PHÂN lập VIRUS PRRS TRÊN môi TRƯỜNG tế bào MARC 145 và xác ĐỊNH VIRUS BẰNG kỹ THUẬT RT PCR

iii BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MƠI TRƢỜNG TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR Ngành: CƠNG NGHỆ SINH HỌC Niên khóa: 2003 – 2007 Sinh viên thực hiện: VÕ NGỌC THƠ Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com iv BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MÔI TRƢỜNG TẾ BÀO MARC-145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR Giáo viên hƣớng dẫn: Sinh viên thực hiện: ThS TRẦN THỊ BÍCH LIÊN VÕ NGỌC THƠ BSTY HỒNG THANH HẢI Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 09/2007 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM ƠN  Chân thành cảm ơn: Ban giám hiệu Trƣờng Đại Học Nơng Lâm Tp.Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học tất quý Thầy Cô truyền đạt kiến thức cho tơi suốt q trình học tập trƣờng Các Thầy Cô anh chị Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Trƣờng Đại Học Nơng Lâm Tp.Hồ Chí Minh tận tình bảo tạo điều kiện tốt cho tơi suốt q trình thực tập tốt nghiệp Thầy Hải, Cô Hà Thầy Cơ Bộ Mơn Vi Sinh-Truyền Nhiễm tận tình giúp đỡ tơi suốt q trình thực đề tài Anh Lê Hồng Phong Cục Thú Y vùng tận tình bảo giúp đỡ tơi suốt thời gian thực khoá luận Anh Uyên động viên chia sẻ vấn đề Các bạn lớp Công Nghệ Sinh Học 29 (nhất bạn phòng 14A, cƣ xá B) động viên giúp đỡ tơi suốt q trình học tập  Đặc biệt xin gởi lời biết ơn sâu sắc đến Cơ Trần Thị Bích Liên Anh Hồng Thanh Hải tận tình dạy bảo, hƣớng dẫn, giúp đỡ động viên suốt trình nghiên cứu thực khóa luận  Con xin gởi lòng mang ơn đặc biệt đến với cha mẹ, ngƣời sinh thành, nuôi dƣỡng, dạy dỗ cho tinh thần thoải mái để tâm vào chuyện học  Và lời cám ơn đặc biệt xin gởi đến ngƣời bạn thân thiết nhất, Nguyễn Minh Khôi, luôn bên tôi, an ủi động viên để làm tốt Xin cám ơn, cám ơn từ tận đáy lòng Thủ Đức, tháng năm 2007 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Võ Ngọc Thơ TÓM TẮT Đề tài: “Phân lập virus PRRS môi trƣờng tế bào MARC-145 xác định virus kỹ thuật RT-PCR” Đề tài đƣợc thực từ tháng 3/2007 đến tháng 8/2007 phòng Vi Sinh Truyền Nhiễm Khoa Chăn Ni Thú Y Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh Trƣờng Đại Học Nơng Lâm Tp.Hồ Chí Minh Mục tiêu đề tài phân lập virus từ loại mẫu khác xác định diện virus kỹ thuật RT-PCR Nội dung nghiên cứu gồm:  Hồi phục tế bào xác định thời gian lần cấy chuyển (thời gian tế bào phát triển đầy bề mặt nuôi cấy tạo thành tế bào lớp) bình ni cấy 25cm2 với lƣợng tế bào 7.105 106  Khảo sát bệnh tích tế bào MARC-145 sau ni cấy phân lập từ loại mẫu khác nhau: huyết thanh, hạch amiđan, phổi, hạch phổi  Xác định diện virus PRRS từ bệnh tích tế bào MARC-145 sau gây nhiễm kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) Sau thời gian thực hiện, chúng tơi có kết sau: o Thời gian lần cấy chuyển lọ 25cm2 