TC VN

TC VN Công ty luật Minh Khuê www luatminhkhue vn TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 11395 2016 ISO/TS 17919 2013 VI SINH VẬT TRONG CHUỖI THỰC PHẨM PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR) ĐỂ PHÁT HIỆN VI SINH VẬT GÂY BỆ[.]

Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 11395:2016 ISO/TS 17919:2013 VI SINH VẬT TRONG CHUỖI THỰC PHẨM - PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR) ĐỂ PHÁT HIỆN VI SINH VẬT GÂY BỆNH TỪ THỰC PHẨM - PHÁT HIỆN CLOSTRIDIA SINH ĐỘC TỐ THẦN KINH BOTULINUM TYP A, B, E VÀ F Microbiology of the food chain - Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens - Detection of botulinum type A, B, E and F neurotoxin-producing clostridia Lời nói đầu TCVN 11395:2016 hồn tồn tương đương với ISO/TS 17919:2013; TCVN 11395:2016 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn quốc gia TCVN/TC/F13 Phương pháp phân tích lấy mẫu biên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố VI SINH VẬT TRONG CHUỖI THỰC PHẨM - PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR) ĐỂ PHÁT HIỆN VI SINH VẬT GÂY BỆNH TỪ THỰC PHẨM - PHÁT HIỆN CLOSTRIDIA SINH ĐỘC TỐ THẦN KINH BOTULINUM TYP A, B, E VÀ F Microbiology of the food chain - Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of foodborne pathogens - Detection of botulinum type A, B, E and F neurotoxin-producing clostridia Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp sinh học phân tử phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát clostridia mang gen độc tố thần kinh botulinum A, B, E F Phương pháp phát typ gen không phát độc tố, cho kết dương tính khơng có nghĩa độc tố có mặt mẫu kiểm tra Tiêu chuẩn áp dụng cho sản phẩm thực phẩm, thức ăn chăn nuôi mẫu môi trường Các phép thử PCR để phát trình tự gen mã hóa typ độc tố cụ thể nêu Phụ lục B Phụ lục E Tài liệu viện dẫn Các tài liệu viện dẫn sau cần thiết cho việc áp dụng tiêu chuẩn Đối với tài liệu viện dẫn ghi năm cơng bố áp dụng phiên nêu Đối với tài liệu viện dẫn khơng ghi năm cơng bố áp dụng phiên nhất, bao gồm sửa đổi, bổ sung (nếu có) TCVN 6404 (ISO 7218) Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Yêu cầu chung hướng dẫn kiểm tra vi sinh vật TCVN 6507-1 (ISO 6887-1) Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Chuẩn bị mẫu thử, huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng thập phân để kiểm tra vi sinh vật - Phần 1: Các nguyên tắc chung để chuẩn bị huyền phù ban đầu dung dịch pha loãng thập phân TCVN 8128 (ISO 11133), Vi sinh vật thực phẩm, thức ăn chăn nuôi nước - Chuẩn bị, sản xuất, bảo quản kiểm tra hiệu môi trường nuôi cấy TCVN 7682 (ISO 20838) Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Yêu cầu khuếch