BÀI BÁO CÁO THUYẾT TRÌNH MÔN HỌC POLYMER Y SINH VÀ POLYMER PHÂN HỦY ĐỀ TÀI: TÌM HIỂU các CHI TIẾT sản PHẨM đi từ POLYMER PHỤC vụ CHO VIỆC CHẨN đoán và xét NGHIỆM các LOẠI BỆNH CHƯƠNG 1: CẢM BIẾN SINH HỌC ỨNG DỤNG TRONG XÉT NGHIỆM CHOLESTEROL CHƯƠNG 2: CẢM BIẾN SINH HỌC ỨNG DỤNG TRONG XÉT NGHIỆM UREA CHƯƠNG 3: CẢM BIẾN SINH HỌC ỨNG DỤNG TRONG XÉT NGHIỆM GLUCOSE CHƯƠNG 4: CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TRONG QUÁ TRÌNH XÉT NGHIỆM BẰNG CẢM BIẾN SINH HỌC
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA KHOA CÔNG NGHỆ VẬT LIỆU – BỘ MƠN VẬT LIỆU POLYMER BÀI BÁO CÁO THUYẾT TRÌNH MÔN HỌC: POLYMER Y SINH VÀ POLYMER PHÂN HỦY ĐỀ TÀI SỐ 5: TÌM HIỂU CÁC CHI TIẾT SẢN PHẨM ĐI TỪ POLYMER PHỤC VỤ CHO VIỆC CHUẨN ĐOÁN VÀ XÉT NGHIỆM CÁC LOẠI BỆNH GVHD: Huỳnh Đại Phú TP HCM, 2017 GVHD: Huỳnh Đại Phú Team “Ảo” MỤC LỤC CHƯƠNG 1: CẢM BIẾN SINH HỌC ỨNG DỤNG TRONG XÉT NGHIỆM CHOLESTEROL .5 1.1 Tổng quan cảm biến sinh học 1.1.1 Định nghĩa .5 1.1.2 Cấu tạo chung cảm biến sinh học 1.2 Cảm biến cholesterol .7 1.2.1 Nguyên lý hoạt động .7 1.2.2 Phương pháp chuẩn bị nguyên vật liệu 1.2.3 Phương pháp tổng hợp a) Chế tạo màng film composite: b) Cố định ChOx: 1.2.3 Tiêu chuẩn đánh giá cảm biến cholesterol 10 CHƯƠNG 2: CẢM BIẾN SINH HỌC ỨNG DỤNG TRONG XÉT NGHIỆM UREA .11 2.1 Loại polymer làm Biosensor: .11 2.2 Cách chế tạo Biosensor 12 2.2.1 Nguyên liệu: 12 2.2.2 Chuẩn bị điện cực nhạy urea: 12 2.3 Cách sử dụng Biosensor 13 2.4 Cơ chế hoạt động Biosensor 14 2.4.1 Cảm biến điện hóa: 14 2.4.2 Chuyển đổi điện hoá: 14 2.4.3 Độ dẫn điện: 15 2.4.4 Kết luận: 16 GVHD: Huỳnh Đại Phú Team “Ảo” CHƯƠNG 3: CẢM BIẾN SINH HỌC ỨNG DỤNG TRONG XÉT NGHIỆM GLUCOSE .17 3.1 Giới thiệu Glucose Biosensor: 17 3.2 Cách sản xuất Glucose Biosensor: .18 3.2.1 Phương pháp 1: Đo trực tiếp .18 3.2.2 Phương pháp 2: Đo gián tiếp 21 3.3 Các mức tiêu chuẩn lượng Glucose: 22 CHƯƠNG 4: CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG TRONG QUÁ TRÌNH XÉT NGHIỆM BẰNG CẢM BIẾN SINH HỌC 24 4.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lấy mẫu: 24 4.2 Các yếu tố ảnh hưởng lên kết xét nghiệm máu: 24 4.3 Biến đổi thông số xét nghiệm nguồn gốc sinh lý: 26 4.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lấy mẫu: 28 Tài liệu tham khảo 29 GVHD: Huỳnh Đại Phú Team “Ảo” MỤC LỤC HÌNH ẢNH Hình Cấu tạo cảm biến sinh học Hình Phản ứng oxy hóa khử cholesterol Hình Sơ đồ hệ thống theo phương pháp điện di Hình Polypyrole 11 Hình Hệ thống phun dịng chảy sử dụng điện cực PPy / PIC 13 Hình Cấu trúc tế bào dịng chảy (flow-through cell) 14 Hình Các biến chứng đái tháo đường 18 Hình Cấu trúc Glucose biosensor đo trực tiếp .19 Hình Cách tạo Glucose biosensor đo trực tiếp 20 Hình 