(TIỂU LUẬN) xác ĐỊNH SALBUTAMOL TRONG mẫu THỊT BẰNG PHƯƠNG PHÁP sắc ký KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ (GCMS)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÚC TRÌNH THỰC TẬP KỸ THUẬT PHÂN TÍCH VÀ THIẾT BỊ (CS127) BÀI 2: XÁC ĐỊNH SALBUTAMOL TRONG MẪU THỊT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ (GC/MS) (Tác giả: Trần Nguyễn An Sa Nguyễn Trang Vi Hậu) CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS Nguyễn Đức Độ SINH VIÊN THỰC HIỆN Mai Thanh Thảo B1904601 Trương Ngọc Thảo B1904603 Nguyễn Thị Thi B1904607 Dương Quốc Thanh B1904596 Cần Thơ, tháng 5/2021 Tieu luan XÁC ĐỊNH SALBUTAMOL TRONG MẪU THỊT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ (GC/MS) I Giới thiệu: Chất tăng trọng hay chất tạo nạc hợp chất hóa học thuộc họ β – agonist xếp vào loại chất cấm sử dụng chăn ni tồn giới Họ β – agonist, điển hình salbutamol, hợp chất tổng hợp phenethanolamine Trong y học, salbutamol sử dụng tác nhân dùng điều trị bệnh hô hấp, dùng cho người với tên biệt dược albuterol, salbutamol, Trong chăn nuôi, dược liệu đưa vào thức ăn gia súc nhằm giảm lớp mỡ da, tăng cơ, tăng trọng vật nuôi Theo nhiều nghiên cứu, salbutamol gây hại cho gia súc người ăn phải thịt vật ni có sử dụng loại thức ăn có trộn salbutamol, chất kích thích mạnh, làm suy nhược chức gan Trong thời gian qua, giới Việt Nam có số báo cáo phương pháp phân tích salbutalmol đối tượng mẫu kiểm nghiệm khác nhằm xác định tồn dư thuốc, đánh giá hiệu việc sử dụng thuốc chăn ni, liều an tồn gia súc, gia cầm người.Các phương pháp phân tích sử dụng bao gồm định tính kỹ thuật ELISA mẫu thức ăn chăn nuôi, định lượng phương pháp GC/MS mẫu thịt, thức ăn chăn nuôi với chất nội chuẩn ethyltesttosterone phương pháp HPLC/MS xác định salbutamol mẫu thức ăn gia súc dư lượng thịt, nước tiểu, mẫu sữa Đối với phương pháp GC/MS sử dụng nội chuẩn salbutamol – d3 có nhiều nghiên cứu đề cập tập trung nhiều vào salbutamol mẫu đơn giản mẫu thức ăn gia súc, mẫu nước tiểu gia súc, riêng mẫu thịt, qui trình phân tích chưa tối ưu điều kiện phân tích thiết bị Agilent 7890N thẩm định phương pháp II Lược khảo tài liệu Sơ lược Salbutamol Salbutamol (INN) albuterol (Usan) chất chủ vận thụ thể β2-adrenergic sử đụng để làm giảm co thắt phế quản bệnh hen suyễn bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính (COPD) Đây nhóm thuốc giãn phế quản đường uống giúp làm giãn đường dẫn khí (phế quản) phổi Các loại thuốc giúp giảm ho, thở khị khè, thở khơng sâu, thở khó có nhiều khí ống phế quản Salbutamol (INN) albuterol (Usan) chất chủ vận thụ thể β2-adrenergic sử đụng để làm giảm co thắt phế quản bệnh hen suyễn bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính (COPD) Sơ lược GC-MS Tieu luan GC-MS kết hợp thành công kỹ thuật GC (sắc ký khí) MS (khối phổ), Phân tích GC-MS/MS thực chất lỏng, khí chất rắn Đối với chất lỏng, mẫu tiêm trực tiếp vào GC Đối với khí, ống tiêm kín khí sử dụng để chuyển thành phần khí trực tiếp vào GC Đối với chất rắn, phân tích thực cách chiết xuất dung môi, thải khí ngồi phân tích nhiệt phân Các chất phân tích quan tâm sau định lượng thơng qua việc so sánh với chất chuẩn bên bên Các nghiên cứu nước Nguyễn Thị Hà ctv., 2016 Nghiên cứu xây dựng phương pháp xác định đồng thời Salbutamol, Ractopamine Clenbuterol thức ăn chăn nuôi kỹ thuật sắc ký lỏng siêu hiệu hai lần khối phổ Tạp chí Khoa học ĐHQGHN: Các Khoa học Trái đất Môi trường, Tập 32, Số (2016) 1-6.Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN J.Physiol, 2018 Beta2‐adrenoceptor agonist Salbutamol increases protein turnover rates and alters signalling in skeletal muscle after resistance exercise in young men The Jounal of Physiology 596(17): 4121–4139 US National Library of Medicine National Institutes of Health III Phương tiện phương pháp Vật liệu, phương tiện, hóa chất Hóa chất sử dụng cho nghiên cứu loại tinh khiết dành cho phân tích GC: Methanol HPLC (Merck, grade ≥ 99,8%); Acetonitril HPCL (Merck, grade ≥ 99,8%); Ethyl acetate (Merck, 99,5%); Sabutamol.HCl (Dr.Ehrensofer, ≥ 98% GC); Salbutamol – d3.HCl (Dr.Ehrensofer, ≥ 98% GC); BSTFA (1% TMCS) (Dr.Ehrensofer, ≥ 98% GC); Amonium hydroxide (Merck, 25%); Natri acetat (Merck, 99,5%); Acid acetic (Merck, 99,8%) Phương tiện: Máy sắc ký Agilent 7890A với đầu dò MSD 5975C, khí mang heli, cột HP – 5MS Agilent Các phương pháp bố trí thí nghiệm 2.1 Chuẩn bị mẫu Dung dịch chuẩn dùng làm khảo sát thông số: từ dung dịch chuẩn salbutamol 1000 ppm, pha thành 100 µL dung dịch chuẩn salbutamol ppm, thêm 100 µL nội chuẩn salbutamol d3, mL methanol, vào vial 1,5 mL Đối với mẫu: cân 10 g mẫu thịt, chiết với methanol môi trường đệm acetat (pH 5,2), lắc voltex, ly tâm 2500 vòng/phút 20 oC 15 phút, làm cách cho qua cột PCX, dung dịch rửa giải etylacetat/acetonitril/ammonium hydroxide (90:10:5) Thổi khô dung dịch chiết khí nitơ 40 oC, hịa tan mL methanol, chuyển hết vào vial 1,5 mL, thêm 100 µL nội chuẩn salbutamol d3 Tieu luan Máy sắc ký Agilent 7890A với đầu dò MSD 5975C 2.2 Cột chương trình nhiệt phân tích a Cột HP–5MS Agilent, thành phần pha tĩnh 5% phenyl 95% dimethylpolysiloxane (30 m × 0,25 mm × 0,25 m), khí mang heli b Chương trình nhiệt: 120oC giữ 0,1 phút, tăng 150C/phút đến 245oC, tăng 30oC/phút đến 300oC giữ 10 phút Gồm chương trình nhiệt Sắc ký đồ xác định salbutamol với chương trình nhiệt Khi sử dụng chương trình (100 ºC giữ 1,5 phút, tăng 10 ºC /phút đến 280 ºC, tăng ºC /phút đến 300 ºC) peak dẫn xuất clenbuterol, clenbuterol d9 với thuốc thử tách khỏi peak dẫn xuất salbutamol, salbutamol d3 dẫn xuất salbutamol khơng tách hồn tồn khỏi salbutamol d3, với thời gian lưu (tR) clenbuterol, clenbuterol d9, salbutamol, salbutamol d3 8,332; 8,272 8,505; 8,512 Sắc ký đồ xác định salbutamol với chương trình nhiệt Tieu luan Khi thay đổi chương trình nhiệt hệ thống tiến hành chạy sắc ký với chương trình nhiệt sau: 120 ºC giữ 0,1 phút, tăng 15 ºC/phút đến 245 ºC, tăng 30 ºC/phút đến 300 ºC giữ 10 phút, cho thấy peak dẫn xuất salbutamol, salbutamol d3 với thuốc thử khơng tách khỏi So với chương trình 1, chương trình có hiệu suất tách tương đương với thời gian tách ngắn IV Kết thảo luận Biểu đồ sắc ký Hình Sắc ký đồ tổng hỗn hợp 16 PAH nồng độ 1000 ng/mL Nồng độ chất có mẫu Bảng Độ lặp lại độ thu hồi PAH mẫu thịt Nồng độ 20 µg/kg Nồng độ 100 µg/kg RSD% R% RSD% R% Naphthalen 6,4 92,6 12 102 Acenaphthylen 8,2 96,5 11 103 Acenaphthen 14 90,4 12 90,6 Fluoren 5,8 89,1 11 93,9 5,2 93,8 12 97,9 Chất phân tích Phenanthren anthracen Tieu luan Fluoranthen 3,6 91,3 12 98,5 Pyren 2,7 84,8 11 89,7 4,7 92,8 12 95,4 5,0 89,0 7,3 93,0 6,7 88,2 7,1 91,7 4,3 85,6 3,3 96,3 5,2 93,6 4,8 80,2 Benzo(a)anthracen chrysen Benzo(b)flouranthen Benzo(k)flouranthen Benzo(a)pyren