột biến mới không có nguồn gốc từ bố/mẹ (de novo mutation) Bên cạnh đó, Speiser PW và cộng sự (2003) cũng nhận xét rằng đột biến mới của CYP21A2 (de novo germline mutation) chiếm khoảng 1-2% các allele đột biến gây thiếu 21-OH.

Marino R và cộng sự (2011) phát hiện đột biến mới (de novo mutation) ở 0,7% các allele đột biến [148]

Trong nghiên cứu này, chúng tôi chỉ phát hiện 1 đột biến ở 13 bệnh nhân, mặc dù đã thực hiện giải trình tự toàn bộ vùng mã hóa, vùng gắn nối exon-intron và promoter của gen CYP21A2 cùng với phân tích MLPA Tất cả 13 bệnh nhân đều có triệu chứng lâm sàng và hóa sinh điển hình của thiếu 21-OH.

Nghiên cứu của Krone và cộng sự (2000) trên 155 bệnh nhân cho thấy có 2 trường hợp chỉ phát hiện được 1 allele đột biến, trong đó một bệnh nhân có đột biến xóa đoạn lớn và một bệnh nhân khác có allele đột biến p.I172N Tất cả các bệnh nhân đều đáp ứng đầy đủ tiêu chuẩn lâm sàng và hóa sinh của tình trạng thiếu 21-OH trong hội chứng TSTTBS.

Mặc dù các tác giả đã tiến hành giải trình tự toàn bộ exon, intron và vùng promoter đến bp -450 của gen CYP21A2, nhưng chỉ phát hiện một allele đột biến duy nhất [57] Wilson RC và cộng sự (1995) cũng ghi nhận trường hợp tương tự trong một gia đình với chỉ một allele đột biến, mặc dù đã giải trình tự đến nucleotid -400 của vùng promoter [180] Nghiên cứu của Balraj P và cộng sự (2013) trên 97 bệnh nhân người Malay tại Malaysia cho thấy 6,2% (6/97) bệnh nhân chỉ có một allele đột biến, mặc dù đã áp dụng nhiều kỹ thuật như PCR-RFLP, giải trình tự, Southern blot và MLPA [154] Các nghiên cứu khác cũng chỉ ra tỷ lệ allele không phát hiện đột biến khác nhau, bao gồm 4,3% ở bệnh nhân Brazil [88], 11,9% ở Á Căn Đình [148], 0,9% ở Thổ Nhĩ Kỳ [171], 9,3% ở Tây Ban Nha [123] và 1,3% ở Đức [159].

Tương quan kiể u gen - ki ể u hình

4.3.1 Ki ể u hình c ủ a các b ệ nh nhân thi ế u 21-OH

Trong nghiên cứu này, kiểu hình của các bệnh nhân TSTTBS thiếu 21-

Trong một nghiên cứu về các kiểu hình bệnh nhân, 161 bệnh nhân có kiểu hình MM, 44 bệnh nhân kiểu hình NHĐT và chỉ 4 bệnh nhân kiểu hình không cổ điển, cho thấy tỷ lệ bệnh nhân không cổ điển là rất thấp Kết quả này tương đồng với các nghiên cứu trước đây ở nhiều chủng tộc châu Á như Trung Quốc và Hàn Quốc, nơi không ghi nhận bệnh nhân nào mắc thể không cổ điển trong số 72 bệnh nhân Hàn Quốc và 230 bệnh nhân Trung Quốc Nghiên cứu của Krone và cộng sự (2000) cho thấy trong 155 gia đình, thể cổ điển MM chiếm 59,4%, thể NHĐT 33,5% và thể không cổ điển chỉ 7,1% Ngược lại, ở các chủng tộc khác, tỷ lệ thể không cổ điển cao hơn nhiều, với 63,2% ở bệnh nhân Tây Ban Nha, 54,7% ở bệnh nhân Hy Lạp và 24,6% ở bệnh nhân Ý.

Nghiên cứu của De Carvalho và cộng sự (2016) cho thấy 42,9% bệnh nhân TSTTBS có kiểu hình thể không cổ điển, trong khi 57,1% thuộc thể cổ điển Tương tự, Marino R và cộng sự (2011) báo cáo rằng 47,8% bệnh nhân có kiểu hình không cổ điển và 52,2% thuộc thể cổ điển Dolzan V và cộng sự (2005) đã phân tích 348 bệnh nhân ở Trung Âu và phát hiện 63,5% có kiểu hình MM, 26,4% có kiểu hình NHĐT và 10,1% có kiểu hình không cổ điển Những kết quả này cho thấy sự đa dạng trong kiểu hình thể ở bệnh nhân TSTTBS.