10 Glucose biosensor đo trực tiếp thực tế 20 Hình 11 Cấu tạo Glucose biosensor đo gián tiếp 21 Hình 12 Máy đo nồng độ Glucose máu trực tiếp 22 Hình 13 Bảng màu để ước lượng nơng độ Glucose máu .23 GVHD: Huỳnh Đại Phú Team “Ảo” CHƯƠNG 1: CẢM BIẾN SINH HỌC ỨNG DỤNG TRONG XÉT NGHIỆM CHOLESTEROL Cholesterol chất béo có màng tế bào đại đa số mô tổ chức thể chúng vận chuyển huyết tương thể người Nguồn gốc cholesterol phần lớn từ thức ăn gan tổng hợp nên từ chất béo bão hòa, phần nhỏ cholesterol hấp thu trực tiếp từ thức ăn như: sữa, trứng, thịt đỏ, lòng lợn, lòng bò, mỡ động vật… Khi cholesterol máu dư thừa q nhiều chúng đóng thành mảng mỡ thành mạch máu gây cản trở dịng máu lưu thơng động mạch Khi lượng oxygen máu không cung cấp đủ cho tim nguy bị đau tim tăng cao Khi máu chạy lên não thiếu gây đột quỵ Chứng bệnh dư thừa cholesterol (hypercholesterolemia) khơng có dấu hiệu thể bệnh chứng gì, phát xét nghiệm máu Để đáp ứng nhu cầu chăm sóc sức khỏe chẩn đốn xác tình trạng bệnh, ngày có nhiều loại cảm biến cholesterol đời nghiên cứu khoa học tiến hành để cải thiện đặc tính khả ứng dụng chúng Bài báo cáo chủ yếu đề cập đến loại cảm biến cholesterol dạng màng film composite có nguồn gốc từ polyaniline độn carbon nanotubes [1] 1.1 Tổng quan cảm biến sinh học 1.1.1 Định nghĩa Theo IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) thì: “Cảm biến sinh học (biosensor) thiết bị tích hợp có khả cung cấp thơng tin phân tích định lượng bán định lượng đặc trưng, bao gồm phần tử nhận biết sinh học (bioreceptor) kết hợp trực tiếp với phần tử chuyển đổi” [2] GVHD: Huỳnh Đại Phú Team “Ảo” 1.1.2 Cấu tạo chung cảm biến sinh học Một cảm biến sinh học bao gồm phận chính: • Đầu thu sinh học • Tác nhân cố định • Bộ phận chuyển đổi tín hiệu • Bộ phận xử lý, đọc tín hiệu Hình Cấu tạo cảm biến sinh học a) Các tác nhân cần phát hiện: phân loại theo cấu tạo sau: • Các vi khuẩn: vi khuẩn E-coli, vi khuẩn Candida • Các phân tử nhỏ: glucose, cholesterol, ure, thuốc trừ sâu,… • Các phân tử sinh học có kích thước lớn: ADN, ARN, protein b) Đầu thu sinh học (Biological Receptor): có tác dụng bắt cặp phát có mặt tác nhân sinh học cần phân tích Đầu thu sinh học phản ứng trực tiếp với tác nhân cần phát có nguồn gốc từ thành phần sinh học • Đầu thu sinh học làm từ enzyme dạng phổ biến nhất: enzyme urease, glucose oxidase, cholesterol oxidase • Đầu thu sinh học làm từ kháng thể/kháng nguyên • Đầu thu sinh học làm từ protein , axit nucleic ADN, ARN GVHD: Huỳnh Đại Phú Team “Ảo” c) Tác nhân cố định: phần quan trọng cảm biến sinh học Các tác nhân có nhiệm vụ gắn kết đầu thu sinh học lên đế, phận trung gian có tác dụng liên kết thành phần sinh học (có nguồn gốc từ thể