Indeno(1,2,3c,d)pyren Dibenzo(a,h)anthracen Benzo(g,h,i)perylen Chú thích: RSD: độ lệch chuẩn tương đối, R%: độ thu hồi Phổ khối lượng Kết khảo sát thể Hình cho thấy có mảnh ion 73, 86, 369 372 Khi so sánh với thư viện NIST, mảnh m/z = 73 86 salbutamol salbutamol d3 trùng nhau, mảnh m/z = 369 salbutamol 372 salbutamol d3 tách biệt rõ rệt (Hình 4) Do chúng tơi chọn mảnh m/z = 369 mảnh ion định lượng salbutamol, mảnh ion 372 mảnh ion định lượng cho salbutamol d3 theo chương trình chế độ SIM So sánh tài liệu tham khảo [14, 15], chương trình nhiệt lựa chọn có hiệu sắc ký tương đương thời gian tách ngắn hơn, tiết kiệm thời gian hóa chất Hình2 Khối phổ đồ chuẩn salbutamol salbutamol d3 Kết xây dựng đường chuẩn khảo sát LOD, LOQ dựa vào đường chuẩn Tieu luan Đánh giá phù hợp đường chuẩn với thực nhiệm dựa vào việc kiểm định theo chuẩn Student: từ phương trình đường chuẩn: r = 0,9994; adjusted r = 0,988; tTN = 15,72 So sánh tTN với t0,99, f = t0,99,3 = 5,84: phương trình hồi quy phù hợp với thực nghiệm Đồ thị biểu diễn đường chuẩn salbutamol với dẫn xuất (BSTFA:TMCS) Tieu luan Từ phương trình hồi quy Hình 5, tính LOD, LOQ theo cơng thức (1), kết thu được: : LOD = 0,12 ppb, LOQ = 0,41 ppb Dựa vào qui trình xử lý mẫu sơ đồ 1, LOD LOQ mẫu là: 0,018 ppb 0,049ppb Công thức cấu tạo đồng phân R-Salbutamol V Kết luận Kết nghiên cứu khảo sát qui trình phân tích salbutamol phương pháp GC/MS sử dụng nội chuẩn đồng vị Salbutamol – d3 thu kết sau: chế độ quét phổ: SIM; chương trình nhiệt: 120 ºC giữ 0,1 phút, tăng 15 ºC /phút đến 245 ºC, tăng 30 ºC /phút đến 300 ºC giữ 10 phút; chế độ tiêm mẫu: Splitless; LOD LOQ đường chuẩn LOD = 0,12 ppb, LOQ = 0,41 ppb, khoảng tuyến tính từ 10 ppb – 200 ppb, LOD LOQ mẫu là: 0,018 ppb 0,049 ppb So sánh với tài liệu tham khảo [14, 15] cho thấy phương pháp thu tối ưu hơn, độ nhạy cao Tuy nhiên, nghiên cứu nhiều hạn chế, cần khảo sát thêm số vấn đề sau: tạo dẫn xuất với số thuốc thử khác như: MSTFA, (MSTFA: NH4I: DTE),…; lựa chọn cột chiết có khả chiết tốt nhất; lựa chọn dung mơi chiết để chiết hoàn toàn salbutamol khỏi mẫu; khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng tạo dẫn xuất như: thời gian, nhiệt độ, phân tích mẫu chuẩn chứng nhận CRM (Certified Reference Material) VI Tài liệu tham khảo Trần Nguyễn An Sa, Nguyễn Trang Vi Hậu, 2017 Xác định Salbutamol mẫu thịt phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (gc/ms) Tạp chí Khoa học cơng nghệ Thực phẩm: 12 (1) (2017): 73-80 Tieu luan Tạp chí Khoa học cơng nghệ Thực phẩm 12 (1) (2017) 73-80 XÁC ĐỊNH SALBUTAMOL TRONG MẪU THỊT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ (GC/MS) Trần Nguyễn An Sa*, Nguyễn Trang Vi Hậu Trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm TP.HCM *Email: satna@cntp.edu.vn Ngày nhận bài: 29/6/2017; Ngày chấp nhận đăng: 18/9/2017 TÓM TẮT Nội dung nghiên cứu báo cáo khảo sát điều kiện tối ưu qui trình xác định salbutamol mẫu thịt phương pháp GC/MS với hệ thống thiết bị Agilent 7890N, đầu dò MSD 5975C, cột mao quản khảo sát HP – 5MS Các điều kiện khảo sát bao gồm: khảo sát thông số hệ thống GC/MS; xây dựng đường chuẩn khảo sát LOD, LOQ dựa vào đường chuẩn; LOD, LOQ mẫu, khảo sát hiệu suất thu hồi quy trình Kết khảo sát thu qui trình phân tích với chế độ qt phổ: SIM; chương trình nhiệt: 120 oC giữ 0,1 phút, tăng 15 oC/phút đến 245 oC, tăng 30 oC/phút