Trong nghiên cứu tại Thụy Điển với 606 bệnh nhân thiếu 21-OH, thể cổ điển chiếm 75,4% (457/606), trong khi thể không cổ điển là 12,7% (77/606) và 11,9% (72/606) còn lại chưa rõ kiểu hình Trong số 457 bệnh nhân có kiểu hình thể cổ điển,

MM chiếm 61,1% trong số các thể cổ điển, với 279/457 trường hợp Sự khác biệt trong phân bố kiểu hình có thể liên quan đến yếu tố chủng tộc Ngoài ra, bệnh nhân mắc thể không cổ điển thường xuất hiện triệu chứng lâm sàng muộn và thường đến các cơ sở y tế người lớn thay vì các bệnh viện trẻ em để khám và điều trị.

4.3.2 Tương quan kiể u gen - ki ể u hình c ủ a thi ế u 21-OH ở các b ệ nh nhân nghiên c ứ u

Nghiên cứu của chúng tôi cung cấp dữ liệu phân tử lớn nhất về bệnh nhân Việt Nam mắc TSTTBS thiếu 21-OH, vượt trội so với các nghiên cứu toàn cầu Đặc biệt, nghiên cứu không chỉ cung cấp thông tin về các đột biến và tỷ lệ phân bố vị trí của chúng trên gen CYP21A2, mà còn đưa ra dữ liệu về tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình của bệnh nhân TSTTBS thiếu 21-OH.

Nghiên cứu cho thấy rằng kiểu gen của một số đột biến có thể dẫn đến các kiểu hình khác nhau Cụ thể, đột biến trên intron 2 (I2g) kết hợp với kiểu hình MM, trong khi một số bệnh nhân lại có kiểu hình NHĐT Đột biến I2g (g.655A/C>G) làm hoạt hóa vị trí đón nhận ở chiều ngược 3’ và gây ra sai lạc trong quá trình gắn nối Đôi khi, đột biến này kết hợp với thể NHĐT do quá trình gắn nối được sửa chữa ở một số lượng nhỏ trong quá trình dịch mã Một bệnh nhân có kiểu gen đồng hợp tử p.R356W/p.R356W cũng thể hiện kiểu hình NHĐT Ngược lại, đột biến trên exon 4 (p.I172N) thường gây ra kiểu hình NHĐT, nhưng trong nghiên cứu của chúng tôi, có hai bệnh nhân mang kiểu hình thể MM.

Trong nghiên cứu về bệnh nhân có kiểu hình thể MM, tỷ lệ các kiểu gen cao nhất được ghi nhận là Del/Del (18,9%), I2g/I2g (17,6%) và Del/I2g (14,4%) Ngược lại, ở nhóm bệnh nhân có kiểu hình thể NHĐT, kiểu gen phổ biến nhất là Del/p.I172N với tỷ lệ 23,8%.

Trong nghiên cứu của chúng tôi, kiểu gen phổ biến nhất của bệnh nhân mắc thể MM là I2g/I2g (23,6%), tiếp theo là Del/Del (19,1%) và Del/I2g (18,2%) Đối với thể NHĐT, kiểu gen phổ biến nhất là Del/p.I172N (28,3%), I2g/p.I172N (19,3%) và p.I172N/p.I172N (11,2%) Mặc dù cỡ mẫu cho thể không cổ điển chỉ có 4 bệnh nhân, nhưng 3 bệnh nhân có kiểu gen p.V281L/p.L307FfsX6, trong khi bệnh nhân còn lại có kiểu gen p.P30L+p.P459_L464dup/p.P459_L464dup Kết quả của chúng tôi phù hợp với các nghiên cứu trước đó trên số lượng lớn bệnh nhân, cho thấy sự tương quan giữa kiểu gen và kiểu hình trong các thể bệnh này.

