Quy trình phân tích salmonella trong sản phẩm gia cầm

TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUN THIÊN NHIÊN NHĨM LỚP DH11SH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH Salmonella TRONG SẢN PHẨM GIA CẦM SEMINAR MƠN KỸ THUẬT PHÂN TÍCH CHỈ TIÊU VI SINH VẬT Khóa học: 2010 - 2014 An Giang, 2013 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NƠNG NGHIỆP & TÀI NGUN THIÊN NHIÊN NHĨM LỚP DH11SH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH Salmonella TRONG SẢN PHẨM GIA CẦM SEMINAR MƠN KỸ THUẬT PHÂN TÍCH CHỈ TIÊU VI SINH VẬT Khóa học: 2010 - 2014 GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN ThS Bằng Hồng Lam DANH SÁCH NHÓM Nguyễn Hoàng Nhựt Lynh Bung San Ny Thanh Hồng Anh Hoàng Nguyễn Trung Nghĩa Nguyễn Viết Thanh Lê Hoàng Yên Nguyễn Ngọc Hồ Nguyễn Phạm Toại Nguyện An Giang, 2013 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Mục lục Nội dung Trang Mục lục i Danh sách hình ii Ch ng 1: Đ n Ch ng 2: Nội dung i i thiệu chung 2.1.1 Đặc điểm T nh ch t h a sinh Ph n loại Ph ng há h n t ch Nguyên t c M i tr Ph ng h a ch t ng há thực Tăng sinh Tăng sinh chọn lọc Ph n l nh n iện h ng đ nh uy trình Dụng cụ l y mẫu bảo quản mẫu 2.4 Ch uy trình h n t ch ng : K u n i n ngh 11 ết lu n 11 iến ngh 11 T i i u ham h 12 i LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Danh sách hình Nội dung Trang Hình : Vi khuẩn Salmonella (Nhuộm gram) Hình : huẩn lạc Salmonella thạch XLD Hình : Thử nghiệm Salmonella m i tr ng TSI Hình : Thử nghiệm Salmonella m i tr ng canh urea Hình 5: Thử nghiệm Salmonella m i tr ng Phenol re broth base Hình 6: Salmonella thử nghiệm LDC Hình 7: Salmonella thử nghiệm sinh In ol Hình 8: Salmonella thử nghiệm Voges - Proskauer Hình : uy trình t m t t h n t ch đ nh t nh Salmonella mẫu th t gia cầm 10 ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Ch Đ ng n Vì nhu cầu tiêu thụ l n nên iệc giết m gia cầm tràn lan kh ng h ệ sinh t qua tầm kiểm soát c a c quan ch c nên g y hàng loạt ụ ngộ độc thực hẩm Do đ v n đ ngộ độc thực hẩm nh ng năm gần đ y ngày tr nên c thiết Các báo cáo cho th y hần l n ụ ngộ độc thực hẩm o i sinh t g y nên C r t nhi u i sinh t g y ngộ độc thực hẩm nh Clostridium butolinum, E coli, Listeria monocytogenes… Trong đ Salmonella loài g y ngộ độc r t nguy hiểm Salmonella đ c hát t cu i k đ c nghiên c u năm Tuy nhiên khoảng năm tr lại đ y ch ng r t đ c quan t m b i gia tăng ụ ngộ độc thực hẩm mà đ gia cầm tr ng sản hẩm t ch ng nguồn tàng tr mầm bệnh l n nh t Vi khuẩn r t h n b rộng kh tự nhiên c thể g y bệnh cho động t máu n ng động t máu lạnh cho ng i h ng ch riêng Việt Nam mà c n m i lo ngại cho n c gi i LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Ch ng Nội dung 2.1 Gi i hi u chung 2.1.1 Đ c iểm Salmonella trực khuẩn Gram m k ch th c trung bình t - x 0,5 - m i chuyển b ng tiên mao tr S galimarum S pullorum kh ng tạo bào tử ch ng hát triển t t nhiệt độ - 420C th ch h nh t 35 - 370C H t th ch h nh t pH = 7,2 nhiệt độ 18 - 400C i khuẩn c thể s ng đến ngày Hình 1: Vi huẩn Salmonella (Nhuộm gram) (Nguồn: http://parasites.czu.cz/food/parasite.php?idParasite=107) Salmonella i khuẩn k kh t y nghi hát triển đ c m i tr ng nu i c y th ng th ng Trên m i tr ng th ch h i khuẩn s hát triển sau gi C thể mọc nh ng