đại phát phương pháp định tính TCVN 11134 (ISO 22174), Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Định nghĩa yêu cầu chung ISO 20837, Microbiology of food and animal feeding stuffs - Polymerase chain reaction (PCR) for the detection of food-borne pathogens - Requirements for sample preparation for qualitative detection [Vi sinh vật thực phẩm thức ăn chăn nuôi - Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) để phát vi sinh vật gây bệnh từ thực phẩm - Yêu cầu chuẩn bị mẫu để phát định tính] Thuật ngữ định nghĩa Trong tiêu chuẩn sử dụng thuật ngữ định nghĩa nêu TCVN 11134 (ISO 22174) LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn Ký hiệu chữ viết tắt 4.1 Ký hiệu c nồng độ chất;  nồng độ khối lượng;  phần thể tích; w phần khối lượng 4.2 Chữ viết tắt BoNT độc tố thần kinh botulinum Nguyên tắc 5.1 Yêu cầu chung Phương pháp bao gồm bước sau đây: a) tăng sinh vi khuẩn (xem 5.2); b) tách chiết axit nucleic (xem 5.3); c) khuếch đại (xem 5.4); d) phát sản phẩm PCR (xem 5.5); e) khẳng định (xem 5.6) CHÚ THÍCH: Real-time PCR kết hợp bước từ c) đến e) 5.2 Tăng sinh vi khuẩn Số lượng BoTN clostridia (bào tử tế bào sinh dưỡng) cần phát tăng lên cách kích thích nẩy mầm cho phát triển môi trường dinh dưỡng lỏng không chọn lọc (canh thang dịch chiết nấm men trypton-peptose-glucose) điều kiện kỵ khí 5.3 Tách chiết axit nucleic Tế bào sinh dưỡng tách khỏi môi trường dinh dưỡng, dung giải axit nucleic tách chiết để sử dụng phản ứng PCR 5.4 Khuếch đại PCR Axit nucleic chiết chuyển vào hỗn hợp PCR khuếch đại máy chu trình nhiệt 5.5 Phát sản phẩm PCR Các sản phẩm PCR phát điện di gel phương pháp thay thích hợp 5.6 Khẳng định Việc nhận biết sản phẩm PCR cần khẳng định phương pháp thích hợp, ví dụ: phân tích trình tự, lai phân tích giới hạn Thuốc thử 6.1 Yêu cầu chung Đối với tất bước từ b) đến e) 5.1, sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích thích hợp cho ứng dụng sinh học phân tử quy định ISO 20837 TCVN 7682 (ISO 20838) Áp dụng yêu cầu thuốc thử quy định Điều TCVN 7682 (ISO 20838) 6.2 Môi trường nuôi cấy 6.2.1 Yêu cầu chung Thực theo TCVN 8128 (ISO 11133) việc chuẩn bị, sản xuất thử hiệu môi trường nuôi cấy 6.2.2 Dịch pha loãng Thực theo TCVN 6507-1 (ISO 6887-1) phần có liên quan TCVN 6507 (ISO 6887) sản phẩm cần phân tích 6.2.3 Mơi trường ni cấy tăng sinh không chọn lọc, canh thang dịch chiết nấm men trypton- LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn pepton-glucose (canh thang TPGY) (xem Tài liệu tham khảo [7]) 6.2.3.1 u cầu chung Có thể sử dụng mơi trường ni cấy tăng sinh không chọn lọc công nhận cho hiệu tương đương 6.2.3.2 Thành phần độ pH Trypton 50 g Pepton 5g Chất chiết nấm men 20 g D-Glucose 4g Natri