Nghiên cứu phân tích trên silico cho thấy các đột biến điểm p.I172N và p.V281L có liên quan đến các kiểu hình khác nhau, cụ thể là thể NHĐT và thể không cổ điển Mô hình điện toán dự đoán rằng đột biến p.I172N trên exon 4 dẫn đến mất bao kỵ nước của enzym, gây ra bệnh thể NHĐT Các dự báo này đã được xác nhận thông qua nghiên cứu biểu hiện gen in vitro, cho thấy đột biến p.I172N làm giảm hoạt độ 21-OH chỉ còn 2% so với mức bình thường.

[65] Trong nghiên cứu của chúng tôi thì kiểu hình NHĐT xuất hiện ở 94,1%

Trong một nghiên cứu, 32/34 bệnh nhân có kiểu gen với ít nhất một allele đột biến p.I172N, trong đó 100% (17/17) bệnh nhân có đột biến p.I172N cùng với một đột biến khác thuộc nhóm nặng (nhóm “null”) Hai bệnh nhân (5,9%) có kiểu hình MM với kiểu gen p.I172N/p.I172N và I2g+p.I172N/p.I172N Triệu chứng lâm sàng và hóa sinh của hai bệnh nhân này được trình bày chi tiết trong bảng 3.6 (bệnh nhân thứ 4 và 5).

Tỷ lệ mang kiểu hình là NHĐT lại thấp hơn (76%) trong nghiên cứu của New

Nghiên cứu của MI và cộng sự trên 182 bệnh nhân cho thấy rằng có ít nhất một đột biến p.I172N, trong đó có tới 23% bệnh nhân mang đột biến này thể hiện kiểu hình đặc trưng.

MM chứng tỏ có thiếu hụt sản xuất aldosterone Các nghiên cứu khác trên những bệnh nhân người Đức [57], Hà Lan 58, Á Căn Đình [148], Hàn Quốc

Đột biến p.I172N không chỉ quy định kiểu hình NHĐT mà còn có thể dẫn đến kiểu hình MM, như đã chỉ ra bởi các nghiên cứu ở Mỹ Trong số 46 bệnh nhân mang ít nhất một allele đột biến p.I172N và một allele đột biến nặng, có đến 84,8% (39/46) bệnh nhân có kiểu hình NHĐT, trong khi 10,9% (5/46) có kiểu hình MM Đặc biệt, có 2 bệnh nhân với kiểu hình không cổ điển mang gen p.I172N/I2g và p.I172N/p.I172N Sự không phù hợp giữa kiểu gen và kiểu hình này có thể được giải thích bởi sự giảm biểu hiện của gen ở các enzym 21-OH đột biến, do những khác biệt tinh vi trong quá trình điều hòa phiên mã hoặc dịch mã của các protein khác.

Kiểu gen I2g với ít nhất 1 đột biến cho thấy 62/74 bệnh nhân (83,8%) có kiểu hình MM, trong khi 10/74 bệnh nhân (13,5%) có kiểu hình NHĐT Trong số 10 bệnh nhân NHĐT, 4 bệnh nhân mang kiểu gen I2g/p.I172N Nghiên cứu đa chủng tộc cho thấy 220/280 bệnh nhân (78,6%) mang ít nhất 1 allele đột biến I2g có kiểu hình MM, và 57/280 bệnh nhân (20,4%) có kiểu NHĐT Tỷ lệ bệnh nhân có kiểu gen với ít nhất 1 allele đột biến I2g và allele còn lại là đột biến nhóm “null” với kiểu hình NHĐT cũng được ghi nhận ở Mỹ (6/71; 8,5%), Hàn Quốc (1/26; 2,8%), và Trung Quốc (10/95; 10,5%) Trong nghiên cứu của chúng tôi, có 2/29 bệnh nhân đồng hợp tử I2g/I2g có kiểu hình NHĐT, tương tự như ghi nhận ở bệnh nhân người Mỹ da trắng (1/9 bệnh nhân).

Nghiên cứu của Marino R và cộng sự (2011) cho thấy hai anh em ruột mang cùng kiểu gen I2g/I2g nhưng có kiểu hình khác nhau, một người là MM và người kia là NHĐT Cơ chế dẫn đến sự khác biệt về kiểu hình lâm sàng đối với một đột biến đơn lẻ vẫn chưa được làm rõ Có thể một tỷ lệ nhỏ bệnh nhân sản xuất được một lượng enzym nhỏ nhờ các gắn nối bình thường, từ đó giúp làm giảm mức độ nghiêm trọng của triệu chứng lâm sàng.

