XÁC ĐỊNH LD50 của cá TRA (pangasianodon hypophthalmus) bị NHIỄM VI KHUẨN edwardsiella ictaluri

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN LÊ THƯỢNG KHỞI XÁC ĐỊNH LD50 CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) BỊ NHIỄM VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN LÊ THƯỢNG KHỞI XÁC ĐỊNH LD50 CỦA CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) BỊ NHIỄM VI KHUẨN Edwardsiella ictaluri LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ts ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH ĐẶNG THỤY MAI THY NGUYỄN TRÚC PHƯƠNG 2009 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Khoa Thủy Sản đặc biệt thầy cô thuộc môn Sinh học Bệnh học Thủy sản truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báo suốt trình em học tập nghiên cứu trường Xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc Đặng Thị Hồng Oanh, Đặng Thụy Mai Thy, chị Nguyễn Trúc Phương anh, chị môn tận tình hướng dẫn giúp đỡ em nhiều suốt trình thực đề tài tốt nghiệp Đồng thời xin gởi lời cảm ơn đến cô cố vấn Bùi Thị Bích Hằng bạn lớp Bệnh Học Thủy Sản K31 động viên hỗ trợ em thời gian học tập thực đề tài tốt nghiệp i LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÓM TẮT Đề tài “Xác định LD50 cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bị nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri” thực phương pháp tiêm vi khuẩn E ictaluri cá tra giống Nhằm so sánh độc lực chủng vi khuẩn E ictaluri với khảo sát biến đổi mô học gan thận cá tra bị nhiễm vi khuẩn E ictaluri chủng vi khuẩn E ictaluri phục hồi từ tủ âm 800C (A1, T8, CAF258 KSL103) Sau tiến hành tiêm cho cá gồm nghiệm thức lần lặp lại với mật độ 10con/bể Kết thu chủng A1 với tỉ lệ chết cao tất nghiệm thức chết 100% không xác định LD50, chủng CAF258 nồng độ 0,8x107 CFU/ml chết cao 100% thấp nồng độ 0,8x102 CFU/ml tỉ lệ 6% với giá trị LD50 = 4,7x102 CFU/ml Trong chủng T8 nồng độ cao 0,4x107 CFU/ml chết với tỉ lệ 83% nồng độ thấp 0,4x102 CFU/ml tỉ lệ chết 23% với giá trị LD50 = 1,3x104 CFU/ml, chủng KSL103 nồng độ 0,5x107 CFU/ml chết 93% nồng độ 0,5x103 CFU/ml chết 6% với giá trị LD50 = 2,1x104 CFU/ml Quan sát mơ gan cá gây cảm nhiễm có biến đổi, liên kết cấu trúc tế bào gan bị phá hủy, đảo tụy tĩnh mạch gan xung huyết Nhiều vùng tế bào có tượng xuất huyết, bị biến đổi cấu trúc họai tử hạt Cấu trúc ống thận bị vỡ, nhiều vùng bị xuất huyết quản cầu thận bị cấu trúc ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ Nuôi trồng thủy sản ngày phát triển trở thành ngành có đóng góp đáng kể kim ngạch xuất Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) có truyền thống ni cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) từ lâu đời, cá tra nuôi phổ biến ao đất bè Hiện cá tra nuôi hầu hết tỉnh vùng Những năm gần đây, việc nuôi cá tra phát triển mạnh nhằm phục vụ tiêu thụ nội địa cung cấp nguyên liệu cho chế biến xuất Đặc biệt từ giống nhân tạo hoàn toàn chủ động nghề ni ổn định có bước phát triển vượt bậc (Dương Nhựt Long, 2003) Từ 1996-2006, diện tích ni cá tra, basa tăng gấp lần, sản lượng tăng 36,2 lần, từ 22.000 năm 1997 tăng lên 800.000 vào năm 2006 (Nguyễn Trọng Bình, 2008) Sản phẩm