đến 300 oC giữ 10 phút; chế độ tiêm mẫu: Splitless; LOD = 0,12 ppb, LOQ = 0,41 ppb, khoảng tuyến tính từ 10 ppb – 200 ppb, LOD LOQ mẫu là: 0,018 ppb 0,049 ppb Từ khóa: Salbutamol, salbutamol – d3, GC/MS, mẫu thịt, SIM MỞ ĐẦU Chất tăng trọng hay chất tạo nạc hợp chất hóa học thuộc họ β – agonist xếp vào loại chất cấm sử dụng chăn nuôi tồn giới Họ β – agonist, điển hình salbutamol, hợp chất tổng hợp phenethanolamine Trong y học, salbutamol sử dụng tác nhân dùng điều trị bệnh hô hấp, dùng cho người với tên biệt dược albuterol, salbutamol [1], Trong chăn nuôi, dược liệu đưa vào thức ăn gia súc nhằm giảm lớp mỡ da, tăng cơ, tăng trọng vật nuôi Theo nhiều nghiên cứu, salbutamol gây hại cho gia súc người ăn phải thịt vật ni có sử dụng loại thức ăn có trộn salbutamol, chất kích thích mạnh, làm suy nhược chức gan [2] Từ lâu, salbutamol chất bị cấm sử dụng chăn nuôi theo định Tổ chức Y tế giới, Tổ chức lương thực nông nghiệp Liên hợp quốc Vào tháng 7/1997, Châu Âu cấm sử dụng β – agonist (ngoại trừ dùng làm thuốc thú y) Ở Việt Nam, loại dược liệu thuộc nhóm β – agonist có salbutamol xếp vào danh mục 18 hóa chất bị cấm Bộ nông nghiệp phát triển nông thôn Tuy nhiên, chất bị phận người dân sử dụng chăn ni, đó, sau có thơng tin việc ngun liệu salbutamol có khả bị sử dụng sai mục đích chăn ni, Bộ Y tế tích cực thực biện pháp để ngăn chặn việc lạm dụng, sử dụng sai mục đích nguyên liệu làm thuốc, đặc biệt với trường hợp salbutamol Cục quản lý dược có Cơng văn số 21590/QLD-KD ngày 20/11/2015 thơng báo đến sở nhập khẩu, Sở Y tế, Tổng cục hải quan việc tạm ngừng nhập nguyên liệu salbutamol [3-5] 73 Tieu luan Trần Nguyễn An Sa, Nguyễn Trang Vi Hậu Trong thời gian qua, giới Việt Nam có số báo cáo phương pháp phân tích salbutalmol đối tượng mẫu kiểm nghiệm khác nhằm xác định tồn dư thuốc, đánh giá hiệu việc sử dụng thuốc chăn ni, liều an tồn gia súc, gia cầm người [6] Các phương pháp phân tích sử dụng bao gồm định tính kỹ thuật ELISA mẫu thức ăn chăn nuôi [7], định lượng phương pháp GC/MS mẫu thịt, thức ăn chăn nuôi với chất nội chuẩn 17-ethyltesttosterone [8-10]; phương pháp HPLC/MS xác định salbutamol mẫu thức ăn gia súc dư lượng thịt [2, 11], nước tiểu [12], mẫu sữa [13] Đối với phương pháp GC/MS sử dụng nội chuẩn salbutamol – d3 có nhiều nghiên cứu đề cập [14-16] tập trung nhiều vào salbutamol mẫu đơn giản mẫu thức ăn gia súc, mẫu nước tiểu gia súc, riêng mẫu thịt, qui trình phân tích chưa tối ưu điều kiện phân tích thiết bị Agilent 7890N thẩm định phương pháp [17] NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu 2.1.1 Thiết bị Máy sắc ký Agilent 7890A với đầu dị MSD 5975C, khí mang heli, cột HP – 5MS Agilent, thành phần pha tĩnh 5% phenyl – 95% dimethylpolysiloxane (30 m × 0,25 mm × 0,25 m) 2.1.2 Hóa chất Hóa chất sử dụng cho nghiên cứu loại tinh khiết dành cho phân tích GC: Methanol HPLC (Merck, grade ≥ 99,8%); Acetonitril HPCL (Merck, grade ≥ 99,8%); Ethyl acetate (Merck, 99,5%); Sabutamol.HCl (Dr.Ehrensofer, ≥ 98% GC); Salbutamol – d3.HCl (Dr.Ehrensofer, ≥ 98% GC); BSTFA (1% TMCS) (Dr.Ehrensofer, ≥ 98% GC); Amonium hydroxide (Merck, 25%); Natri acetat (Merck, 99,5%); Acid acetic (Merck, 99,8%) 2.2 Phương pháp 2.2.