thioglycolat, HSCH2COONa 1g Nước đến 1000 ml pH 7,0 ± 0,2 6.2.3.3 Chuẩn bị Hòa tan thành phần nước cách đun sôi Sau khử trùng, chỉnh pH đến 7,0 ± 0,2 25 °C Phân phối môi trường vào bình lọ có dung tích thích hợp Khử trùng 15 121 °C Bảo quản tủ lạnh °C ± °C Không sử dụng môi trường sau chuẩn bị tuần 6.2.4 Canh thang đệm TPGY để dùng cho thực phẩm axit axit hóa 6.2.4.1 Dung dịch gốc (đệm phosphat) 6.2.4.1.1 Dung dịch Natri dihydro phosphat ngậm phân tử nước [NaH2PO4.H2O] 138 g Nước đến 1000 ml 6.2.4.1.2 Dung dịch Dinatri hydro phosphat [Na2HPO4] 142 g Nước đến 1000 ml 6.2.4.1.3 Chuẩn bị Hòa tan thành phần nước cách đun sôi Cho dung dịch vào 250 ml dung dịch pH đạt 7,2 Bảo quản tủ lạnh °C ± °C 6.2.4.2 Chuẩn bị mơi trường hồn chỉnh Hòa tan thành phần (6.2.3.2) 500 ml nước cách đun sôi Thêm 100 ml dung dịch đệm phosphat (6.2.4.1) Nồng độ phosphat cuối mơi trường hồn chỉnh 0,1 mol/l Thêm nước đến 1000 ml Phân phối mơi trường hồn chỉnh vào bình lọ có dung tích thích hợp Phân phối mơi trường vào bình lọ có dung tích thích hợp Khử trùng 15 121 °C Bảo quản tủ lạnh °C ± °C Không sử dụng môi trường sau chuẩn bị tuần 6.3 Chiết axit nucleic 6.3.1 Cloroform, CHCl3 6.3.2 Etanol, (C2H5OH) = 96 % 6.3.3 Muối dinatri axit etylendiamintertra axetic (Na 2EDTA), C10H14N2O8Na2 6.3.4 Hexadecyl (trimetyl) amoni bromua [(cetyl(trimetyl) amoni bromua, CTAB], C19H42BrN 6.3.5 Axit clohydric, (HCl) = 37 % 6.3.6 Isopropanol, CH3CH(OH)CH3 6.3.7 Proteinase-K, khoảng 20 đơn vị/mg đông khô 6.3.8 Natri clorua, NaCl 6.3.9 Natri hydroxit, NaOH 6.3.10 Tris(hydroxymetyl)aminometan (tris), C4H11NO3 LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn 6.3.11 Dung dịch đệm chiết CTAB, (CTAB) = 20 g/l, c(NaCl) = 1,4 mol/l, c(tris) = 0,1 mol/l, c(Na2EDTA) = 0,02 mol/l Chỉnh pH đến 8,0 HCl NaOH 6.3.12 Dung dịch đệm kết tủa CTAB, (CTAB) = g/l, c(NaCl) = 0,04 mol/l 6.3.13 Dung dịch natri clorua, c(NaCl) = 1,2 mol/l 6.3.14 Dung dịch etanol, (C2H5OH) = 70 % 6.3.15 Dung dịch proteinase-K,  = 20 mg/ml, hịa tan nước vơ trùng Không hấp áp lực Bảo quản - 20 °C, không tái cấp đông rã đông 6.3.16 Dung dịch đệm Tris-EDTA (TE), c(tris) = 0,01 mol/l, c(Na2EDTA) = 0,001 mol/l Chỉnh pH đến 8,0 HCl NaOH 6.4 Thuốc thử dùng cho PCR 6.4.1 ADN polymerase bền nhiệt, theo quy định TCVN 7682 (ISO 20838) TCVN 11134 (ISO 22174) 6.4.2 Deoxyribonucleosid triphosphat (dNTP) chứa dATP, dCTP, dGTP dTTP dUTP quy định TCVN 7682 (ISO 20838) TCVN 11134 (ISO 22174) 6.4.3 Dung dịch đệm PCR, theo quy định TCVN 7682 (ISO 20838) TCVN 11134 (ISO 22174) Thông thường dung dịch đệm PCR cung cấp với ADN polymerase, có khơng có MgCl2 nồng độ nhà sản xuất quy định Nồng độ MgCl2 cuối quy định theo phương pháp cụ thể nêu phụ lục Cũng dùng thuốc