thủy sản khơng đáp ứng nhu cầu nước mà xuất giới, năm 2004 nước xuất thủy sản thu 240 triệu USD năm 2006 661 triệu USD Hiện cá tra xuất sang 80 quốc gia vùng lãnh thổ (Bộ Thủy Sản, 2007) Để có sản lượng ngồi việc tăng diện tích ni người ni cịn tăng mật độ làm xuất nhiều loại bệnh bệnh mủ gan, bệnh đốm đỏ, bệnh nhiễm huyết, số bệnh nấm, kí sinh trùng Năm 2007 khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long tần suất xuất bệnh đốm trắng 52,80%, xuất huyết 42,50%, phù đầu, phù mắt 20,70% vàng da 21,60% Trong bệnh đốm trắng xuất nội tạng cá tra gây thiệt hại nghiêm trọng cho người nuôi, bệnh thường xuất tỉnh : An Giang, Đồng Tháp Cần Thơ gây hậu nghiêm trọng Khi cá nhiễm bệnh, tỷ lệ chết tăng cao từ 10-90% lên tới 100% tùy thuộc vào cách quản lý cỡ cá nuôi (Nguyễn Quốc Thịnh ctv, 2003) Hiện có nhiều cơng trình nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa, khả gây bệnh, độc lực vi khuẩn E ictaluri biến đổi mô học vi khuẩn gây nhiều tác giả công bố Tuy nhiên thông tin độc lực vi khuẩn E ictaluri cá tra cịn hạn chế đề tài:“Xác định LD50 cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bị nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri” thực Mục tiêu đề tài nhằm: Xác định độc lực chủng vi khuẩn E ictaluri có nguồn gốc khác nhằm góp phần cung cấp thông tin cho nghiên cứu huyết học, mô bệnh học cá tra Mặt khác đề tài góp phần vào việc chuẩn hóa phương pháp nghiên cứu bệnh vi khuẩn E ictaluri gây cá tra LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nội dung nghiên cứu: Thực thí nghiệm cảm nhiễm xác định LD50 nhóm vi khuẩn E ictaluri có nguồn gốc phân lập khác Biến đổi cấu trúc mô học gan thận cá tra gây cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình bệnh cá tra Cá tra Pangasianodon hypophthalmus loài cá da trơn nước nuôi phổ biến Đồng Bằng Sông Cửu Long, đặc biệt tỉnh An Giang, Đồng Tháp Cần Thơ Theo thống kê Sở tài ngun mơi trường An Giang tồn tỉnh có 750ha đất phát sinh ni thủy sản năm 2007 Năm 2008, diện tích ni cá tra tỉnh Đồng Tháp 1.348ha Đồng Tháp đề năm 2010 diện tích vùng ni cá tra tồn tỉnh 2.309ha, Cần Thơ dự kiến năm 2010 đạt diện tích 1.300ha (www.fistnet.gov.vn) Với tốc độ phát triển nghề ni cá tra nhanh chóng dẫn đến chất lượng nước ngày xấu, môi trường tồn mầm bệnh bốc phát bệnh đủ số lượng điều kiện thuận lợi Theo Lê Phú Khởi (2006) An Giang ghi nhận số bệnh xuất cá tra với tần suất khác từ năm 2004 trở lại là: bệnh đốm đỏ, bệnh mủ gan, ký sinh trùng, thối đuôi, vàng da, đường ruột, nổ mắt, tuột nhớt, bỏ ăn, sưng thận, nấm, thối mang Trong bệnh bệnh mủ gan, đốm đỏ kí sinh trùng xảy với tần suất cao Cịn theo Từ Thanh Dung (2005) tần xuất bệnh động vật thủy sản với vi khuẩn (50,9%), virut (24,6%), kí sinh trùng (21,1%), nấm (3,4%) Năm 2002 tỉ lệ sống cá tra ao khoảng 90% năm 2004 giảm 85% Nguyên nhân làm giảm tỉ lệ sống nguồn nước bị nhiễm, có nhiều bùn bã hữu cơ, đáy không nạo vét nước bẩn dẫn đến dịch bệnh xãy Bệnh xãy cá tra chủ yếu bệnh phù đầu, xuất huyết, đỏ mỏ đỏ kỳ, mủ gan vàng da gây thiệt hại nhiều cho nghề nuôi bệnh đốm đỏ, đỏ mỏ đỏ kỳ, xuất huyết bệnh mủ gan Đặc biệt bệnh mủ gan xuất quanh năm xuất nhiều vào mùa lũ Tỉ lệ hao