sống) với thành phần vô Những tác nhân vừa phải đảm bảo độ bền học, vừa phải đảm bảo khả thuyền tải tín hiệu phận sinh học phận chuyển đổi Tín hiệu truyền tải thường gặp tín hiệu điện, cần lựa chọn tác nhân cố định polyme có tính dẫn điện, phổ biến có: polyaniline, polypyrrol, polythiophen… d) Bộ phận chuyển đổi tín hiệu: giúp chuyển biến đổi sinh học thành tín hiệu đo đạc Có nhiều dạng chuyển đổi chuyển đổi điện hoá, chuyển đổi quang, chuyển đổi nhiệt, chuyển đổi tinh thể áp điện chuyển đổi hệ vi Trong đó, chuyển đổi theo ngun lý điện hố có nhiều ưu điểm chế tạo đơn giản, có độ nhạy độ xác cao phù hợp chế tạo cảm biến sinh học ứng dụng phân tích nhanh Chuyển đổi điện hoá bao gồm chuyển đổi dựa điện (potentiometric), dòng điện (amperometric) độ dẫn (conductometric) e) Bộ phận xử lý đọc tín hiệu: phận có tác dụng chuyển, khuếch đạithành tín hiệu điện để máy tính thiết bị hiển thị khác đưa kết cần phân tích 1.2 Cảm biến cholesterol 1.2.1 Nguyên lý hoạt động Báo cáo đề cập đến loại cảm biến cholesterol dạng màng film composites polyaniline carbon nanotubes gắn với thủy tinh phủ indium tin oxide (ITO) Cảm biến sử dụng cholesterol oxidase (một loại enzim xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử cholesterol, O2 bị khử thành H2O2) [3] GVHD: Huỳnh Đại Phú Team “Ảo” Hình Phản ứng oxy hóa khử cholesterol Cảm biến hoạt động dựa tăng nồng độ H2O2 Khi cholesterol oxidase (đóng vai trị đầu thu sinh học) tiếp xúc với cholesterol có mẫu máu kiểm tra gây phản ứng oxy hóa khử Phản ứng xảy làm sinh dịng điện, thơng qua polyme dẫn điện polyaniline gắn cacbon nanotubes truyền tín hiệu điện vào điện cực thủy tinh phủ ITO – đóng vai trị phận xử lý đọc tín hiệu, từ cho kết diện nồng độ cholesterol máu 1.2.2 Phương pháp chuẩn bị nguyên vật liệu • Cholesterol oxidase (ChOx) đóng vai trị đầu thu sinh học • Polyaniline (PANI) đóng vai trị tác nhân cố định PANI tổng hợp từ phản ứng trùng ngưng có sử dụng tác nhân oxy hóa ammonium peroxidisulfate [4] • Carbon nanotubes (CNT) đóng vai trị phận chuyển đổi tín hiệu CNT sau tổng hợp phương pháp lắng (catalytic chemical vapor deposition (CCVD) technique) [5] phải trải qua tinh chế [6] • N-ethyl-N’-(3-dimethylaminopropyl carbodiimide) (EDC) • N-hydroxysuccinimide (NHS) GVHD: Huỳnh Đại Phú Team “Ảo” 1.2.3 Phương pháp tổng hợp a) Chế tạo màng film composite: Màng film composite tổng hợp phương pháp điện di Trước tiên cần tạo hỗn hợp phân tán PANI CNT cách trộn trực tiếp dung dịch có nồng độ PANI/acid formic thích hợp với CNT dung mơi acetonitrile [1] Sau cho hệ keo thu sau trộn vào hệ thống sau: Hình Sơ đồ hệ thống theo phương pháp điện di Trong suốt trình điện di, hạt keo composite mang điện tích dương