thử có bán sẵn Nếu khơng, tn theo hướng dẫn nhà sản xuất 6.4.4 Mồi đầu dò Các mồi đầu dò để phát đặc hiệu trình tự gen độc tố thần kinh nêu Phụ lục B Phụ lục C Thiết bị, dụng cụ 7.1 Yêu cầu chung Sử dụng thiết bị, dụng cụ thơng thường phịng thử nghiệm vi sinh [xem TCVN 6404 (ISO 7218)] cụ thể sau: 7.2 Dụng cụ để chuẩn bị mẫu trước tăng sinh 7.2.1 Nồi cách thủy, trì 50 °C ± °C 7.2.2 Máy ly tâm, để ly tâm ống nghiệm 50 ml 100 ml, thay đổi gia tốc đến 12 000 x g 7.2.3 Bộ lọc màng, có màng nitrocellulose, cỡ lỗ 0,45 m 7.2.4 Ống ly tâm, dung tích 50 ml 100 ml 7.3 Thiết bị dùng cho tăng sinh vi khuẩn 7.3.1 Nồi cách thủy, trì 30 °C ± °C, 65 °C ± °C 100 °C ± °C 7.3.2 Bình kỵ khí tủ kỵ khí, trì 30 °C ± °C, phù hợp với TCVN 6404 (ISO 7218) 7.3.3 Tủ ấm, trì 30 °C ± °C 7.3.4 Bình chai có dung tích thích hợp 7.4 Dụng cụ dùng để chiết axit nucleic Sử dụng dụng cụ thích hợp ISO 20837 sau: 7.4.1 Ống ly tâm, dung tích 1,5 ml 2,0 ml 7.4.2 Bộ khuấy trộn sử dụng nhiệt (thermoblock), trộn với tốc độ từ 300 r/min đến 400 r/min 7.4.3 Pipet chia vạch pipep có đầu lọc, tích từ l đến 000 l 7.4.4 Máy ly tâm, dùng cho ống phản ứng có dung tích 1,5 ml 2,0 ml, ví dụ: ống ly tâm nhỏ, LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Cơng ty luật Minh Kh www.luatminhkhue.vn đạt gia tốc đến 12 000 x g 7.4.5 Bộ trộn, ví dụ: kiểu Vortex 7.5 Dụng cụ dùng cho PCR Sử dụng dụng cụ thích hợp phương pháp cụ thể sau: 7.5.1 Pipet pipet có đầu lọc, dung tích từ l đến 000 l 7.5.2 Ống ly tâm nhỏ, dung tích 1,5 ml 2,0 ml 7.5.3 Ống PCR, ống phản ứng 0,2 ml 0,5 ml, đĩa nhiều giếng PCR loại thích hợp khác 7.5.4 Máy chu trình nhiệt 7.6 Thiết bị dùng để phát sản phẩm PCR Sử dụng thiết bị thích hợp với phương pháp cụ thể sau: 7.6.1 PCR gel 7.6.1.1 Hệ thống điện di gel ngang 7.6.1.2 Nguồn cung cấp điện 7.6.1.3 Máy chiếu tia UV hộp đèn UV 7.6.1.4 Hệ thống ghi liệu gel 7.6.2 Máy real time PCR 7.6.2.1 Máy chu trình nhiệt real time PCR 7.6.2.2 Bộ phát phần mềm phân tích thích hợp Lấy mẫu Việc lấy mẫu không quy định tiêu chuẩn Nếu khơng có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến việc lấy mẫu sản phẩm bên có liên quan cần thống việc lấy mẫu Điều quan trọng phòng thử nghiệm phải nhận mẫu đại diện sản phẩm không bị hư hỏng bị thay đổi suốt trình vận chuyển bảo quản Cách tiến hành 9.1 Chuẩn bị mẫu trước tăng sinh 9.1.1 Yêu cầu chung Xem Hình A.1 Nên phân tích 25 g, đặc biệt mẫu mật ong, nhiên, nguồn mẫu bị hạn chế sử dụng cỡ mẫu nhỏ 9.1.2 Chuẩn bị mẫu Chuẩn bị đồng hóa mẫu theo TCVN 6507-1 (ISO 6887-1) phần có liên quan TCVN 6507 (ISO 6887) [9]-[13] mẫu cần phân tích 9.1.3 Chuẩn bị mẫu mật ong Đặt lọ đựng mật ong vào nồi cách thủy (7.2.1) 50 °C ± °C 30 mật ong tan chảy Đảo chiều lọ vài