với lƣợng tế bào: 7.105, 106 lần lƣợt 72,56 46 o Tế bào MARC-145 sau đƣợc hồi phục từ nitơ lỏng phát triển bình thƣờng o Phân lập virus PRRS từ hạch phổi, phổi, huyết môi trƣờng tế bào MARC-145 Ghi nhận đƣợc mẫu có biểu bệnh tích tế bào mẫu hạch phổi mẫu phổi chiếm tỷ lệ 27,27% (3/11) o Bằng kỹ thuật RT-PCR, mẫu có bệnh tích tế bào có mẫu cho kết dƣơng tính chiếm tỷ lệ 33,33% mẫu xét nghiệm iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com SUMMARY Graduating thesis: " Isolating PRRS virus by MARC-145 cell and confirming the virus by RT-PCR technology" The thesis have been done from March to August, 2007 at Microbiology And Infectious Diseases Dept of Faculty Of Animal Science Veterinary and Center For Chemical And Biological Analysis And Experiment of Nong Lam university Hồ Chí Minh city Purpose of this reseach: Isolate PRRS virus from different specimens and determine its appearance by RT-PCR technology The contain is concerned about:  Reviewing the cell and determine how long once transfer, length of time for cells grows to make monolayer, in flash with the amount of 7.105 and 106  Observating MARC-145 cell`s pathology after infecting the cells with different specimens such as: serum, lung, lympho nodes  Determine virus` appearance from MARC-145 cell's pathology after days postinfection by RT-PCR technology (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction) Finally, we have results: o The average period of one transfer with the amount of 7.105 cells is 72,565 hours, 106 cells is 46 hours o MARC-145 after reviewing from liquid nitrogen grow normally o Isolating PRRS virus from lung, lympho nodes, serum in MARC-145 cell invironment specimens have MARC-145 cell's pathology postinfection: lymphonotes, lung (3/11 specimens) o We detect the positive form of PRRS RNA by RT-PCR: lympho node v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN iii TÓM TẮT iv SUMMARY v MỤC LỤC vi DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ ix DANH SÁCH CÁC HÌNH x DANH SÁCH CÁC BẢNG xi DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT xii Chƣơng 1: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích - Yêu cầu Chƣơng 2: TỔNG QUAN 2.1 Tổng quan nuôi cấy tế bào 2.1.1 Một số đặc điểm tế bào động vật 2.1.2 Thành phần môi trƣờng nuôi cấy 2.1.3 Điều kiện nuôi cấy 2.1.4 Sự tạp nhiễm cách hạn chế .6 2.2 Phƣơng pháp PCR 2.2.1 Nguyên tắc 2.2.2 Thực nghiệm 2.2.3 Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng PCR 2.2.4 Phƣơng pháp RT-PCR 2.3 Sơ lƣợc bệnh, bệnh virus 10 2.3.1 Lịch sử bệnh 10 2.3.2 Căn bệnh học .11 2.3.2.1 Phân loại .11 2.3.2.2 Một số đặc điểm hình thái cấu trúc 12 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 2.3.2.3 Đặc điểm nuôi cấy 14 2.3.2.4 Sức đề kháng 16 2.3.3 Dịch tễ học bệnh PRRS .16 2.3.3.1 Loài mắc bệnh 16 2.3.3.2 Phƣơng thức lây lan 16 2.3.3.3 Đƣờng