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn mẫu Dung dịch chuẩn dùng làm khảo sát thông số: từ dung dịch chuẩn salbutamol 1000 ppm, pha thành 100 µL dung dịch chuẩn salbutamol ppm, thêm 100 µL nội chuẩn salbutamol d3, mL methanol, vào vial 1,5 mL Đối với mẫu: cân 10 g mẫu thịt, chiết với methanol môi trường đệm acetat (pH 5,2), lắc voltex, ly tâm 2500 vòng/phút 20 oC 15 phút, làm cách cho qua cột PCX, dung dịch rửa giải etylacetat/acetonitril/ammonium hydroxide (90:10:5) Thổi khơ dung dịch chiết khí nitơ 40 oC, hòa tan mL methanol, chuyển hết vào vial 1,5 mL, thêm 100 µL nội chuẩn salbutamol d3 2.2.2 Khảo sát thông số hệ thống GC/MS Để khảo sát thông số hệ thống, tạo dẫn xuất salbutamol salbutamol d3 với BSTFA:TMCS (99:1) môi trường đệm acetat, chiết dẫn xuất tiến hành chạy sắc ký với chương trình nhiệt chế độ chia dịng khác 2.2.3 Xây dựng đường chuẩn khảo sát LOD, LOQ dựa vào đường chuẩn Do điều kiện thí nghiệm hạn chế (dẫn xuất đồng vị d3 có giá thành cao) nên đường chuẩn nồng độ salbutamol 10 ppb Bên cạnh đó, salbutamol chất cấm, khơng có thực phẩm theo tiêu chuẩn Việt Nam nên để đánh giá khoảng tuyến tính xây dựng đường chuẩn cần khảo sát với khoảng nồng độ salbutamol  200 ppb 74 Tieu luan Xác định salbutamol mẫu thịt phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) 2.2.4 Khảo sát hiệu suất thu hồi qui trình phân tích mẫu Dung dịch chuẩn 100 ppb (pha từ dung dịch salbutamol 1000 ppm) dùng để đánh giá độ xác đường chuẩn hiệu suất thu hồi phương pháp Để đánh giá hiệu suất thu hồi qui trình: cân 10 g mẫu thịt, thêm 0,1 mL dung dịch chuẩn salbutamol 100 ppb 0,1 mL dung dịch nội chuẩn salbutamol d3 100 ppb Chiết salbutamol mẫu thêm chuẩn không thêm chuẩn với dung môi methanol môi trường đệm acetat Cơ khơ mẫu dịng khí nitơ, thêm thuốc thử (BSTFA:TMCS) tạo dẫn xuất với salbutamol nội chuẩn salbutamol d3 Tiêm mẫu vào máy sắc ký với thể tích mẫu L KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết khảo sát thông số hệ thống GC/MS Do salbutamol clenbuterol thuộc họ β – agonic, nên thường xác định đồng thời salbutamol clenbuterol điều kiện Kết sắc ký đồ thể Hình cho thấy sử dụng chương trình (100 ºC giữ 1,5 phút, tăng 10 ºC /phút đến 280 ºC, tăng ºC /phút đến 300 ºC) peak dẫn xuất clenbuterol, clenbuterol d9 với thuốc thử tách khỏi peak dẫn xuất salbutamol, salbutamol d3 dẫn xuất salbutamol không tách hoàn toàn khỏi salbutamol d3, với thời gian lưu (tR) clenbuterol, clenbuterol d9, salbutamol, salbutamol d3 8,332; 8,272 8,505; 8,512 Hình Sắc ký đồ xác định salbutamol với chương trình nhiệt Kết sắc ký đồ thu (Hình 2) thay đổi chương trình nhiệt hệ thống tiến hành chạy sắc ký với chương trình nhiệt sau: 120 ºC giữ 0,1 phút, tăng 15 ºC/phút đến 245 ºC, tăng 30 ºC/phút đến 300 ºC giữ 10 phút, cho thấy peak dẫn xuất salbutamol, salbutamol d3 với thuốc thử không tách khỏi So với chương trình 1, chương trình có hiệu suất tách tương đương với thời gian tách ngắn Kết khảo sát chương trình 2: peak dẫn xuất chuẩn salbutamol, nội chuẩn đồng vị salbutamol d3 với thuốc thử (BSTFA:TMCS) có tượng khơng tách hồn tồn khỏi Sử dụng sắc ký đồ khơng tách peak salbutamol đồng vị có tính chất hóa học gần giống nên xuất lúc, khó tách Do tiếp tục lấy khối phổ dẫn xuất tạo thành, khảo sát mảnh ion định lượng cho salbutamol salbutamol d3 theo chương trình chế độ quét phổ SCAN 75 Tieu luan Trần Nguyễn An Sa, Nguyễn Trang Vi Hậu Hình Sắc ký đồ xác định salbutamol với chương trình nhiệt Kết khảo sát thể Hình cho thấy có mảnh ion 73, 86, 369 372 Khi