lần để trộn mẫu Cân 25 g ± g mật ong cho vào ống ly tâm vơ trùng dung tích 100 ml (7.2.4) thêm 50 ml nước cất nước khử ion có chứa % phần thể tích polysorbate 80 làm nóng trước đến 50 °C ± °C Trộn dung dịch đồng Ly tâm hỗn hợp 12 000 x g (7.2.2) 30 Cẩn thận lấy phần phía lọc qua màng lọc 0,45 m (7.2.3) Trong trường hợp lọc bị tắc, cho phần hỗn hợp lại qua lọc Sử dụng tất phần giữ lại màng lọc cho bước Bảo quản tạm thời °C ± °C 9.2 Tăng sinh vi khuẩn 9.2.1 Nuôi cấy 9.2.1.1 Yêu cầu chung Đuổi oxy hòa tan khỏi môi trường tăng sinh (6.2) cách đun sôi 10 đến 15 nồi LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Kh www.luatminhkhue.vn cách thủy (7.3.1) Nếu mẫu có tính axit axit hóa, chuẩn bị canh thang tăng sinh theo 6.2.4 9.2.1.2 Nuôi cấy phần mẫu thử 9.2.1.2.1 Phục hồi tế bào sinh dưỡng bào tử Chỉnh nhiệt độ môi trường tăng sinh đến 30 °C ± oC nồi cách thủy (7.3.1) Chuyển phần thử nghiệm vào môi trường tăng sinh loại khí để thu dung dịch pha lỗng cuối 10 -1 9.2.1.2.2 Phục hồi bào tử Chỉnh nhiệt độ môi trường tăng sinh đến 65 °C ± °C nồi cách thủy (7.3.1) Chuyển phần thử nghiệm vào mơi trường tăng sinh làm nóng trước để thu dung dịch pha loãng cuối 10-1 65 °C ± °C Sau nuôi cấy, trì bình chai 65 oC ± °C 10 min, sau làm nguội nhanh đến 30 °C ± °C nồi cách thủy (7.3.1) 9.2.1.3 Nuôi cấy phần mẫu thử mật ong Chỉnh nhiệt độ canh thang tăng sinh đến 65 °C ± °C (7.3.1) Chuyển phần giữ lại lọc (9.1.3) vào bình chai (7.3.4) màng lọc lọc (9.1.3) vào bình chai (7.3.4) thứ hai, bình chai, chứa 10 ml canh thang tăng sinh làm nóng, trường hợp cần đảm bảo đủ để làm ngập màng lọc Ủ bình chai 65 oC ± oC 10 nồi cách thủy (7.3.1) CHÚ THÍCH: Mẫu mật ong dùng để phân tích bào tử 9.2.2 Ủ ấm Ủ điều kiện kỵ khí (7.3.2) 30 °C ± °C Sau ủ 24 h ± h, lấy ml phần tăng sinh để phân tích PCR phần lại giữ điều kiện kỵ khí Nếu kết phân tích PCR âm tính, tiếp tục ủ 48 h ± h điều kiện, sau chuyển ml mơi trường tăng sinh vào bình chai (7.3.4) có chứa ml canh thang tăng sinh (6.2.3) Ủ kỵ khí (7.3.2) 30 °C ± °C 18 h ± h thực phản ứng PCR lần thứ hai 9.2.3 Kiểm soát trình Thực kiểm sốt q trình âm tính dương tính theo TCVN 11134 (ISO 22174) Ví dụ phương pháp chuẩn bị bào tử nêu Phụ lục D 9.3 Chuẩn bị axit nucleic 9.3.1 Yêu cầu chung Sử dụng quy trình chiết axit nucleic thích hợp vi khuẩn Gram dương Ví dụ quy trình nêu 9.3.2 đến 9.3.4 Quy trình bao gồm bước dung giải - dung giải nhiệt có mặt CTAB - số bước chiết để loại bỏ chất ức chế polysaccharid protein Khi phần mẫu thử chuẩn bị, áp dụng nguyên tắc chiết ADN tinh nêu 9.3.2 đến 9.3.4 Mức độ tương thích khối lượng thể tích dung dịch đệm phụ thuộc vào cỡ mẫu thử chọn 9.3.2 Chiết mẫu Chuyền 000 l môi trường tăng sinh (9.2.2) vào ống ly