Một trong những kiểu gen phổ biến trong nghiên cứu của chúng tôi là các bệnh nhân có ít nhất một đột biến nặng phổ biến p.R356W (35/202;

Đột biến gen p.R356W gây ra thể lâm sàng MM ở hầu hết bệnh nhân (88,6%) Trong số đó, một số bệnh nhân có kiểu hình NHĐT, bao gồm hai bệnh nhân với đột biến p.I172N và một bệnh nhân với đột biến mới p.P401L Đặc biệt, có một bệnh nhân nam chẩn đoán lúc 4,5 tuổi với kiểu gen đồng hợp tử p.R356W/p.R356W, biểu hiện triệu chứng dậy thì sớm giả và mức 17-OHP cao 725 ng/ml Nghiên cứu của Wang R và cộng sự (2016) cũng ghi nhận một bệnh nhân nữ với kiểu gen đồng hợp tử p.R356W nhưng có kiểu hình NHĐT Đột biến p.R356W làm phá vỡ liên kết H-bonding với axit amin glutamine tại vị trí 389, dẫn đến xung đột cấu trúc không gian và thay đổi cấu trúc ba chiều của enzym, làm giảm hoạt độ enzym và ảnh hưởng đến liên kết HEME.

T ổ ng h ợp steroid trong trườ ng h ợ p thi ế u 21-OH

Enzym 21-OH thượng thận, hay còn gọi là P450c21, đóng vai trò quan trọng trong việc tổng hợp aldosterone và cortisol Tuyến thượng thận cũng có khả năng sản xuất một lượng nhỏ testosterone nhờ vào tác động của 17β-HSD.

B) trong trường hợp thiếu hoạt độ 21-OH của P450c21 thì có ba con đường dẫn đến tổng hợp androgen: i/ con đường từ cholesterol đến DHEA vẫn còn hoạt động, tăng sản xuất DHEA sẽ dẫn đến một lượng DHEA bị chuyển thành testosterone và dihydrotestosterone (DHT) ii/ lượng lớn 17- OHP được sản xuất ởthượng thận bệnh nhân TSTTBS sẽ cho phép một lượng 17-OHP chuyển thành androstenedione và sau đó thành testosterone iii/ con đường phụ thuộc vào 5α và 3α reduction của 17-OHP thành 17OH- allopregnanolone Steroid này dễ dàng được chuyển thành androstanediol, mà sau đó có thể bị oxy hóa thành DHT bởi enzym 3α-HSD [11]

Hình 1.2 Các phản ứng xúc tác bởi P45021A2 (21-hydroxylase) [19]

Bảng 1.1 Các thể bệnh TSTTBS và thiếu hụt tổng hợp cortisol do thiếu enzym vỏthƣợng thận [3]

G ặ p nhi ều hơn ở Ashkenazi Jews, và Yupik Eskimos

Suy thượ ng th ậ n ở th ể c ổ điể n, nam hóa ở các m ức độ khác nhau

1:100 000 ở ch ủ ng t ộ c da tr ắ ng; 1:7000 ở Moroccan Jews

Tăng huyế t áp ở h ầ u h ế t các b ệ nh nhân; h ạ kali máu; nam hóa

Hi ế m M ất nướ c, h ạ natri máu và tăng kali máu.

46,XX: nam hóa 46,XY: nam hóa kém

Pregnenolone, 17OH- pregnenolone, DHEA, DHEAS 17-hydroxylase/

1:50 000 toàn th ế gi ớ i, ph ổ bi ế n hơn ở Bra-xin và châu Á

Cao huy ế t áp, h ạ kali máu, thi ểu năng sinh d ụ c 46,XX; 46,XY: nam hóa kém, tinh hoàn trong ổ b ụ ng

Steroidogenic acute regulatory protein (StAR)

Hi ế m, ph ổ bi ế n hơn ở Nh ậ t B ả n, Palestine, Hàn Qu ố c

Suy thượ ng th ậ n, thượ ng th ận phì đạ i, thượ ng th ậ n b ị thâm nhi ễ m lipid, c ả hai gi ớ i có b ộ ph ậ n sinh d ụ c ngoài gi ố ng n ữ

Cholesterol side- chain cleavage enzym (P450scc)

