PHỤ LỤC 5. SẮC KÝ ĐỒ PHÂN TÍCH MẪU NHUYỄN THỂ 2 MẢNH VỎ BẰNG HPLC –UV
Nội dung
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Đinh Đăng Huy NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂN ASP TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ TANDEM LC-MS/MS LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC Hà Nội - Năm 2009 i LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN _ Đinh Đăng Huy NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂN ASP TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG GHÉP KHỐI PHỔ TANDEM LC-MS/MS Chun ngành : Hố phân tích Mã số : 60 44 29 LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC GS.TS PHẠM HÙNG VIỆT Hà Nội - Năm 2009 i LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM ƠN Bản luận văn thực hoàn thành Trung tâm Chất lượng Nông lâm thủy sản vùng 4, 30 Hàm Nghi – Quận 1, Thành phố HCM với hướng dẫn GS.TS Phạm Hùng Việt Với lòng biết ơn sâu sắc, xin trân trọng cảm ơn GS.TS Phạm Hùng Việt hướng dẫn giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn TS Dương Hồng Anh hướng dẫn, giúp đỡ trình nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trung tâm Chất lượng Nông lâm thủy sản vùng 4, Tập thể phòng kiểm nghiệm Trung tâm vùng 4, bạn bè đồng nghiệp quan tâm giúp đỡ thời gian vừa qua Xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường, Khoa Hóa học, thầy cô Trường đại học Khoa học Tự nhiên tận tình dạy hướng dẫn suốt trình học làm luận văn Hà Nội, tháng 12 năm 2009 Học viên Đinh Đăng Huy LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chương - TỔNG QUAN .4 1.1 Hiện tượng thủy triều đỏ 1.2 Độc tố sinh học biển thủy sản 1.3 Đại cương axít domoic (DA) 1.3.1 Tính chất hóa lý 1.3.2 Nguồn tích tụ DA nhuyễn thể: 1.3.3 Độc tính DA .9 1.4 Một số phương pháp phân tích DA 1.4.1 Phương pháp sinh hóa chuột 10 1.4.2 Phương pháp sắc ký lỏng (LC-UV, LC-DAD, LC-FLD, LC-MS/MS) 11 1.5 Ưu nhược điểm phương pháp dẫn đến việc sử dụng phương pháp LC-MS/MS phân tích DA 12 1.5.1 Phương pháp sinh hóa chuột 12 1.5.2 Phương pháp sắc ký lỏng 12 1.6 Đại cương sắc ký lỏng hiệu cao ghép khối phổ [2], [5] 12 1.6.1 Một số định nghĩa phương trình .13 1.6.2 Những thành phần hệ thống LC-MS/MS (Waters) 15 1.6.3 Loại hợp chất phù hợp phân tích sắc ký lỏng 23 1.6.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình tách chất cột 23 1.7 Kỹ thuật chuẩn bị mẫu cho phân tích sắc ký 26 1.7.1 Chiết lỏng - lỏng: 27 1.7.2 Chiết pha rắn SPE: 27 Chương – NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 Nội dung nghiên cứu đề tài .29 2.2 Mơ hình thực nghiệm 29 2.3 Thiết bị, dụng cụ, hoá chất: .29 2.3.1 Thiết bị, dụng cụ: 29 2.3.2 Thuốc thử, hóa chất: .30 2.4 Thông tin mẫu nghiên cứu: .30 2.5 Xác định thông số tối ưu: 31 2.5.1 Xác định thông số tối ưu cho MS .31 2.5.2 Cột: 31 2.5.3 Pha động chế độ gradient: 32 2.5.4 Dung môi chiết: .32 2.5.5 Thiết lập bảng mẫu: 32 2.5.6 Tính toán : .33 2.5.7 Khảo sát khoảng tuyến tính: 33 2.5.8 Giới hạn phát phương pháp: .33 2.5.9 Độ lặp lại phương pháp: 34 2.5.10 Độ thu hồi phương pháp: 34 2.5.11 Thực nghiệm xác định DA mẫu nhuyễn thể 35 Chương 3- KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 36 3.1 Xác định thông số tối ưu: 36 3.1.1 Xác định thông số tối ưu MS/MS 36 i LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.1.2 Pha động chương trình chạy gradient 40 3.1.3 Dung