tâm nhỏ (7.4.1) Ly tâm (7.4.4) khoảng 12 000 x g Loại bỏ phần phía ống (dung dịch lỏng) Thêm 500 l dung dịch đệm chiết CTAB (6.3.11) làm ấm trước (65 °C) vào hạt cặn trộn nhẹ dung giải hết Ủ 30 65 °C, khuấy trộn (7.4.2) Thêm 20 l dung dịch proteinase-K (6.3.7), trộn nhẹ ống ủ 30 65 °C, khuấy trộn (7.4.2) Cho ly tâm 10 khoáng 12 000 x g Chuyển phần phía sang ống mới, thêm 0,7 đến lần thể tích cloroform (6.3.1) trộn kỹ Ly tâm 15 khoảng 12 000 x g Chuyển phần phía (dung dịch lỏng) vào ống 9.3.3 Kết tủa CTAB Thêm lần thể tích dung dịch đệm kết tủa CTAB (6.3.12) Ủ 60 nhiệt độ phòng mà không khuấy trộn Ly tâm 15 12 000 x g Loại bỏ phần phía Hịa tan ADN kết tủa cách thêm 350 pl dung dịch NaCl (6.3.13) Thêm 350 l cloroform (6.3.1) trộn kỹ Cho ly tâm 10 12 000 LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn x g Chuyển pha nước vào ống CHÚ THÍCH: Việc làm kết tủa CTAB không cần thiết tất mẫu, dùng cho mẫu giàu protein polysaccharid Cách khác, việc tinh pha rắn ADN (ví dụ: sử dụng cột xốy) cho kết tương đương 9.3.4 Kết tủa ADN Bổ sung 0,6 thể tích isopropanol (6.3.6), trộn kỹ cách đảo ngược ống giữ ống nhiệt độ phòng 20 Ly tâm 15 12 000 x g Loại bỏ phần phía Thêm 500 l dung dịch etanol (6.3.14) vào ống đảo chiều ống vài lần Bước cần để đảm bảo loại bỏ hoàn toàn CTAB Ly tâm 10 12 000 x g Loại bỏ phần phía Làm khơ hạt ADN hịa tan lại 100 l dung dịch đệm thích hợp, ví dụ dung dịch đệm TE (6.3.16), thu dung dịch gốc ADN bảo quản - 20 °C sử dụng 9.4 Khuếch đại PCR Có thể sử dụng quy trình khác để khuếch đại sản phẩm PCR Phát sản phẩm PCR dựa vào gel tín hiệu huỳnh quang Tất yêu cầu cho việc khuếch đại PCR quy định TCVN 7682 (ISO 20838) Ví dụ phương pháp PCR gel-based nêu Phụ lục B phương pháp real-time PCR nêu Phụ lục C 9.4.1 Kiểm soát PCR Thực kiểm soát PCR theo TCVN 11134 (ISO 22174) 9.4.2 Phát sản phẩm PCR Có thể sử dụng quy trình khác để phát sản phẩm PCR Ví dụ phương pháp PCR gel-based nêu Phụ lục B phương pháp real-time PCR nêu Phụ lục C 9.5 Khẳng định kết PCR dương tính Thực quy trình quy định TCVN 7682 (ISO 20838) 9.5.1 Giải thích kết Các kết thu được, bao gồm kiểm soát quy định TCVN 11134 (ISO 22174), cần rõ ràng bước kiểm soát phải cho kết dự kiến, khơng phải lặp lại quy trình Kết PCR là: a) dương tính, sản phẩm PCR đặc hiệu phát khẳng định tất kết kiểm chứng dự kiến; b) âm tính giới hạn phát hiện, không phát sản phẩm PCR cụ thể và tất kết kiểm sốt dự kiến Kết PCR dương tính có nghĩa có mặt độc tố thần kinh botulinum Để khẳng định có mặt độc tố thần kinh phải áp dụng phương pháp thích hợp Phụ lục A (Quy định) Sơ đồ quy trình LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Cơng ty luật Minh Kh www.luatminhkhue.vn Hình A.1 Phụ lục B (Tham