gắn vào anode ITO Dưới điện đặt vào thích hợp thời gian vừa đủ (120V, 30s) tạo màng film composite bao quanh điện cực ITO có bề dày đồng (200mm) [7] b) Cố định ChOx: ChOx gắn cố định vào màng film composite PANI CNT thơng qua liên kết amide hình thành nhóm NH2 PANI nhóm COOH ChOx, nhờ có diện tác nhân ghép đôi EDC chất tăng hoạt NHS [8] GVHD: Huỳnh Đại Phú Team “Ảo” 1.2.3 Tiêu chuẩn đánh giá cảm biến cholesterol Một số tiêu chí đánh giá, yêu cầu cảm biến sinh học: • Khoảng tuyến tính (Linearity): giá trị hàm lượng lớn chất phân tích mà tín hiệu phân tích cịn tn theo phương trình tuyến tính bậc • Độ nhạy (Sensitivity): tính đáp ứng cảm biến thay đổi nồng độ chất phân tích hay khả phát thay đổi tín hiệu có thay đổi nhỏ nồng độ chất phân tích • Độ chọn lọc (Selectivity): mức độ ảnh hưởng chất tới phép xác định chất phân tích • Thời gian đáp ứng (Response time): khoảng thời gian cần thiết để dòng hệ đo đạt 90% giá trị dịng cân bằng, có tiếp xúc điện cực nghiên cứu với dung dịch đo có thay đổi nồng độ chất dung dịch tiếp xúc với điện cực Đây tiêu chuẩn cảm biến mà nghiên cứu tập trung cải tiến Bên cạnh tiêu chuẩn khác thực phép phân tích định lượng độ lặp lại (repeatability), độ nhiễu, độ chụm (precision), độ phân giải, độ xác (accuracy) Bảng Tiêu chuẩn cảm biến cholesterol Tiêu chuẩn Giá trị Khoảng tuyến tính 1.29 ÷ 12.93 mM nồng độ cholesterol Độ nhạy Độ chọn lọc 6800 nA mM-1 Không bị gây nhiễu tác nhân ascorbic acid, uric acid, glucose, lactic acid, urea Thời gian đáp ứng 10s 10 GVHD: Huỳnh Đại Phú Team “Ảo” thực trì điện không đổi điện cực hoạt động bon (C), platin (Pt) hay vàng (Au) dãy điện cực so với điện cực chuẩn so sánh Dòng thu liên quan trực tiếp đến nồng độ khối đối tượng phân tích hoạt hóa điện tích mức tiêu hao sinh lớp chất xúc tác sinh học Tốc độ phản ứng chất xúc tác sinh học chọn phụ thuộc trước tiên vào nồng độ khối chất phân tích, giống dòng ổn định thường tương ứng với nồng độ khối chất phân tích + Phép đo thế: liên quan đến việc xác định chênh lệch điện cực thị điện cực chuẩn so sánh hai điện cực chuẩn so sánh cách lớp màng mỏng khơng có dịng qua Bộ chuyển đổi điện cực lựa chọn ion (ISE) Hầu thiết bị đo phổ biến điện cực pH; vài loại điện cực lựa chọn khí (CO2, NH3) hay ion (F, I, CN-, Na+, K+ , Ca2+, NH4+) Điện khác điện cực thị điện cực chuẩn so sánh tỷ lệ với hàm lôgarit độ hoạt động ion, giảm nồng độ khí + Đo độ dẫn: Độ dẫn điện đại lượng đặc trưng cho khả dẫn điện vật liệu Phản ứng đầu dò phần tử đích làm thay đổi thành phần chất dẫn điện khiến độ dẫn điện chất thay đổi Các phản ứng enzyme, urease nhiều thụ thể màng sinh học kiểm sốt thiết bị đo trở kháng hay độ dẫn ion sử dụng vi điện cực xen kẽ 2.4.3 