xâm nhập 17 2.3.3.4 Cơ chế sinh bệnh 17 2.3.4 Triệu chứng lâm sàng 20 2.3.5 Chẩn đoán 20 2.3.5.1 Chẩn đoán lâm sàng 20 2.3.5.2 Chẩn đoán phi lâm sàng .21 2.3.5.2.1 Phƣơng pháp phát kháng thể 21 2.3.5.2.2 Các phƣơng pháp phát kháng nguyên 22 2.3.5.2.3 Phát gen virus PRRS 23 2.3.5.2.4 Phân lập virus môi trƣờng tế bào 23 Chƣơng 3: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 25 3.1 Thời gian địa điểm .25 3.2 Đối tƣợng số lƣợng mẫu 25 3.3 Nội dung nghiên cứu 25 3.4 Vật liệu dụng cụ 26 3.4.1 Thiết bị dụng cụ dùng cho nuôi cấy tế bào phân lập virus 26 3.4.2 Vật liệu dùng cho nuôi cấy tế bào MARC-145 26 3.4.3 Thiết bị dụng cụ dùng cho phản ứng PCR .27 3.4.4 Vật liệu hoá chất cho chiết tách RNA 27 3.4.5 Vật liệu hoá chất sử dụng cho RT-PCR 27 3.4.6 vật liệu hoá chất cho điện di sản phẩm RT-PCR 28 3.5 Phƣơng pháp tiến hành .28 3.5.1 Phƣơng pháp lấy mẫu 28 3.5.2 Phƣơng pháp nuôi cấy tế bào MARC-145 28 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.5.2.1 Hồi phục tế bào 28 3.5.2.2 Cấy chuyển tế bào 29 3.5.3 Phƣơng pháp phân lập virus 30 Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 4.1 Thời gian lần cấy chuyển tế bào MARC-145 .34 4.2 Kết gây nhiễm lần môi trƣờng tế bào MARC-145 .35 4.3 Kết gây nhiễm lần hai môi trƣờng tế bào MARC-145 37 4.4 Kết RT-PCR 40 Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .44 5.1 Kết luận 44 5.2 Tồn 44 5.3 Đề nghị .44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 PHỤ LỤC viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Sơ đồ chế sinh bệnh virus PRRS 19 Sơ đồ 3.1 Sơ đồ phân lập xác định virus PRRS 31 Sơ đồ 3.2 Sơ đồ thực phản ứng RT-PCR 33 ix LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH CÁC HÌNH Hình 2.1 Virus PRRS 12 Hình 2.2 Đại thực bào bình thƣờng 15 Hình 2.3 Đại thực bào bị nhiễm virus PRRS 15 Hình 2.4 Triệu chứng bệnh tai xanh 20 Hình 2.5 Sảy thai virus PRRS 20 Hình 3.1 Buồng đếm Neubauer 30 Hình 4.1 Đối chứng âm 40 Hình 4.2 Mẫu khơng có bệnh tích tế bào 40 Hình 4.3 Đối chứng dƣơng 40 Hình 4.4 Bệnh tích tế bào vào ngày thứ sau gây nhiễm mẫu HP 41 Hình 4.5 Bệnh tích tế bào vào ngày thứ sau gây nhiễm mẫu P2 41 Hình 4.6 Kết RT-PCR mẫu ly trích từ dịch ni cấy tế bào 42 x LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 38 Nhƣ vậy, sau lần gây nhiễm mơi trƣờng tế bào MARC-145, có mẫu có biểu bệnh tích tế bào, chiếm tỷ lệ 27,27% (3/11) mẫu hạch phổi mẫu phổi Một số hình ảnh phân lập virus mơi trƣờng tế bào MARC-145: Hình 4.1 Đối chứng âm (độ phóng đại 100 lần) Hình 4.2 Mẫu khơng có bệnh tích tế bào (độ phóng đại 100 lần) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 39 Hình 4.3 Đối chứng dƣơng (độ phóng đại 100 lần) Hình 4.4 Bệnh tích tế bào vào ngày thứ sau gây nhiễm mẫu HP (độ phóng đại 100 lần) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 40 Hình 4.5 Bệnh tích tế bào vào ngày thứ sau gây nhiễm mẫu P2 (độ phóng đại 100 lần) 4.4 Kết RT-PCR Sau hai lần gây nhiễm, tiến hành thu hoạch dịch tế bào thực phản ứng RT-PCR để xác định diện virus PRRS môi trƣờng tế bào Chúng tiến hành chạy PCR mẫu có biểu bệnh tích tế bào điều kiện thiếu hố chất Tuy nhiên số hạn chế thời gian tiến hành kỹ thuật nhƣ hoá chất, máy đọc gel bị trục trặc, nên gởi mẫu xác định kỹ thuật RT-PCR LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 41 Bảng 4.4 Kết RT-PCR từ mẫu dịch tế bào sau gây nhiễm Loại mẫu Gây nhiễm lần Kết CPE Kết RT-PCR Gây nhiễm lần hai Kết CPE Kết RT-PCR DTB HT KTH KTH DTB HT KTH KTH DTB HT KTH KTH DTB HT KTH KTH DTB HT KTH KTH DTB HT KTH KTH DTB P KTH KTH DTB P ± DTB P KTH ± KTH KTH KTH DTB HP1 + + DTB HP2 ± KTH ± CPE: cytopathic effect (bệnh tích tế bào) HT: huyết +: có bệnh tích tế bào P: phổi ±: bệnh tích tế bào nghi ngờ HP: hạch phổi -: không bệnh tích tế bào DTB: dịch tế bào KTH: khơng thực LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 42 Lad USA EU Band 200bp Hình 4.6 Kết RT-PCR mẫu ly trích từ dịch ni cấy tế bào USA: chủng Châu Mỹ EU: chủng Châu Âu Lad: thang chuẩn Giếng 1: mẫu DTB HP từ kết CPE lần Giếng 2: mẫu DTB P2 từ kết CPE lần hai Giếng 3: mẫu DTB HP2 từ kết CPE lần hai Việc gây bệnh tích tế bào kết RT-PCR dƣơng tính dã xác định diện virus mẫu xét nghiệm Nhƣ vậy, bƣớc đầu thực thành công việc phân lập virus PRRS môi trƣờng tế bào MARC-145 từ mẫu hạch phổi Điều cho thấy mơi trƣờng tế bào MARC-145 mơi trƣờng thích hợp cho phát triển virus PRRS sử dụng cho phân lập Kết phù hợp với nhận định Jeong-Ki Kim cs (2005): tế bào MARC-145 dòng tế bào nhạy cảm với virus PRRS nên thích hợp cho việc phân lập virus LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 43 Trong tổng số 11 mẫu phân lập, chúng tơi ghi nhận đƣợc có mẫu có bệnh tích tế bào gây nhiễm có mẫu cho kết nghi ngờ Các mẫu cho bệnh tích tế bào MARC-145 mẫu phổi hạch phổi heo sau cai sữa có biểu bệnh lý hô hấp Bằng kỹ thuật RT-PCR xác định đƣợc mẫu dịch tế bào từ hạch phổi có diện virus PRRS, chiếm tỷ lệ 50% (1/2 hạch phổi) Kết chúng tơi khác với Hồng Thanh Hải (2005), tác giả chƣa thành công việc phân lập virus PRRS môi trƣờng tế bào MARC-145 từ loại mẫu đƣợc lấy từ lò mổ nhƣ: huyết thanh, máu, hạch phổi dich rữa khí quản Sự khác theo chúng tơi tác giả dựa kết ELISA dƣơng tính Mặt khác, khơng thể loại trừ yếu tố ảnh hƣởng đến kết phân lập nhƣ đối tƣợng lấy mẫu, cách bảo quản, xử lý mẫu đời tế bào MARC-145 sử dụng So với kết Võ Thị Đan (2006), thành công việc phân lập virus từ hạch phổi Vậy hai loại mẫu thƣờng đƣợc sử dụng để phân lập virus PRRS huyết hạch amiđan mẫu hạch phổi cho kết khả thi phân lập virus LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 44 Chƣơng KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Thời gian tế bào MARC-145 phát triển đầy bề mặt nuôi cấy tạo thành tế bào lớp với lƣợng tế bào 7.105 