so sánh với thư viện NIST, mảnh m/z = 73 86 salbutamol salbutamol d3 trùng nhau, mảnh m/z = 369 salbutamol 372 salbutamol d3 tách biệt rõ rệt (Hình 4) Do chúng tơi chọn mảnh m/z = 369 mảnh ion định lượng salbutamol, mảnh ion 372 mảnh ion định lượng cho salbutamol d3 theo chương trình chế độ SIM So sánh tài liệu tham khảo [14, 15], chương trình nhiệt lựa chọn có hiệu sắc ký tương đương thời gian tách ngắn hơn, tiết kiệm thời gian hóa chất 100 372 86 50 57 95 117 147 207 286 353 308 80 120 160 200 240 280 320 360 (Text File) Scan 242 (8.517 min): SCAN HH STD 100PPB D\ data.ms 405 443 477 499 400 440 480 Hình Khối phổ đồ chuẩn salbutamol salbutamol d3 369 100 86 100 O 73 Si Si O 50 372 73 86 NH 50 O Si 57 104 147 161 207 80 120 160 200 240 (mainlib) Salbutamol, tris(trimethylsilyl) ether 57 265 293 280 117 350 320 360 440 400 440 147 207 265 297 80 120 160 200 240 280 320 (Text File) Scan 241 (8.507 min): SCAN HH STD 100PPB D\data.ms 480 360 Hình Khối phổ đồ chuẩn salbutamol salbutamol d3 tra từ thư viện NIST 76 Tieu luan 401 443 400 440 Xác định salbutamol mẫu thịt phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) Kết khảo sát chế độ chia dòng tỉ lệ chia dòng 2:1, 5:1, 10:1, 20:1 với chương trình chế độ quét phổ SIM thể Bảng So sánh diện tích peak tỉ lệ tín hiệu/ nhiễu chế độ tiêm mẫu chia dòng khơng chia dịng tỉ lệ khác cho thấy: chế độ tiêm mẫu khơng chia dịng cho cường độ tín hiệu tỉ lệ tín hiệu/ nhiễu cao nhất, đảm bảo độ nhạy phương pháp Bảng Diện tích peak tỉ lệ tín hiệu đo với chế độ Split (chia dòng) Dung dịch đo Tỉ lệ chia dịng Chất phân tích 2:1 5:1 Chuẩn salbutamol 100 ppb dung môi 10:1 20:1 2:1 Chuẩn salbutamol ppb mẫu 5:1 10:1 20:1 Diện tích peak (S) Salbutamol 11275 Salbutamol d3 19163 Salbutamol 5991 Salbutamol d3 10355 Salbutamol 3486 Salbutamol d3 5883 Salbutamol 1798 Salbutamol d3 3086 Salbutamol 10019 Salbutamol d3 17021 Salbutamol 5365 Salbutamol d3 8829 Salbutamol 2785 Salbutamol d3 4600 Salbutamol 1461 Salbutamol d3 2408 Tỉ lệ tín hiệu / nhiễu (S/N) 1251,9 1068,9 582,7 268,0 250,3 290,4 220,0 246,8 Bảng Diện tích peak tỉ lệ tín hiệu đo với chế độ Splitless (khơng chia dịng) Dung dịch đo Diện tích peak (S) Chuẩn salbutamol 100 ppb dung môi Chuẩn salbutamol ppb mẫu 35482 (Salbutamol) 55539 (Salbutamol d3) 22944 (Salbutamol) 37893 (Salbutamol d3) Tỉ lệ tín hiệu/nhiễu 1293,9 507,6 3.2 Kết xây dựng đường chuẩn khảo sát LOD, LOQ dựa vào đường chuẩn Đánh giá phù hợp đường chuẩn với thực nhiệm dựa vào việc kiểm định theo = 0,988; tTN = 15,72 So chuẩn Student: từ phương trình đường chuẩn: r2 = 0,9994; radjusted sánh tTN với t0,99, f = t0,99,3 = 5,84: phương trình hồi quy phù hợp với thực nghiệm 77 Tieu luan Trần Nguyễn An Sa, Nguyễn Trang Vi Hậu Hình Đồ thị biểu diễn đường chuẩn salbutamol với dẫn xuất (BSTFA:TMCS) Từ phương trình hồi quy Hình 5, tính LOD, LOQ theo công thức (1), kết thu được: LOD = 0,12 ppb, LOQ = 0,41 ppb LOD = t 0,99,f=N+m-2  Sresidue b N+m LOD ; LOQ = 10× Nm (1) Dựa vào qui trình xử lý mẫu sơ đồ 1, LOD LOQ mẫu là: 0,018 ppb 0,049 ppb Theo thông tư số 01/2016/TT – BNNPTNT ngày 15/2/2016 quy định mẫu dương tính theo phương pháp định lượng, hàm lượng giới hạn tối đa cho phép salbutamol thịt < ppb [3] Thông thường, giá trị LOD phải thấp giá trị giới hạn tối đa cho phép khoảng 10 lần đảm bảo độ tin cậy Dựa vào LOD tính nhỏ 10 lần giới hạn