khảo) Phân tích PCR đa mồi để phát gen mã hóa độc tố thần kinh botulinum typ A, B, E F sử dụng điện di gel agarose B.1 Phương pháp B.1.1 Giới thiệu Điều mô tả phương pháp khuếch đại đặc hiệu phát gen mã hóa độc tố thần kinh botulinum typ A, B, E F sử dụng điện di gel agarose Đối với hạn chế xem B.1.7.6 B.1.2 Các đặc tính hiệu B.1.2.1 Yêu cầu chung Phương pháp đánh giá xác nhận cho ADN chiết tách từ chủng đối chứng C botulinum typ A, B, E F từ mẫu bị nhiễm tự nhiên Phương pháp có tài liệu tham khảo [1] [2] [5] B.1.2.2 Đánh giá lý thuyết phương pháp Đánh giá lý thuyết thực cách nghiên cứu trình tự tương đồng với sở liệu GenBank/EMBL/DDBJ, EMBL Phịng thí nghiệm Sinh học phân tử châu Âu DDBJ sở liệu ADN Nhật Bản (Tài liệu tham khảo [16], 2009-09-20) Kết nghiên cứu khẳng định việc nhận biết hồn tồn với trình tự đích dự kiến B.1.2.3 Tính chọn lọc LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê www.luatminhkhue.vn B.1.2.3.1 Phép thử chọn lọc dương Độ chọn lọc dương phương pháp thử nghiệm với 86 chủng C botulinum typ A, 70 chủng C botulinum typ B, 15 chủng C botulinum/butyricum typ E chủng C botulinum typ F, xem Bảng B.1 Bảng B.1 - Chọn lọc dương PCR đa mồi sử dụng chủng đích Chủng, typ phân typ Số chủng Typ gen độc tố thần kinh botulinum phát Typ A Typ B Typ E Typ F C botulinum typ A phân typ A1a 3 0 b 9 0 C botulinum typ A phân typ A3c 1 0 d 4 0 C botulinum typ A không xác định phân type 69 69 0 C botulinum typ Ba phân typ A4f 1 0 C botulinum typ Ab phân typ A29 4 0 70 70 0 0 11 0 11 0 C botulinum typ A phân typ A2 C botulinum typ A phân typ A5 C botulinum typ B h C botulinum typ Ei C botulinum typ E j C botulinum typ Fk a Bộ sưu tập quốc gia C botulinum typ chủng cấy (NCTC 4587), C botulinum chủng 62A, C botulinum NCTC 7272 b Các chủng phân lập từ Trung tâm chất chuẩn quốc gia Ý Botulism (NRCB) c C botulinum NCTC 2012 Loch Maree d chủng C botulinum từ Viện Nghiên cứu Thực phẩm (IFR), Vương quốc Anh e tổng số 64 chủng từ sưu tập NRCB năm chủng từ phịng thí nghiệm tư vấn Vi khuẩn kỵ khí (CLAB) Đại học Leipzig, Đức f chủng C botulinum 657Ba từ IFR, Vương quốc Anh g chủng phân lập NRCB, Ý h C botulinum NCTC 7273 69 chủng từ sưu tập NRCB i Ba chủng từ CLAB chủng từ NRCB j Bảy chủng phân lập Ý NRCB, bốn chủng cung cấp theo tài liệu tham khảo [17] k C botulinum NCTC 10281: ba chủng phân lập Ý NRCB; hai chủng phân lập Đức CLAB B.1.2.3.2 Phép thử chọn lọc âm Tính chọn lọc âm phương pháp thử nghiệm với 34 sinh vật đích, xem Bảng B.2 Khơng quan sát phản ứng chéo với vi khuẩn khơng phải đích Bảng B.2 - Tính chọn lọc âm PCR đa mồi sử dụng chủng khơng phải đích Các chủng a Số lượng chủng Typ gen độc tố thần kinh botulinum phát Typ A Typ B Typ E Typ F C