106 72,565 46 Phân lập virus PRRS môi trƣờng tế bào MARC-145 với loại mẫu chúng tơi có đƣợc: hạch amiđan, huyết thanh, phổi, hạch phổi Có mẫu có biểu bệnh tích tế bào tổng số 11 mẫu chúng tơi có đƣợc chiếm tỷ lệ 27,27% Biểu bệnh tích tế bào xuất từ ngày thứ hai sau gây nhiễm tăng nhanh vào ngày mẫu hạch phổi Bằng kỹ thuật RT-PCR, mẫu có bệnh tích tế bào có mẫu cho kết dƣơng tính chiếm 33,33% mẫu xét nghiệm 5.2 Tồn Chƣa xác định đƣợc liều gây nhiễm 50% tế bào nuôi cấy (TCID50 - Tissue culture infected dose 50) Chƣa xác định đƣợc chủng Châu Âu hay chủng Châu Mỹ Số lƣợng mẫu cịn hạn chế nên khơng thể kết luận đƣợc mẫu tốt cho phân lập virus PRRS khả thi Chƣa xác định diện virus PRRS mẫu khơng có bệnh tích tế bào 5.3 Đề nghị Tiếp tục phân lập virus với số lƣợng mẫu nhiều Xác định chủng virus phân lập Cần xác định kỹ thuật RT-PCR mẫu khơng có bệnh tích Xác định TCID50 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu tiếng Việt Hồ Huỳnh Thuỳ Dƣơng, 1998 Sinh học phân tử NXB Giáo Dục, Tp HCM Hồng Thanh Hải, 2005 Thử nghiệm ni cấy tế bào MARC-145, ứng dụng kỹ thuật ELISA nuôi cấy tế bào để chẩn đoán bệnh virus PRRS heo Luận văn tốt nghiệp, khoa Chăn Nuôi Thú Y, trƣờng Đại Học Nơng Lâm Tp HCM Hồng Văn Năm, 2001 Hội chứng sinh sản hô hấp lợn (bài dịch tổng hợp) Tạp chí khoa học thú y Số 1/2002 Tr 74- 87 Hoàng Văn Năm, 2001 Hội chứng sinh sản hô hấp lợn (bài dịch tổng hợp) Tạp chí khoa học thú y Số 2/2001 Tr 65- 75 Nguyễn Ngọc Hải, 2007 Công nghệ sinh học thú y NXB Nông Nghiệp, Tp.HCM Phòng Dịch tễ-Cục Thú y Hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn Thanh Thuận, 2002 Bệnh hô hấp lợn - Tổng quan (bài dịch từ báo cáo International Pig Health Conference- Bangkok 3/2001) Tạp chí khoa học thú y số 1/2002 Tr76 Trần Đức Minh Virus gây hội chứng rối loạn sinh sản hô hấp lợn (Bài dịch từ “Theriogenology 66 (2006): 655-662”) Trần Thanh Phong, 1996 Giáo trình bệnh truyền nhiễm virus heo Tủ sách Trƣờng Đại Học Nông Lâm Tp HCM Tr 99- 104 10 Võ Thị Đan Thanh, 2006 Phân lập virus PRRS môi trường tế bào MARC-145 xác định virus kỹ thuật RT-PCR Luận văn tốt nghiệp, Khoa Chăn Nuôi Thú Y, Trƣờng Đại Học Nông Lâm, Tp HCM  Tài liệu nƣớc 11 Ausvetplan, 2004 Disease stratery porcine reproductive and respiratory syndrome http://www.aahc.com.au/ausvetplan/index.htm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 46 12 Benfield D.A., Collins J.E., Dee S.A., Halbur P.G., Joo H.S., Lager K.M., Mengelling W.L., Murtaugh M.P., Rossow K.D., Stevenson G.W., and Zimmerman J.J., 1999 Porcine reproductive and respiratory syndrome In disease of swine, 8th edition Ed.Straw B.E., D’Alleire S.D., Mengelling W.L., Taylor D.J Iowa State University Press, Ames- Iowa, USA p.201220 13 Butler M, 2004 Animal cell culture and technology The second editionbios scientific publishers P.1, P.55-58 14 Delputte P L, Vanderheijden N, Nauwynck