tối đa cho phép, đó, phương pháp xác định đáng tin cậy So sánh với tài liệu tham khảo phương pháp phân tích thu đạt độ nhạy cao hơn, giới hạn phát thấp hơn, áp dụng để xác định salbutamol thực tế [14,15] Sơ đồ Qui trình xử lý mẫu thịt xác định salbutamol 78 Tieu luan Xác định salbutamol mẫu thịt phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) 3.3 Kết khảo sát hiệu suất thu hồi quy trình phân tích mẫu thật Kết thu từ trình khảo sát hiệu suất thu hồi mẫu thịt, cho thấy salbutamol mẫu cho hiệu suất thu hồi 100,7% thuộc khoảng chấp nhận (80%  H  110%) Do đó, quy trình áp dụng xác định salbutamol mẫu thịt Để xác định salbutamol có mẫu, chúng tơi tiến hành chiết salbutamol tạo dẫn xuất với (BSTFA:TMCS) Kết phân tích mẫu theo quy trình xác định salbutamol với thuốc thử (BSTFA:TMCS) cho thấy hàm lượng salbutamol mẫu thịt có hàm lượng ngưỡng phát phương pháp Do phù hợp với quy định hàm lượng tồn dư salbutamol cho phép mẫu thịt theo Thông tư 01/2016 Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn KẾT LUẬN Kết nghiên cứu khảo sát qui trình phân tích salbutamol phương pháp GC/MS sử dụng nội chuẩn đồng vị Salbutamol – d3 thu kết sau: chế độ quét phổ: SIM; chương trình nhiệt: 120 ºC giữ 0,1 phút, tăng 15 ºC /phút đến 245 ºC, tăng 30 ºC /phút đến 300 ºC giữ 10 phút; chế độ tiêm mẫu: Splitless; LOD LOQ đường chuẩn LOD = 0,12 ppb, LOQ = 0,41 ppb, khoảng tuyến tính từ 10 ppb – 200 ppb, LOD LOQ mẫu là: 0,018 ppb 0,049 ppb So sánh với tài liệu tham khảo [14, 15] cho thấy phương pháp thu tối ưu hơn, độ nhạy cao Tuy nhiên, nghiên cứu nhiều hạn chế, cần khảo sát thêm số vấn đề sau: tạo dẫn xuất với số thuốc thử khác như: MSTFA, (MSTFA: NH4I: DTE),…; lựa chọn cột chiết có khả chiết tốt nhất; lựa chọn dung mơi chiết để chiết hoàn toàn salbutamol khỏi mẫu; khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng tạo dẫn xuất như: thời gian, nhiệt độ, phân tích mẫu chuẩn chứng nhận CRM (Certified Reference Material) TÀI LIỆU THAM KHẢO Chen C., Li H., Fan Y - Determination of salbutamol sulfate in medicaments by capillary electrophoresis with contactless conductivity detection, Se Pu 29 (2) (2011) 137-140 Liu Caiyun, Wang Long - Research on determination of clenbuterol and salbutamol in pork by SPE/HPLC, International Conference on New Technology of Agricultural Engineering, 2011 Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn - Thông tư số 28/2014/TT-BNNPTNT Ban hành danh mục hóa chất, kháng sinh cấm nhập khẩu, sản xuất, khinh doanh sử dụng thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm Việt Nam, 2014 Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn - Thông tư 01/2016/TT-BNNPTNT Sửa đổi, bổ sung số điều thông tư số 57/2012/BNNPTNT ngày 07/11/2012 Quy định việc kiểm tra, giám sát xử lý vi phạm chất cấm thuộc nhóm Beta-agonist chăn ni, 2016 Cục Quản lý dược - Công văn số 21590/QLD-KD việc tạm ngừng nhập nguyên liệu salbutamol clenbuterol, Bộ Y tế, 2015 Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results, 2002, pp 8-35 Đoàn Thị Khang - Ứng dụng kỹ thuật ELISA để xác định clenbuterol salbutamol thức ăn chăn ni, Viện Chăn ni, Tạp chí Khoa học Công nghệ Chăn nuôi, Số 13, Tháng 8/2008 79 Tieu luan Trần Nguyễn An Sa, Nguyễn Trang Vi Hậu Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm TP HCM - Quyết định việc quy định bước xác định hàm lượng chất