sporogenes WDCM 00008 0 0 C perfringens (WDCM 00007 chủng thực địa) 0 0 LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 Công ty luật Minh Khuê Các chủng C carnis NCTC 13036 a www.luatminhkhue.vn Số lượng chủng Typ gen độc tố thần kinh botulinum phát 0 0 C histolyticum NCTC 503 0 0 C butyricum NCTC 7423 0 0 C barati NCTC 10986 0 0 Bacillus subtilis WDCM 00003 0 0 B cereus (NCTC 11143 chủng thực địa) 0 0 Thermophilic Campylobacter spp (các chủng thực địa) 0 0 Escherichia coli (WDCM 00013 chủng thực địa) 0 0 Salmonella spp (WDCM 00030 chủng thực địa) 0 0 Listeria spp (WDCM 00017 WDCM 00109) 0 0 Brochotrix thermospacta WDCM 00071 0 0 Enterococcusfaecalis WDCM 00087 0 0 Citrobacterfreundii WDCM 00078 0 0 Pseudomonas spp (các chủng thực địa) 0 0 Yersinia enterocolitica (các chủng thực địa) 0 0 Lactobacillusfermentum (chủng thực địa) 0 0 Aspergillus spp (các chủng thực địa) 0 0 Saccharomyces cervisiae (chủng thực địa) 0 0 a WDCM = World Data Centre for Microorganisms B.1.2.4 Độ nhạy B.1.2.4.1 Phép thử độ nhạy sử dụng mẫu nhiễm nhân tạo (Tài liệu tham khảo (2]) Các giới hạn phát đánh giá cách đo mẫu nhiễm nhân tạo với mức nuôi cấy khác (0,1 cfu đến 10 cfu từ 10 cfu đến 100 cfu trước tăng sinh) 10 g mẫu thực phẩm khác (cá đóng hộp, xúc xích đóng hộp mật ong) nghiên cứu sử dụng phương pháp nuôi cấy (Tài liệu tham khảo [1]) Theo kết quả, tỷ lệ dương tính giả phương pháp sử dụng mẫu nhiễm bẩn nhân tạo % tỷ lệ âm tính giả %) Giới hạn phát phương pháp quy định cfu đến 10 cfu số bào tử 10 g trước tăng sinh B.1.2.4.2 Phép thử độ nhạy sử dụng mẫu nhiễm tự nhiên (Tài liệu tham khảo [2]) Giới hạn phát đánh giá cách đo 382 mẫu nhiễm tự nhiên (ví dụ mật ong, thực vật loại thịt đóng hộp), sử dụng cách thử sinh học chuột làm phương pháp đối chứng Theo kết quả, tỷ lệ dương tính giả phương pháp sử dụng mẫu nhiễm tự nhiên % tỷ lệ âm tính giả % CHÚ THÍCH: Các thực nghiệm thực với phần mẫu thử 10 g B.1.2.5 Kiểm soát phân tích Tất phép thử thực sử dụng q trình kiểm chứng dương tính âm tính PCR, kiểm chứng khuếch đại nội (IAC) mô tả B.1.6 LUẬT SƯ TƯ VẤN PHÁP LUẬT 24/7 GỌI 1900 6162 ... nhiệt, theo quy định TCVN 7682 (ISO 20838) TCVN 11134 (ISO 22174) 6.4.2 Deoxyribonucleosid triphosphat (dNTP) chứa dATP, dCTP, dGTP dTTP dUTP quy định TCVN 7682 (ISO 20838) TCVN 11134 (ISO 22174)... phân tử quy định ISO 20837 TCVN 7682 (ISO 20838) Áp dụng yêu cầu thuốc thử quy định Điều TCVN 7682 (ISO 20838) 6.2 Môi trường nuôi cấy 6.2.1 Yêu cầu chung Thực theo TCVN 8128 (ISO 11133) việc chuẩn... Các chủng C carnis NCTC 13036 a www.luatminhkhue .vn Số lượng chủng Typ gen độc tố thần kinh botulinum phát 0 0 C histolyticum NCTC 503 0 0 C butyricum NCTC 7423 0 0 C barati NCTC 10986 0 0 Bacillus