Hi ế m Suy thượ ng th ậ n, có th ể không có tuy ế n thượ ng th ậ n

Gi ả m th ể tích tu ầ n hoàn, dị tật xương (Antley-Bixler); nam

M ức độ cao khác nhau, thiếu hụt m ộ t ph ầ n nhi ề u

46,XX: nam hóa nh ẹ đế n trung bình

46,XY: nam hóa kém steroid

DOC, 11-deoxycorticosterone; AD, androstenedione; T, testosterone; DHEA, dehydroepiandrosterone; DHEAS, DHEA sulfate; LH, luteinizing hormone; FSH, follicle stimulating hormone

Trong bào thai học, thai nhi gái bình thường không có hormon kháng thể Muller (AMH), dẫn đến sự phát triển bình thường của cấu trúc Muller thành vòi trứng, tử cung, cổ tử cung và 2/3 trên của âm đạo Thiếu mô tinh hoàn và androgen khiến cấu trúc Wolffian thoái triển, trong khi buồng trứng vẫn ở vị trí tiểu khung Trong trường hợp thiếu 21-OH, thai nhi gái vẫn không có AMH, giữ nguyên sự phát triển của cấu trúc Muller và buồng trứng ở vị trí tiểu khung Testosterone có thể tăng lên từ nguồn androgen của thượng thận, không phải từ tế bào Leydig của tinh hoàn Sự tích tụ tiền chất steroid do thiếu hụt enzym 21-OH sẽ chuyển hướng sang tổng hợp testosterone, với mức độ rối loạn enzym quy định mức độ tổng hợp này Nồng độ testosterone cao trong tuần hoàn có thể dẫn đến nam hóa bộ phận sinh dục ngoài ở thai nhi gái, với mức độ khác nhau từ I đến V theo phân loại của Prader.

1.3 Kiểu hình lâm sàng và tỷ lệ mới mắc của TSTTBS do thiếu 21-OH

1.3.1 Ki ể u hình lâm sàng c ủ a TSTTBS do thi ế u 21-OH

Mức độ nặng của triệu chứng lâm sàng phụ thuộc vào hoạt độ 21-OH còn lại, với các biểu hiện kiểu hình đôi khi khó phân biệt Bệnh được chia thành hai thể chính: thể cổ điển (nặng) và thể không cổ điển (nhẹ) Trong thể cổ điển, có hai dạng chính là thể cổ điển mất muối (MM) và nam hóa đơn thuần (NHĐT), phản ánh mức độ thiếu hụt aldosterone Đáng chú ý, thể cổ điển mất muối chiếm đến 75% các ca mắc thể cổ điển.

Thiếu hụt hoàn toàn hoạt độ enzym 21-hydroxyase gây nguy hiểm đến tính mạng, dẫn đến mất nước và hạ natri máu Trẻ gái mắc thể nặng có biểu hiện nam hoá bộ phận sinh dục từ thời kỳ bào thai do tiếp xúc với nồng độ androgen cao Đây là nguyên nhân phổ biến nhất gây mơ hồ giới tính ở trẻ sơ sinh, với các triệu chứng như âm vật phì đại và hai môi lớn dính liền Trẻ trai mắc thể cổ điển thường không có triệu chứng khi sinh, ngoại trừ xạm da và dương vật có thể lớn hơn bình thường Tuổi chẩn đoán ở trẻ trai thể cổ điển thường muộn hơn.

MM có nhiều mức độ khác nhau tùy thuộc vào mức độ thiếu hụt aldosterone Trẻ trai mắc thể cổ điển thường biểu hiện triệu chứng từ 7 - 14 ngày sau sinh, bao gồm nôn, sụt cân, li bì, mất nước, hạ natri, tăng kali huyết thanh và có thể dẫn đến sốc Trẻ gái mắc thể cổ điển nếu không được điều trị kịp thời có thể gặp triệu chứng suy thượng thận cấp và mất muối trong giai đoạn sơ sinh Mơ hồ giới tính khi sinh là yếu tố quan trọng giúp chẩn đoán và điều trị sớm Trẻ trai mắc thể cổ điển NHĐT (không mất muối) có triệu chứng nam hóa và dậy thì sớm ngoại biên từ 2 tuổi.