Độ dẫn điện: Polyme dẫn pha tạp chất thích hợp nhằm tăng độ dẫn Quá trình pha tạp thực chất trình thêm điện tử (phản ứng khử) loại bỏ điện tử (phản ứng oxi hóa) từ polyme Trong q trình pha tạp chất, điện tử liên kết pi (π) “nhảy” xung quanh chuỗi polyme Điện tử dịch chuyển dọc theo phân tử tạo dòng điện Mặc dù vậy, độ dẫn vật liệu bị giới hạn điện tử phải “nhảy” qua phân tử, để có độ dẫn tốt hơn, phân tử phải có trật tự xếp tốt, gần để hạn chế khoảng cách “nhảy” Ngoài ra, độ dẫn điện phụ thuộc lớn vào cấu trúc polyme Chuỗi phân tử polyme có cấu trúc phẳng, mạch ngắn độ kết tinh thấp độ dẫn điện Ngược lại polyme có mạch liên kết dài, độ kết tinh cao, mạch nhánh độ dẫn điện cao Quá trình truyền điện tử gồm 03 cách: 15 GVHD: Huỳnh Đại Phú Team “Ảo” • Truyền dẫn điện tử nội phân tử (Intramobility) • Truyền dẫn điện tử phân tử (Intermobility) • Truyền dẫn điện tử sợi vật liệu polyme (Inter-fibril mobility of charge carrier) 2.4.4 Kết luận: Điện cực nhạy PPy /PIC sử dụng để phân tích dịng chảy (flow injection analysis), cho phép xác định urea nhanh dễ dàng Trong điều kiện phân tích tối ưu, urê khảo sát nồng độ từ 10-5 đến 3.10-3 mol dm-3 với độ nhạy cao 120 mV rsd 1,5% Phản ứng hệ thống với urea giảm lúc ban đầu khoảng 30%, sau phản ứng liên tục thu cho 80 phép đo Độ nhạy cao cảm biến giải thích dựa tương tác NH3 NH4+ polypyrrol không hoạt động (inactive polypyrrole), điều gây peak thừa Một lần tiêm đệm hàm lượng cao làm tăng tốc độ proton hóa polypyrol rút ngắn thời gian phân tích 16 GVHD: Huỳnh Đại Phú Team “Ảo” CHƯƠNG 3: CẢM BIẾN SINH HỌC ỨNG DỤNG TRONG XÉT NGHIỆM GLUCOSE 3.1 Giới thiệu Glucose Biosensor: Bệnh tiểu đường vấn đề sức khỏe có ảnh hưởng toàn giới Sự rối loạn chuyển hóa kết thiếu hụt Insulin tăng đường huyết phản ánh nồng độ glucose máu cao thấp mức bình thường 80 – 120 mg/dL (4.4 – 6.6 mM) Bệnh tiểu đường nguyên nhân hàng đầu gây tử vong tàn tật toàn giới Các biến chứng bệnh tiểu đường nhiều, bao gồm nguy bệnh tim, suy thận mù lòa Tuy nhiên, biến chứng nguy hại giảm đáng kể thơng qua việc kiểm soát chặt chẽ lượng đường máu Từ việc chẩn đốn quản lý bệnh đái tháo đường địi hỏi phải theo dõi chặt chẽ lượng đường máu Theo đó, hàng triệu bệnh nhân tiểu đường kiểm tra mức đường máu ngày, làm cho Glucose chất dùng để phân tích phổ biến Thực tế, thiết bị cảm biến Glucose chiếm khoảng 85% toàn thị trường cảm biến sinh học Với quy mô thị trường khổng lồ làm cho bệnh tiểu đường trở thành mơ hình bệnh để phát triển khái niệm công nghệ sinh học Các triển vọng kinh tế to lớn liên quan đến việc quản lý bệnh tiểu đường với thách thức việc cung cấp kiểm soát đường huyết chặt chẽ đáng tin cậy dẫn đến số lượng lớn nghiên cứu hấp dẫn chiến