H J, 2001 Involvement of matrix protein in attachment of porcinereproductive and respiratory syndrome virus to a heparinlike receptor on porcine alveolar macrophages http//www pubmedcentral.gov 15 Han-Kook Chung, Changsun Choi, Junghyun Kim, Chanhee Chae, 2002 Detection and differentiation of North American and European genotypes of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues by multiplex reverse transcription-nested PCR p59 16 Jeong-Ki Kim, Al-Majhdi Fahad, Kumar Shanmukhappa, and Sanjay Kapil, 2005 Defining The Cellular Target(s) Of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Blocking Monoclonal Antibody 7G10 17 Kim H.S., Kwang J., Yoon I.J., Joo H.S., Frey M.L., 1993 Enhanced replication of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus a homogeneous subpopulation of MA- 104 cell line Arch.Virol.133: 477- 483 18 Meulenberg Janneke J.M., 2000 PRRS, the virus http//www.csirus.com 19 Nathalie Vanderheijden, Delputte Peter L., Favoreel Herman W., 2003 Involvememt of sialoadhesin in entry of porcine reproductive and respiratory syndrome virus into porcine alveolar macrophages.http//www pubmedcentral.gov LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 47 20 Prieto C., and Castro J.M., 2000 Pathogennesis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) in gestating sows Vet.Res.31:56- 57 21 R.Allende, W.W.Laegreid, G.F.Kutish, J.A.Galeota, R.W.Wills and F.A.Osorio, 2000 Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome Virus: Description Of Persistence In Individual Pigs Upon Experimental Infection Journal of Virology p 10834 – 10837 22 Rosso K.D.,1998 Review article: Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Vet Pathol 35: 1-20 23 Sinjder E.J., and Meulenberg J.J.M, 1998 Review article: the molecular biology of arteriviruses Journal of General Virology 79: 961- 979 24 Suarez Paloma, 2000 Ultrastructural pathogenesis of the PRRS virus http//www.csirus.com 25 Yoon K.J.,and Stevenson G., 1999 Porcine reproductive and respiratory syndrome Trends in emerging viral infection of swine Iowa State Press P.347- 354  Tài liệu Internet http://www.agraroldal.hu http://www.animal-health-online.de http://www.porcilis-prrs.com http://www.thepigsite.com LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHỤ LỤC PHƢƠNG PHÁP PHA MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY TẾ BÀO Tất thao tác đƣợc thực tủ cấy vô trùng  Pha mơi trƣờng EMEM (pha lít) Cho 500 ml nƣớc cất khử ion vào bình thuỷ tinh Cho gói EMEM dạng bột (9,6g gói) vào bình cho bột khơng dính vào thành, lắc kĩ để bột tan Khuấy từ tối thiểu để bột tan hoàn tồn Làm đầy thành lít Lọc tiệt trùng mơi trƣờng với lƣới lọc 0,22 m máy hút chân không tủ cấy vô trùng Chắt lọ nhỏ để 370C 48 để kiểm tra tiệt trùng Phần lại trữ ngăn dƣới tủ lạnh  Phƣơng pháp pha LAH 25% (pha lít) Cân 250g LAH cho