môi chiết: .45 3.2 Khoảng tuyến tính: 47 3.3 Giới hạn phát phương pháp: .49 3.4 Độ lặp lại độ thu hồi phương pháp: .49 3.5 Thực nghiệm xác định DA nhuyễn thể .51 3.6 Đánh giá độ tin cậy phương pháp: 52 3.7 Qui trình phân tích Axít domoic 54 3.7.1 Phạm vi áp dụng: 54 3.7.2 Nguyên tắc: .54 3.7.3 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, dung dịch: 54 3.7.4 Chuẩn bị mẫu: 57 3.7.5 Tiến hành thử nghiệm: 58 3.7.6 Đảm bảo chất lượng 60 3.7.7 Tính tốn kết quả: 60 KẾT LUẬN 61 TÀI LIỆU THAM KHẢO 62 PHỤ LỤC 1: CÔNG THỨC CẤU TẠO ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂN PHỤ LỤC 2: MỘT SỐ SẮC KÝ ĐỒ TIÊU BIỂU KHI TỐI ƯU PHỤ LỤC ĐƯỜNG BIỂU DIỄN ĐỘ TUYẾN TÍNH 13 PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ CHẠY MẪU NHUYỄN THỂ MẢNH VỎ 19 PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ PHÂN TÍCH MẪU NHUYỄN THỂ MẢNH VỎ ………….BẰNG HPLC –UV 29 ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt DA DAD EU FA FLD Tiếng Anh Axít domoic Diot Array Detector European Formic acid Fluorescence Detector Tiếng Việt Axít Domoic Đầu dị Diot Array Liên minh Châu Âu Axít Formic Đầu dò huỳnh quang HPLC High Performance Liquid Chromatography Liquid Chromatograph Tandem Mass Spectrometer Limit of Detection Limit of Quantitative Normal Phase Liquid Chromatography Not detected Reversed Phase Liquid Chromatography Solid Phase Extraction Trifluoroacetic acid Ultra Violet Visible Sắc ký lỏng hiệu cao LC-MS/MS LOD LOQ NPLC ND RPLC SPE TFA UV VIS iii Sắc ký lỏng ghép lần khối phổ Giới hạn phát Giới hạn định lượng Sắc ký lỏng pha thuận Không phát Sắc ký lỏng pha đảo Chiết pha rắn Axít Trifluoro axetic Cực tím Nhìn thấy LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Diễn giải Trang Bảng 01 Một số dung môi sử dụng HPLC .26 Bảng 02 Chi tiết mẫu thực nghiệm 30 Bảng 03 Kết khảo sát giá trị hiệu điện mao quản 36 Bảng 04 Kết khảo sát giá trị hiệu điện cone 37 Bảng 05 Kết khảo sát lượng va chạm .38 Bảng 06 Các Ion thứ cấp điều kiện tối ưu lương va chạm 39 Bảng 07 Điều kiện gradient 1– pha động 40 Bảng 08 Bảng gradient – pha động 41 Bảng 09 Bảng gradient – pha động 42 Bảng 10 Bảng gradient – pha động 43 Bảng 11 Bảng gradient – pha động 44 Bảng 12 So sánh cường độ tín hiệu ion 266,25 nồng độ ppm 47 Bảng 13 Bảng tổng hợp thông số độ tuyến tính theo ion: Error! Bookmark not defined Bảng 14 Kết xác định giới hạn phát phương pháp 49 Bảng 15 Kết phân tích độ lặp lại độ thu hồi phương pháp .49 Bảng 16 Kết phân tích mẫu nhuyễn thể (tính Ion 266,25) 51 Bảng 17 So sánh kết phương pháp HPLC-UV LC-MS/MS .53 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Diễn giải Trang Hình 01 Sơ đồ đơn giản hệ thống sắc ký lỏng 16 Hình 02 Sơ đồ van cao áp vị trí nạp 17 Hình 03 Sơ đồ van cao áp vị trí tiêm 17 Hình 04 Pha tĩnh cột sắcký pha đảo .18 Hình 05 Pha tĩnh cột sắc ký pha thuận 19 Hình 06 Bộ kết nối phun điện tử 20 Hình 07 Bộ ion hóa hóa học 20 Hình 08 Hệ thống đầu dị tứ cực 22 Hình 09 Nguyên lý hoạt động đầu dò MS/MS 23 Hình 10 khả tách cột C8 C18 .24 Hình 11 Ảnh hưởng pH dung môi đến khả tách chất .24 Hình 12 Ảnh hưởng độ phân cực dung mơi q trính sắc ký 25 Hình 14 Mơ hình thực nghiệm 29 Hình 15 Sắc ký đồ ứng với giá trị tối ưu Capillary = KV 37 Hình 16 Sắc ký đồ tối ưu Ion mẹ ứng với giá trị tối ưu cone volt = 30 V .38 Hình 17 Cách phân mảnh ion DA .39 Hình 18 Sắc ký đồ điều kiện Collision energy 15 