lược phát sáng tạo Các điện cực enzyme dòng điện, dựa màng giữ enzyme Glucose đóng vai trị dẫn đầu việc kiểm tra lượng đường máu cách đơn giản dễ sử dụng dự kiến đóng vai trị tượng tự q trình theo dõi Glucose liên tục 17 GVHD: Huỳnh Đại Phú Team “Ảo” Hình Các biến chứng đái tháo đường 3.2 Cách sản xuất Glucose Biosensor: Sử dụng cảm biến H2O2 cho phận truyền dẫn Cảm biến sinh học Glucose làm nhiều cách khác việc sử dụng enzyme glucose oxidase: Glucose oxidase Glucose + O2 → Gluconic acid + H2 O2 Để đo nồng độ Glucose, sử dụng phương pháp khác sau: -Đo lượng Oxy tiêu thụ cảm biến Oxy -Đo acid (gluconic acid) cảm biến pH -Đo lượng H2O2 tạo cảm biến Peroxide Lưu ý cảm biến oxy đầu dò chuyển nồng độ Oxy thành dòng điện Cảm biến pH chuyển đổi pH thành điện áp Tương tự vậy, cảm biến Peroxide chuyển đổi nồng độ Peroxide thành dòng điện 3.2.1 Phương pháp 1: Đo trực tiếp Cấu trúc Glucose Biosensor dùng phương pháp đo trực tiếp: Bộ cảm biến bao gồm cảm biến H2O2 Enzyme Glucose Oxidase cố định phía trước cảm biến H2O2 hai màng Màng màng lọc có tính thẩm thấu 18 GVHD: Huỳnh Đại Phú Team “Ảo” cho phép H2O2 qua màng ngăn tách cảm biến sinh học khỏi mơi trường phân tích Hình Cấu trúc Glucose biosensor đo trực tiếp Cách sử dụng Glucose Biosensor: Bước 1: Chuẩn bị hỗn hợp Cyclehexanone, Acetone Cellulose Acetate để đúc màng thẩm thấu Bước 2: Khuấy hỗn hợp nhiệt độ phòng Cellulose Acetate hòa tan sau đúc màng mỏng lên bề mặt đầu dị cảm biến Cho phép dung mơi bay Bước 3: Hòa tan Glucose Oxidase dung dịch đệm Phosphate Sau để dung dịch enzyme lên màng Cellulose Acetate để nước bốc (5 – 10 phút) Bước 4: Bọc lớp enzyme khô màng Polycarbonate Điều chỉnh lại màng vòng chữ O (hoặc ống Silicone) Bước 5: Cắt màng thừa đặt đầu dò vào dung dịch đệm Phosphate trước sử dụng Thời gian sử dụng cảm biến vài tháng đầu dò lưu trữ nhiệt độ phòng dung dịch đệm Phosphate Các bước liên quan thể sau: 19 GVHD: Huỳnh Đại Phú Team “Ảo” Hình Cách tạo Glucose biosensor đo trực tiếp Hình ảnh Glucose biosensor thực tế: Hình 10 Glucose biosensor đo trực tiếp thực tế 20 ... hiệu đi? ??n vào đi? ??n cực thủy tinh phủ ITO – đóng vai trị phận xử lý đọc tín hiệu, từ cho kết diện nồng độ cholesterol máu 1.2.2 Phương pháp chuẩn bị ngun vật liệu • Cholesterol oxidase (ChOx)... ứng tạo tiêu thụ đi? ??n tử (các enzym gọi enzyme redox) Bề mặt cảm biến thường chứa ba đi? ??n cực: đi? ??n cực tham chi? ??u (reference electrode), đi? ??n cực làm việc (working electrode) đi? ??n cực đối (counter... TRONG XÉT NGHIỆM CHOLESTEROL Cholesterol chất béo có màng tế bào đại đa số mô tổ chức thể chúng vận chuyển huyết tương thể người Nguồn gốc cholesterol phần lớn từ thức ăn gan tổng hợp nên từ chất