vào lọ thuỷ tinh lít, cho 500ml nƣớc cất khử ion vào lọ dùng khuấy từ làm cho tan bột Khi bột tan hết làm đầy thành lít Chia vào lọ nhỏ, hấp tiệt trùng 1210C 15 phút, trữ 40C  Phƣơng pháp pha glutamine (pha lít) Cân 29,2g glutamine cho vào lít, khơng cho bột dính vào thành lọ Đong lít nƣớc khử ion cho vào lọ cho tan hết bột thành lọ Trộn tối thiểu 15 phút để hoà tan Khi tan hết, lọc với lƣới lọc 0,22 m máy hút chân không Khi lọc xong chiết lọ 5ml Trữ lạnh đông  Phƣơng pháp pha dung dịch P/S (Penicillin/Streptomycine) để pha 500ml (trong 1ml có 40000UI Penicillin 40000 g Streptomycine) Lấy 20 lọ benzylpenicillin 1000000UI 20 lọ Streptomycine Sulfate 1g Bóc bỏ lớp vỏ để lộ phần cao su LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lấy xilanh hút 10ml nƣớc khử ion vào lọ Penicillin, 5ml vào lọ Streptomycine Khi bột tan hút Penicillin Streptomycine từ lọ cho vào lọ 500ml Rửa lại lọ nhƣ Làm đầy thành 500ml với nƣớckhử ion Chia nhỏ lọ 1ml 4ml Trữ -200C  Pha dung dịch kháng nấm (Fungizone): pha 50ml dung dịch có 500 g Amphotericine B/ml Lấy lọ kháng nấm Amphotericine B (25mg/lọ), dùng xilanh bơm 10ml nƣớc cất khử ion vào lọ thuốc, lắc cho tan Sau bột tan hút dung dịch từ lọ vào lọ 100ml Bơm 10ml nƣớc cất để tráng Làm đầy thành 50ml Chia thành lọ nhỏ 2ml trữ -200C  Pha Na pyruvate100mM: Na pyruvate đƣợc nhà sản xuất pha sẳn dạng lọ 100ml Do đó, cần tách lọ 5ml để thuận tiện cho việc sử dụng  Tổ hợp môi trƣờng phát triển: 100ml mơi trƣờng gồm: Huyết thai bị (FBS): 8ml Glutamine: 1ml Na pyruvate 100mM: 1ml LAH (Lactalbumin hydrolysate) 25%: 2ml Sodium Bicarbonate 7%: 1ml Kháng sinh (trong 1ml dung dịch có 400000UI penicillin, 400000 g streptomycine): 0,25ml Kháng nấm (trong 1ml có 500 g amphotericine B): 0,5ml EMEM (Eagle Minimum Essential Medium): làm đầy thành 100ml  Môi trƣờng trì giống mơi trƣờng phát triển nhƣng thay 8% FBS 2% FBS  Quy trình pha PBSA (phosphate bufferd saline solution A) pha 200ml LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Cho 200ml nƣớc cất khử ion vào chai thuỷ tinh có nắp Cho viên PBSA vào Hấp tiệt trùng 1210C 15 phút Lƣu ý không đƣợc vặn nắp chặt Sau hấp xong vặn chặt nắp, trữ lạnh 40C  Pha trypsine 0,5% Cho 0,5ml EDTA-Tripsin vào ống falcon 15ml Cho tiếp 9,5ml PBSA hấp khử trùng vào Trộn trữ 40C  Pha hố chất ly trích RNA Pha Sodium citrate.2H2O 0,75M - Cho 2,005g Sodium citrate.2H2O vào chai đựng 7ml H2O - Dùng NaOH chuẩn độ đến pH 7,0 - Thêm nƣớc cho đủ 10ml Pha Sarkosyl 10% - Cho 10ml nƣớc khử DEPC vào chai - Cho 1g Sarkosyl vào khuấy tan Pha -mercaptoethanol - Cho 0,36ml nƣớc khử DEPC vào eppendorf 1,5ml - Cho 0,41g -mercaptoethanol vào., lắc cho tan hết - Bảo quản tháng nhiệt độ phòng Pha dung dịch ly giải tế bào - Cho 40ml nƣớc khử DEPC vào chai - Cho 37,092g guanidium thiocyanate vào - Thêm 1,7ml Sodium citrate.2H2O 0,75M 2,5ml Sarkosyl 10% - Cho nƣớc khử