m i tr ng c ch t c chế chọn lọc nh DCA (deoxychlate citrate agar) XLD ( ylose lysine eo ycholate) đ m i tr ng XLD t ch t c chế h n nên th ng c ng để h n l Salmonella huẩn lạc đặc tr ng m i tr ng tr n lồi su t c t m đen đ i t m đen l n bao tr m khuẩn lạc m i tr ng ung quanh chuyển sang màu đ LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình 2: Khuẩn ạc Salmonella rên hạch XLD (Nguồn: http://www.sanidadanimal.info/cursos/inmun/septimo4.htm) 2.1.2 T nh ch hóa sinh Salmonella kh ng lên men lactose lên men đ ng glucose sinh h i Th ng kh ng lên men sucrose salicin inositol sử ụng đ c citrate m i tr ng Simmons Tuy nhiên kh ng hải loài Salmonella c ng c nh ng t nh ch t ngoại lệ đ c ác đ nh S typhi lên men đ ng glucose kh ng sinh h i kh ng sử ụng citrate m i tr ng Simmon h u hết ch ng S paratyphi S cholerasuis kh ng sinh H2S khoảng ch ng Salmonella sinh độc t sinh bacteriocin ch ng lại E coli, Shigella s ch ng Salmonella khác 2.1.3 Ph n ại i i : Bacteria Ngành : Proteobacteria L : Gramma Proteobacteria Bộ : Enterobacteriales Họ : Enterobacteriaceae i ng : Salmonella lignieres Dựa c u tr c kháng nguyên ch yếu kháng nguyên th n kháng nguyên l ng H, Salmonella đ c chia thành nh m ty e huyết Hiện đ c ác đ nh gồm ty e huyết Salmonella 2.2 Ph ng há h n ch 2.2.1 Ngu ên c Salmonella c thể đ c hát ( h n t ch đ nh t nh) b ng quy trình gồm b c tăng sinh tăng sinh chọn lọc h n l kh ng đ nh Salmonella th ng c mặt mẫu i l ng nh b t n th ng c ng LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com iện chung i s l ng l n i sinh t thuộc họ Enterobacteriaceae c t nh cạnh tranh mạnh c chế tăng tr ng c a Salmonella 2.2.2 M i r ng hóa ch Buffered Pepton Water (BPW) Rappaport Vassiliadis Soya Pepton (RV) Malachite Green Magnesium Chloride Tetrethionate Muller – Kauffmanm Xylose Lysine Deoxucholate (XLD) Hektoen Entric Agar (HE) Bismuth Sulphite Agar (BS) Brillian Green Phenol Red Lactose Sucrose (BPLS) Triple Sugar Iron (TSI) Urea Lysine Decarboxylase Ornithine Decarboxylase Mannitol Sucrose Sorbitol Tryptone Thu c khử o ac s háng huyết Salmonella đa giá 2.3 Ph ng há h c hi n 2.3.1 Tăng sinh Đ i i th t gia cầm t i s ng: Đặt mẫu gia cầm t i P l n cho thêm l t BP l c b ng máy l c gi y để m i tr ng th m toàn mẫu 2.3.2 Tăng sinh chọn ọc L c để trộn đ u ung ch tăng sinh sau đ chuyển ml sang 10 ml m i 0 tr ng tăng sinh chọn lọc V đ đ c m đến C C 18 gi cần thiết c thể k o ài thêm gi 2.3.3 Ph n nh n di n D ng que c y ng thực kĩ thu t c y h n l khuẩn lạc đ n i gi ng t ch tăng sinh chọn lọc đĩa m i tr ng h n l đặc tr ng cho Salmonella nh XLD H BS… C ng độ chọn lọc m c độ h n biệt thể hình thái c a khuẩn lac Salmonella t ng m i tr ng c ng khác Để chọn lọc nh n ạng t t ng Salmonella cần sử ụng t nh t hai loại m i tr ng chọn lọc h n biệt khác cho c ng mẫu LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.3.4 Kh ng nh T m i m i tr ng h n l c y chuyển t nh t khuẩn lạc đặc tr ng qua m i tr ng kh ng chọn lọc nh TSA 70C 18 gi Các khuẩn lạc đặc tr ng m i tr ng đ c sử ụng cho test sinh h a huyết Các thử nghiệm sinh h a ch nh cần thực cho Salmonella là: Lên men glucose, urea, manitol, indol, H2S, VP, ODC, LDC, saccharose, sorbitol 2.4 Qu rình 2.4.1 Dụng cụ l y mẫu b o qu n mẫu ăng tay ng lần áo bảo hộ T i nilon tr