eV 40 Hình 19 Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 1– pha động 41 Hình 20 Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 2– pha động 42 Hình 21 Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 1– pha động 43 Hình 22 Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 2– pha động 44 Hình 23 Sắc ký đồ chạy chuẩn DA gradient 3– pha động 45 Hình 24 Sắc ký đồ chạy mẫu chiết dung mơi MeOH:H20: 1:1 46 Hình 25 Sắc ký đồ chạy mẫu chiết dung môi Formic: metanol:H20: 2:5:93 46 Hình 26 Sắc ký đồ chạy mẫu chiết dung môi MeOH: H20: 2:1 .47 Hình 27 Đồ thị biểu diễn đường tuyến tính .48 Hình 28 Kết chạy mẫu nghêu Nam Định LC-MS/MS HPLC-UV 53 Hình 29 Kết chạy mẫu CRM LC-MS/MS HPLC-UV 54 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỞ ĐẦU Theo ước tính Tổ chức nơng lương (FAO), tổng kim ngạch xuất nhập sản phẩm thủy sản năm 2008 giới lần lịch sử vượt 100 tỷ USD Một nửa xuất thủy sản giới bắt nguồn từ nước phát triển 80% nhập thuộc nước phát triển Xuất ròng từ nước phát triển đạt mức 25,4 tỷ USD năm 2008 Các sản phẩm từ thủy sản nguồn thu ngoại tệ quan trọng nước phát triển Ở Việt Nam, thủy sản ngày đóng vai trò thiết yếu vào kim ngạch xuất Việt Nam Sau năm gia nhập WTO, ngành thủy sản Việt Nam có bước tiến nhảy vọt công tác xuất thủy sản, năm 2007 sản lượng thủy sản nước ước đạt 3,9 triệu với kim ngạch xuất 3,75 tỷ USD, sản phẩm nhuyễn thể hai mảnh vỏ chiếm tỷ trọng đáng kể Đến năm 2008, kim ngạch xuất thủy sản nước ta vượt ngưỡng tỷ USD Một thị trường nhập lớn ngành thủy sản Việt Nam Liên minh Châu Âu (EU) Theo quy định Ủy ban liên minh Châu Âu, để nước khối EU phép xuất thủy sản vào EU phải đảm bảo yếu tố: (i) Hệ thống văn quy pham pháp luật lực quan quản lý an chất lượng vệ sinh toàn thực phẩm nước xuất EU tương đương (ii) Hệ thống phòng kiểm nghiệm tham gia vào công tác kiểm tra, chứng nhận chất lượng đảm bảo vệ sinh an toàn thực phẩm nước xuất EU tương đương (iii) Bắt buộc phải thực chương trình giám sát dư lượng độc hại thủy sản nuôi giám sát điều kiện đảm bảo vệ sinh vùng thu hoạch nhuyễn thể mảnh vỏ (iv) Đồng thời thủy sản phải phân tích tiêu theo quy định EU trước xuất với địi hỏi nghiêm ngặt kỹ thuật phân tích Như vậy, thực chương trình giám sát điều kiện đảm bảo vệ sinh vùng thu hoạch nhuyễn thể mảnh vỏ điều kiện tiên giúp Việt Nam phép xuất nhuyễn thể hai mảnh vỏ vào EU Hai nội dung liên LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com quan đến kỹ thuật đóng vai trị việc thực chương trình định danh, phân loại tảo độc (các loài tảo độc có khả sinh độc tố) phân tích độc tố sinh học biển (ASP- độc tố gây trí nhớ, DSP – độc tố gây tiêu chảy, PSP – độc tố gây liệt cơ) Dạng tồn độc tố gây trí nhớ (ASP) axit Domoic có cơng thức cấu tạo: Ngành thủy sản cần có qui trình phân tích phù hợp theo yêu cầu thị trường nhập giúp quan chức kiểm sốt hóa chất độc hại nói chung đặc biệt độc tố có mối nguy gắn liền với lồi (độc tố sinh học biển với loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ, Histamine họ cá thu ngừ…) Vì vậy, cần thiết phải xây dựng qui trình phân tích để xác định Axít domoic nhuyễn nhể mảnh vỏ Ngồi số nghiên cứu số tổ chức khoa học tiêu chuẩn nước với phương pháp sử dụng xác định hàm lượng Axít domoic kỹ thuật HPLCUV LC/MSn, phương pháp sinh hóa chuột Việt nam chưa có tiêu chuẩn riêng phương pháp thử cho loại độc tố Vì vấn đề nghiên