DEPC vào đến đủ 50ml - Khuấy máy khuấy có gia nhiệt 650C - Bảo quản đƣợc nhiệt độ phòng tháng, nhiệt độ thấp guanidium thiocyanate bị kết tủa LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com - Khi sử dụng cho thêm vào 0,36ml -mercaptoethanol/50ml dung dịch ly giải tế bào  Quy trình ly trích RNA khơng sử dụng TRIzol o Bƣớc 1: Đồng mẫu, phá vỡ tế bào  350 l dịch mẫu mô đƣợc nghiền nhuyễn PBS hay 350 l dịch tế bào  500µl dung dịch ly giải tế bào(guanidium isothicyanate 4M; sodium citrate 25mM; sarkosyl 0,5%; 2-mercaptoethanol, pH 7.0) o Bƣớc 2: Phân tách tinh RNA  50µl sodium acetate 2M, pH 4.0; 600µl phenolchloroform  Ủ 370C phút  Votex mạnh 15 giây để yên nhiệt độ phòng phút  Ly tâm 12000 vòng/phút 15 phút 40C o Bƣớc 3: Kết tủa RNA  Thu dịch  Kết tủa RNA 500µl isopropanol  Ủ mẫu nhiệt độ phòng 10 phút ly tâm 12000 vòng/phút 15 phút 40C  Hút bỏ dịch nổi, thu cặn o Bƣớc 4: Rửa RNA  Rửa cặn với 1ml ethanol 75%  Ly tâm 9000 vòng/phút phút  Rửa lại lần  Làm khô tự nhiên chân không khoảng 5-10 phút o Bƣớc 5: Hòa tan RNA  Hịa tan với 30µl nƣớc khơng chứa RNase (RNase – free water) đá, trộn ủ 55-600C 10 phút LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com  Giữ RNA tủ -700C Nên sử dụng RNA để thực phản ứng PCR sớm tốt RNA để lâu dễ bị enzyme RNAse phân huỷ Thời gian lần cấy chuyển Analysis of Variance for TGIAN.ketqua - Type III Sums of Squares -Source of variation Sum of Squares d.f Mean square F-ratio Sig level -MAIN EFFECTS A:TGIAN.ltb 705.69922 705.69922 7295.934 0001 RESIDUAL 1934500 0967250 -TOTAL (CORRECTED) 705.89267 -0 missing values have been excluded All F-ratios are based on the residual mean square error Table of Least Squares Means for TGIAN.ketqua -95% Confidence Level Count Average Stnd Error for mean -GRAND MEAN 59.282500 1555032 58.613424 59.951576 A:TGIAN.ltb 700000 72.565000 2199148 71.618783 73.511217 1E6 46.000000 2199148 45.053783 46.946217 Multiple range analysis for TGIAN.ketqua by TGIAN.ltb -Method: 95 Percent LSD Level Count LS Mean Homogeneous Groups -1E 46.000000 X 700000 72.565000 X -contrast difference limits 700000 - 1E6 26.5650 1.33815 * -* denotes a statistically significant difference LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... ? ?Phân lập virus PRRS môi trƣờng tế bào MARC- 145 xác định virus kỹ thuật RT- PCR? ?? 1.2 Mục đích – Yêu cầu 1.2.1 Mục đích Xác định diện virus PRRS môi trƣờng tế bào MARC- 145 kỹ thuật RT- PCR góp... DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC  KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÂN LẬP VIRUS PRRS TRÊN MƠI TRƢỜNG TẾ BÀO MARC- 145 VÀ XÁC ĐỊNH VIRUS BẰNG KỸ THUẬT RT- PCR. .. luanvanchat@agmail.com 26  Phân lập virus PRRS môi trƣờng MARC- 145 từ loại mẫu: huyết thanh, phổi, hạch phổi đối tƣợng lấy mẫu  Xác định diện virus PRRS từ dịch tế bào MARC- 145 sau gây nhiễm kỹ thuật RT- PCR 3.4