clenbuterol salbutamol, 16/04/2012 Chu Vân Hải - Phân tích chất kích thích tăng trưởng họ β-agonist (clenbuterol salbutamol) thịt heo, gan heo, thức ăn nuôi heo phương pháp sắc ký ghép khối phổ GC/MS, Trung tâm dịch vụ phân tích thí nghiệm TP HCM, 2008 10 Chu Phạm Ngọc Sơn - Tài liệu tập huấn sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS, 03/2016 11 Nguyễn Thị Thu Thủy - Đánh giá hàm lượng chất β- agonist (clenbuterol salbutamol) thức ăn gia súc dư lượng thịt gia súc kỹ thuật sắc ký lỏng ghép khối phổ, Luận án Tiến sĩ, Đại học Khoa học Tự nhiên TP HCM, 2011 12 Zhang X.Z., Gan Y.R., Zhao F.N - Determination of salbutamol in human plasma and urine by high-performance liquid chromatography with a coulometric electrode array system, Journal of Chromatographic Science 42 (5) (2004) 263-267 13 Li C., Wu Y L, Yang T., Zhang Y., Huang-Fu W.G - Simultaneous determination of clenbuterol, salbutamol and ractopamine in milk by reversed-phase liquid chromatography tandem mass spectrometry with isotope dilution, Journal of Chromatography A 1217 (50) (2010) 7873-7877 14 TCVN : 2014, Thực phẩm – xác định dư lượng β2- agonist thịt gia súc – Phương pháp sắc ký ghép hai lần khối phổ 15 Cơ quan Kiểm tra vệ sinh thú y Trung ương II - Xác định dư lượng salbutamol, clenbuterol thịt nước tiểu gia súc phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS, Tài liệu lưu hành nội bộ, 2016 16 Montrade M P., Monteau F., Siliart B., Andre F.- Multi-residue analysis for β-agonistic drugs in urine of meat-producing animals by gas chromatography-mass spectrometry, Analytica Chimica Acta 275 (1–2) (1993) 253-268 17 Trần Cao Sơn - Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội, 2010 ABSTRACT DETERMINATION OF SALBUTAMOL IN MEAT SAMPLES WITH GC-MS METHOD An-Sa Tran Nguyen*, Vi-Hau Nguyen Trang Ho Chi Minh City University of Food Industry *Email: satna@cntp.edu.vn The optimal conditions for determination of salbutamol in meat samples by GC/MS method with Agilent 7890N system, MSD 5975C, HP – 5MS have been investigated The parameters for the column oven, injector, detector, limit of detection (LOD), and limit of quantitation (LOQ), recovery performance, conditions of sample processing methods have been also examined The results of the survey were obtained with the scanning mode: SIM; program heat: 120 ºC (0,1 min), increase 15 ºC/min to 245 ºC, increase 30 ºC /min to 300 ºC for 10 minutes; injection mode: splitless; LOD = 0.12 ppb, LOQ = 0.41 ppb, linear range from 10 ppb to 200 ppb, LOD and LOQ on the sample were 0.018 ppb and 0.049 ppb, respectively, and the recovery of method: 100.7 % Key words: Salbutamol, Salbutamol – d3, GC/MS, meat samples, SIM 80 Tieu luan ... trình xử lý mẫu thịt xác định salbutamol 78 Tieu luan Xác định salbutamol mẫu thịt phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) 3.3 Kết khảo sát hiệu suất thu hồi quy trình phân tích mẫu thật Kết... D\data.ms 480 360 Hình Khối phổ đồ chuẩn salbutamol salbutamol d3 tra từ thư viện NIST 76 Tieu luan 401 443 400 440 Xác định salbutamol mẫu thịt phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) Kết khảo... Tieu luan Xác định salbutamol mẫu thịt phương pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC/MS) 2.2.4 Khảo sát hiệu suất thu hồi qui trình phân tích mẫu Dung dịch chuẩn 100 ppb (pha từ dung dịch salbutamol