cứu, cải tiến phương pháp nghiên cứu giới để áp dụng xác định hàm lượng DA nhuyễn thể hai mảnh vỏ, phù hợp với điều kiện Việt nam (nền mẫu phân tích, thiết bị, hóa chất mơi trường … ) cần thiết Nó giúp phòng thử nghiệm ứng dụng thực tế giúp quan chức kiểm soát chặt chẽ dư lượng độc tố để đáp ứng yêu cầu xuất Với khuôn khổ luận văn thạc sĩ chun ngành hóa phân tích, chúng tơi tập trung tìm điều kiện phân tích tối ưu thiết bị LC-MS/MS có LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ CHẠY MẪU NHUYỄN THỂ MẢNH VỎ Hình 56 Sắc ký đồ chạy mẫu nghêu số Giao Thủy – Nam Định Hình 57 Sắc ký đồ chạy mẫu nghêu số Giao Thủy – Nam Định LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình 58 Sắc ký đồ chạy mẫu nghêu số Giao Thủy – Nam Định Hình 59 Sắc ký đồ chạy mẫu nghêu số Tiền Hải – Thái Bình LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình 60 Sắc ký đồ chạy mẫu nghêu số Tiền Hải – Thái Bình Hình 61 Sắc ký đồ chạy mẫu nghêu số Tiền Hải – Thái Bình LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình 62 Sắc ký đồ chạy mẫu Tu Hài Vân Đồn – Quảng Ninh Hình 63 Sắc ký đồ chạy mẫu Điệp số Phan Thiết LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình 64 Sắc ký đồ chạy mẫu Điệp số Phan Thiết Hình 65 Sắc ký đồ chạy mẫu Điệp số Phan Thiết LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình 66 Sắc ký đồ chạy mẫu Sị số Tuy Phong Hình 67 Sắc ký đồ chạy mẫu Sò số Tuy Phong LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình 68 Sắc ký đồ chạy mẫu Sị số Tuy Phong Hình 69 Sắc ký đồ chạy mẫu nghêu số Bình Đại LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình 70 Sắc ký đồ chạy mẫu nghêu số Bình Đại Hình 71 Sắc ký đồ chạy mẫu nghêu số Bình Đại LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình 72 Sắc ký đồ chạy mẫu nghêu số Ba Tri Hình 73 Sắc ký đồ chạy mẫu nghêu số Ba Tri LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình 74 Sắc ký đồ chạy mẫu nghêu số Ba Tri Hình 75 Sắc ký đồ chạy mẫu sị huyết số Thạnh Phú LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHỤ LỤC SẮC KÝ ĐỒ PHÂN TÍCH MẪU NHUYỄN THỂ MẢNH VỎ BẰNG HPLC –UV Hình 76 Đường chuẩn chạy DA HPLC-UV DA Hình 77 Kết chạy mẫu Spiked ppm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DA Hình 78 Kết chạy mẫu Spiked 2.5 ppm Hình 79 Kết chạy mẫu nghêu Giao Thủy – Nam Định LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình 80 Kết chạy mẫu Tu hài Vân Đồn Hình 81 Kết chạy mẫu nghêu Tiền Giang LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình 82 Kết chạy mẫu sị lơng Bà Lụa Hình 83 Kết chạy mẫu sò huyết Bà Lụa LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DA Hình 84 Kết chạy mẫu CRM HPLC Hình 85 Kết chạy mẫu CRM LC-MS/MS LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ...ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN _ Đinh Đăng Huy NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ĐỘC TỐ SINH HỌC BIỂN ASP TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG... luanvanchat@agmail.com phịng thí nghiệm để ? ?Nghiên cứu định lượng độc tố sinh học biển ASP (Axít domoic) thủy sản sản phẩm thủy sản phương pháp sắc ký lỏng ghép lần khối phổ? ?? thực phân tích số mẫu nhuyễn... Visible Sắc ký lỏng hiệu cao LC- MS/ MS LOD LOQ NPLC ND RPLC SPE TFA UV VIS iii Sắc ký lỏng ghép lần khối phổ Giới hạn phát Giới hạn định lượng Sắc ký lỏng pha thuận Không phát Sắc ký lỏng pha