ng ựng mẫu thể t ch kg Cồn b ng th m n c ẹ b ng th kh ng r Dụng cụ bảo quản lạnh 2.4.2 Qu rình h n ch 2.4.2.1 D ng k o khuẩn c t g mẫu (kh ng l y m l y ch t l ng c ) cho bao nilon khuẩn Thêm ml m i tr ng BP đ h khử tr ng để nguội Tiến hành đồng nh t mẫu đ c độ lo ng -1 Đem nhiệt độ 37 C gi 2.4.2.2 Tă g si : C y ml ch mẫu c nồng độ -1 ng nghiệm c ch a 10 ml m i tr ng tăng sinh chọn lọc V ± 50C gi : C y mẫu t m i tr ng V sang m i tr ng thạch đĩa XLD nhiệt độ 70C gi Nh n ạng khuẩn lạc đặc tr ng c a Salmonella m i tr ng XLD: Tr n lồi su t c t m đen đ i t m đen l n bao tr m khuẩn lạc m i tr ng ung quanh chuyển sang màu đ (hồng)… Chọn khuẩn lạc đặc tr ng c y chuyển sang m i tr ng thạch đĩa TSA tăng sinh kh ng chọn lọc ± 0,50C gi 2.4.2.3 T g i g L y khuẩn lạc t m i tr ng TSA c y sang m i tr ng thử nghiệm sinh h a: a) T g i i gT H khử tr ng m i tr ng TSI C h t h n h i m i tr ng ng tr ng để làm ng thạch nghiêng D ng que c y ng c y sinh kh i t khuẩn lạc c a gi ng s u đáy c a ng thạch nghiêng LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Sau c y ong 70C 24 - gi Salmonella ch lên men đ c đ ng glucose m i tr ng TSI → Phần nghiêng c a m i tr ng TSI c màu đ hần sau c màu àng Salmonella c khả sinh H2S → Xu t ệt màu đen m i tr ng TSI C thể th y t ng sinh h i qua t ng sinh h i qua t ng làm thạch m i tr ng m i tr ng b đẩy lên tạo khoảng kh ng bên i ng nghiệm Hình 3: Thử nghi m Salmonella rên m i r ng TSI #1 - Đ i ch ng #4 - Ps Aeruginosa ATCC 9027 #2 - S enteritidis ATCC 13076 #5 - Proteus vulgaris ATCC 13315 #3 - E coli ATCC 25922 #6 - Pseudomonas fluorescens (Nguồn: www.microbiologyatlas.kvl.dk) b) T g i C y i sinh t m i tr ng canh urea c ch a ch t ch th bromocresol purple 370C khoảng - gi Thử nghiệm ( ): M i tr ng chuyển sang màu àng Thử nghiệm (-): M i tr ng kh ng đ i màu  Salmonella kh ng h n giải urea nên kh ng làm thay đ i H m i tr ng Sau nu i c y m i tr ng gi nguyên màu àng LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình 4: Thử nghi m Salmonella rên m i r ng canh urea #1 - Đ i ch ng #2 - Proteus vulgaris ATCC 8427 #3 - Salmonella (Nguồn: www.microbiologyatlas.kvl.dk) c) Lê men mannitol M i tr ng sử ụng m i tr ng henol re broth base c H 4; ch th m i tr ng henol re c màu đ s chuyển thành màu àng pH < 6,8 Tiến hành c y ng m i tr ng ch ng i sinh t cần kh ng đ nh 70C 18 gi lên mên c a ch ng đ c đánh giá ựa sinh aci sinh h i Sinh acid (+): M i tr ng màu cam chuyển sang màu àng Sinh h i (-): C bọt kh ng Durnham  M i tr ng sau nu i c y Salmonella b aci h a chuyển thành màu àng Hình 5: Thử nghi m Salmonella rên m i r ng Phen red broth base (Nguồn: http://www.proprofs.com/flashcards/story.php?title=bio-150-microbiology-labpacket-ii-review) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com d) T g i L L si s Sử ụng m i tr ng alko Tiến hành c y ng m i tr ng ch ng i sinh t cần kh ng đ nh Ch t ch th màu m i tr ng Bromocresol ur le Phản ng ( ): M i tr ng gi nguyên màu t m ban đầu canh khuẩn đục Phản ng (-): M i tr ng t t m chuyển sang àng  Sau nu i c y Salmonella m i tr ng chuyển thành ki m m i tr ng gi nguyên màu t m ban đầu Hình 6: Salmonella r ng nghi m LDC #1 - Đ i ch ng #2 - Control #3 - Salmonella #4 - Klebsiella #5 - Citrobacter freudii ATCC 8090 (Nguồn: www.microbiologyatlas.kvl.dk) e) T