Thể không cổ điển của tăng androgen thường biểu hiện với mức độ khác nhau sau năm đầu đời, mặc dù không cần điều trị để duy trì sự sống Cortisol và aldosterone được sản xuất bởi vỏ thượng thận giúp ngăn ngừa các triệu chứng lâm sàng nghiêm trọng Tuy nhiên, sự sản xuất cortisol không đủ để ức chế ACTH, dẫn đến việc tổng hợp androgen tăng cao trong máu Trẻ sơ sinh mắc thể không cổ điển có bộ phận sinh dục bình thường và nồng độ 17-OHP trong giới hạn bình thường Triệu chứng ở trẻ em có thể bao gồm lông mu sớm, trứng cá, tăng chiều cao nhanh và tuổi xương phát triển sớm, có thể dẫn đến chiều cao cuối cùng thấp Ở tuổi trưởng thành, các triệu chứng muộn hơn như rậm lông, rối loạn kinh nguyệt, trứng cá và vô sinh xuất hiện do tăng androgen Ở nam giới, triệu chứng có thể kín đáo hơn, thường chỉ là trứng cá hoặc khó khăn trong sinh sản.

Tiêu chuẩn phân loại kiểu hình dựa trên triệu chứng lâm sàng và xét nghiệm hormon cho thấy nam hóa bộ phận sinh dục ngoài ở trẻ gái được đánh giá theo mức độ Prader để chẩn đoán thể cổ điển, bao gồm thể MM và NHĐT Ở thể cổ điển MM, bệnh nhân có hoạt độ 21-OH < 2% và có biểu hiện sụt cân, chậm tăng cân, nôn, và dấu hiệu mất nước, với khuyến cáo phân loại bệnh nhân khi Na+ huyết thanh < 130 mmol/l hoặc 130-135 mmol/l kết hợp với K+ > 5,5 mmol/l Thể NHĐT có hoạt độ enzym tăng 1-2% so với thể cổ điển MM, bao gồm dậy thì sớm giả và tăng trưởng chiều cao Thể không cổ điển được định nghĩa ở trẻ gái không có nam hóa bộ phận sinh dục ngoài lúc sinh hoặc nam hóa nhẹ, với lông mu và lông nách sớm ở cả hai giới Nồng độ 17-OHP, được xác định ở điều kiện cơ sở và sau kích thích ACTH, là tiêu chuẩn bổ sung cho chẩn đoán và được sử dụng như dấu ấn sinh học để theo dõi điều trị TSTTBS thiếu 21-OH, với phương pháp phân tích bằng kỹ thuật miễn dịch phóng xạ và miễn dịch huỳnh quang.

Bảng 1.2 Biểu hiện lâm sàng của bệnh nhân TSTTBS thiếu 21-OH [28]

Biểu hiện lâm sàng Thể bệnh thiếu 21-OH

Thể cổđiển Thể không cổđiển

Nam hóa trước sinh Biểu hiện ở trẻ gái Không có Nam hóa sau sinh Cả trẻ gái và trẻ trai Mức độ khác nhau

Mất muối 75% các ca Không

Thiếu cortisol 100% các ca Hiếm

TSTTBS do thiếu 21-OH là một trong những bệnh di truyền đơn gen phổ biến, với tỷ lệ mới mắc khoảng 1:15.000 trẻ đẻ sống, dựa trên dữ liệu sàng lọc sơ sinh từ 6,5 triệu trẻ ở 13 quốc gia Tỷ lệ người lành mang gen của thể cổ điển ước tính là 1:60, và tỷ lệ mới mắc có sự khác biệt theo chủng tộc và vùng địa lý Các thể nhẹ hơn và thể không cổ điển phổ biến hơn, với tỷ lệ khoảng 1:500 - 1:1000 ở các chủng tộc khác nhau Nghiên cứu tại New York cho thấy thể không cổ điển phổ biến hơn ở một số nhóm như người gốc Do Thái Đông Âu, người gốc La Tinh và gốc Nam Tư, với tỷ lệ từ 1,0 - 3,7%.

1.4 Cơ sở di truyền phân tử của bệnh TSTTBS do thiếu 21-OH

1.4.1 Gen CYP21A2 và c ấ u trúc RCCX (RP-C4-CYP21-TNX)

Thiếu hụt 21-OH là do các đột biến trong gen CYP21A2, trước đây được gọi là gen CYP21 hoặc CYP21B (GeneID 1589, GenBank NC_000006.10) Gen này nằm trong vùng HLA class III của phức hợp hòa hợp mô chủ yếu (MHC) trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể 6 (6p21.3), cùng với các giả gen liên quan.