g i ă g si i C y i sinh t thử nghiệm qua m i tr ng canh try ton khoảng gi 37 C Nh ài giọt ether để k o in ol lên b mặt m i tr ng thêm ài giọt thu c thử o ac s uan sát sau ài h t Thử nghiệm ( ): Trên b mặt m i tr ng u t ng màu đ cánh sen Thử nghiệm (-): Kh ng u t ng đ  Salmonella: Indol (-) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình 7: Salmonella r ng nghi m sinh Ind #1 - Đ i ch ng #2 - E coli ATCC 25922 #3 - Salmonella (Nguồn: www.microbiologyatlas.kvl.dk) T g i g s - Proskauer C y i sinh t m i tr ng glucose hos hate (M - VP broth) nhiệt độ 70C ng - ngày Thêm canh khuẩn ung ch thu c thử al - na htol cồn ung ch H hay Na H i t lệ : uan sát hản ng ảy h t Thử nghiệm ( ): Xu t màu đ hay hồng sáng mặt m i tr ng Thử nghiệm (-): M i tr ng kh ng đ i màu  Salmonella: VP (-) Hình 8: Salmonella r ng nghi m Voges - Proskauer #1 - Đ i ch ng #2 - Klebsiellapnemoniae ATCC10031 #3 - Salmonella (Nguồn: www.microbiologyatlas.kvl.dk) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 25 gam th t gà ml BP đồng nh t mẫu gi y độ lo ng -1 70C Đem L y ml canh tr gi ng cho m i tr C± ng V gi C y chuy n m i tr ng XLD 370C gi nhiệt độ Chọn khuẩn lạc đặc tr ng cho Salmonella c y chuy n m i tr ng test sinh h a: TSI Mannitol, phenol red, Urea, LDC, Trypton, VP Thử nghiệm ng ng kết kháng huyết K Hình 9: Qu u n Salmonella m nh/d r ng 25 gam mẫu ng nh rình óm h n ch nh nh Salmonella r ng mẫu h gia cầm 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com K Ch u n ng i n ngh 3.1 K u n Salmonella loại i khuẩn nguy hiểm Ch ng g y bệnh cho nhi u đ i t ng động thực t ng i Loài th ng tạ nhiễm thực phẩm nên r t nguy hiểm theo TCVN kh ng đ c để Salmonella c mặt thực hẩm 3.2 Ki n ngh Các c quan t ch c c thẩm quy n th ng uyên giám sát kiểm tra hoạt động c a c s giết m Nhà n c t ch c qu c gia qu c tế quan t m h n n a n đ ệ sinh an toàn thực hẩm nên c nh ng biện há kh ng chế trạng nhiễm i khuẩn Salmonella l m Tiế tục c nh ng nghiên c u s u rộng h n tình trạng nhiễm Salmonella th t gà đ a giải há kh c hục hiệu Tăng c ng giáo ục cộng đồng m c độ nguy hại o i khuẩn Salmonella g y 11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com T i i u ham h Trần Linh Ph c( ) g i si g , Thành h Hà Nội: Nhà u t iáo ục Nguyễn Văn Chiến ( 7) Đi u tra t lệ nhiễm h n l ác đ nh t lệ nhiễm Salmonella gà c ng nghiệ s đ a điểm t nh B c Ninh biện há h ng tr , Lu n ăn thạc sĩ khoa học N ng nghiệ Đại học N ng L m Thái Nguyên Rene S Hendriksen (2003), Global Salm-Surv - A global Salmonella surveillance and laboratory support project of the World Health organization, Geneva: World Health Organization 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ...TRƯỜNG ĐẠI HỌC AN GIANG KHOA NÔNG NGHIỆP & TÀI NGUN THIÊN NHIÊN NHĨM LỚP DH11SH QUY TRÌNH PHÂN TÍCH Salmonella TRONG SẢN PHẨM GIA CẦM SEMINAR MƠN KỸ THUẬT PHÂN TÍCH CHỈ TIÊU VI SINH VẬT... uy trình t m t t h n t ch đ nh t nh Salmonella mẫu th t gia cầm 10 ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Ch Đ ng n Vì nhu cầu tiêu thụ l n nên iệc giết m gia. .. monocytogenes… Trong đ Salmonella loài g y ngộ độc r t nguy hiểm Salmonella đ c hát t cu i k đ c nghiên c u năm Tuy nhiên khoảng năm tr lại đ y ch ng r t đ c quan t m b i gia tăng ụ ngộ độc thực hẩm mà đ gia