CYP21A1P, trước đây được gọi là CYP21P hoặc CYP21A, có sự tương đồng lớn với gen chức năng Hai gen này cách nhau khoảng 30 kb, đều có 10 exon và kích thước 3,4 kb, với trình tự giống nhau đến 98% ở các exon và khoảng 96% ở các intron Tuy nhiên, CYP21A1P là gen không hoạt động do chứa một số đột biến gây mất chức năng Đơn vị C4/CYP21 nằm xen kẽ với gen này.

Gen RP (serine threonine nuclear protein kinase) nằm ở phía telomer, trong khi gen TNX nằm gần centromere, tạo thành module RCCX (RP-C4-CYP21-TNX) RP1 mã hóa cho protein nhân tương tự chuỗi xoắn DNA với chức năng chưa rõ, được gọi là serine-threonine kinase 19 (STK19) RP2 là dạng cắt ngắn không có chức năng như RP1 TNXB mã hóa cho protein đệm ngoại bào tenascin X, nằm cạnh gen CYP21A2, trong khi gen TNXA là bản sao bị cắt cụt của TNXB và nằm cạnh CYP21A1P ở phía đối diện Hầu hết haplotype có dạng bimodular với hai bộ bốn gen được sắp xếp theo thứ tự: RP1 - C4A - CYP21A1P - TNXA - RP2 - C4B - CYP21A2 - TNXB Số lượng module có thể thay đổi từ 1 đến 4.

Khoảng 70% người da trắng có cấu trúc di truyền với hai module, bao gồm một module chứa gen CYP21A2 và một module chứa gen CYP21A1P Cấu trúc ba module chiếm 14% các nhiễm sắc thể, với hầu hết trường hợp mang hai bản sao của CYP21A1P và một bản sao của CYP21A2, mặc dù cũng có trường hợp ngược lại Haplotype RCCX với nhiều hơn một gen CYP21A2 đã được ghi nhận ở các chủng tộc khác nhau, như 12,5% ở chủng tộc da trắng Tunisia, 7% ở Tây Ban Nha, dưới 2% ở Thụy Điển, 13,2% ở Áo, và 1% ở Hà Lan.

Trung Quốc 2,5% (trong số 200 nhiễm sắc thể) [35],[36],[37],[38],[39]

Theo dữ liệu từ ngân hàng gen GeneBank (AF019413 và AL049547), chiều dài của trình tự bimodule trong vùng RCCX khoảng 120 kb Gen CYP21A2 chịu trách nhiệm mã hóa cho protein có 494 acid amin và trọng lượng phân tử đạt 55 Kilo Dalton (kDa).

Hình 1.3 Vùng nhiễm sắc thể 6p21.3 bao gồm gen CYP21A2 của cấu trúc

1.4.2 L ị ch s ử nghiên c ứ u v ề di truy ề n phân t ử c ủ a b ệ nh TSTTBS trên th ế gi ớ i

Năm 1986, White và cộng sự đã nghiên cứu về cloning và biểu hiện gen, phát hiện cDNA tương ứng với 21-OH dài 2 kb, với protein sản phẩm của gen ước tính có 494 acid amin và trọng lượng phân tử 55.000 Dalton Enzym này cho thấy tính đồng nhất cao (28%) so với các enzym cytochrome P450 khác đã được nghiên cứu Cùng năm, Higachi và cộng sự đã phân tích cấu trúc gen, chỉ ra rằng gen mã hóa cho 21-OH bao gồm 10 exon, trong khi các gen mã hóa cho enzym P450 khác có cấu trúc khác biệt.

7, 8 hoặc 9 exon Gen bất hoạt A có đột biến 8 bp (base pair) ở vị trí mã hóa

110 và 112 gây nên lệch khung dịch mã và ngừng phiên mã tại vị trí 130 Hai gen P450C21 có 9 intron và có chiều dài khoảng 3,4 kb [41]

Tiêu đề	Nghiên cứu các dạng đột biến gen gây bệnh tăng sản thượng thận bẩm sinh thiếu 21 hydroxylase
Tác giả	Vũ Chí Dũng
Người hướng dẫn	Giáo sư. Tiến sĩ. Tạ Thành Văn, Giáo sư. Tiến sĩ. Nguyễn Thanh Liêm
Trường học	Trường Đại học Y Hà Nội
Chuyên ngành	Nhi
Thể loại	Luận án
Năm xuất bản	2017
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	184
Dung lượng	3,33 MB