hút bệnh cao (Nguyễn Thanh Phương ctv, 2004) 2.2 Bệnh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cá tra 2.1.1 Nguyên nhân gây bệnh Bệnh mủ gan (bệnh đốm trắng gan, thận) xuất lần cá tra nuôi Đồng Bằng Sông Cửu Long vào cuối năm 1998 vi khuẩn Edwardsiella ictaluri gây có tên BNP (bacillary necrosis of Pangasius) (Ferguson et al., 2001) Vi khuẩn E ictaluri thuộc họ Enterbacteriaceae vi khuẩn gram âm, hình que mảnh, kích thước 1x2-3µm, khơng sinh bào tử, vi khuẩn yếm khí tùy tiện, phản ứng catalase dương tính, oxidase âm tính, không LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHỤ LỤC Phương pháp xác định tiêu sinh lý, sinh hóa vi khuẩn: Nhuộm Gram Chuẩn bị tiêu bản: Nhỏ giọt nước cất lên lam kính, dùng que cấy nhặt vi khuẩn trải lên giọt nước cất Để khô nhiệt độ phịng sau hơ lướt lam lửa đèn cồn để cố định vi khuẩn lam Các bước thực hiện: Nhỏ dung dịch Crystal violet (dung dịch I ) lên lam Để phút Rửa nước cho hết màu tím lam (khoảng giây), để khô Nhỏ dung dich Iodine (dung dịch II) lên lam, để khoảng phút Lật nghiêng lam kính cho hết dung dịch Iodine lam Dùng dung dịch cồn: aceton (dung dịch III) để tẩy màu cách nghiêng lam kính nhỏ từ từ dung dịch III giọt nước cuối lam khơng cịn màu tím Rửa để khơ Nhỏ dung dịch Safranin (dung dich IV) lên lam, để khoảng phút Rửa để khô nhiệt độ phịng Quan sát vật kính 100X Đọc kết Vi khuẩn Gram dương (G+) có màu tím xanh Vi khuẩn Gram âm (G-) có màu hồng đỏ Quan sát tính di động Sự di động vi khuẩn quan sát phương pháp giọt treo vật kính 40X Các bước thực sau: Cho vaseline lên góc lamelle đặt ngửa lamelle bàn Cho giọt nước lên lame Tiệt trùng que cấy, lấy vi khuẩn cho lên lame hòa vào nước Dùng lame đặt nhẹ nhàng lên lamelle cho lame không chạm vào giọt nước chứa vi khuẩn Cẩn thận lật thật nhanh lame để giọt nước treo ngược lamelle Đặt lam lên kính hiển vi quan sát tính di động vi khuẩn vật kính 40X Phản ứng oxidase: dùng dung dịch oxidase Dùng que cấy phết vi khuẩn lên giấy lọc tẩm dung dịch oxidase Kết quả: Vi khuẩn cho phản ứng Oxidase (+) làm giấy lọc chuyển sang màu xanh vòng 10 giây ngược lại 30 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phản ứng catalase Sử dụng dung dịch 3% H2O2 (3ml H2O2 100ml nước cất) 1.Dùng que cấy nhặt vi khuẩn để lên lame Nhỏ lên vi khuẩn giọt 3% H2O2 Kết quả: Vi khuẩn cho phản ứng Catalase (+) gây tượng sủi bọt dung dịch 3% H2O2 ngược lại Khả lên men oxy hoá đường glucose (O/F) Các bước thực hiện: Đun khấy cho tan hồn tồn mơi trường O/F Tiệt trùng 1210C 15 phút, để nguội 450C Thêm 1% glucose tiệt trùng Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm có chứa mơi trường OF Sau phủ 0.5-1ml dầu parafin tiệt trùng vào ống nghiệm để tạo điều kiện yếm khí ống nghiệm Để tủ ấm 280C Theo dõi đọc kết sau từ đến bảy ngày Lên men (F) ống có phủ parafin chuyển sang màu vàng Oxidation (O) ống khơng có phủ parafin chuyển sang màu vàng Khơng đổi (N) hai ống có màu xanh xanh lơ - - Khả sinh H2S Các bước thực hiện: Môi trường TSI (60g/1000ml nước cất) Đun khuấy cho tan hoàn toàn Tiệt trùng 1210C 15 phút Để nguội 450C Cho khoảng 3ml môi trường vào ống nghiệm Để nghiêng ống nghiệm tạo mặt phẳng nghiêng Cấy vi khuẩn bề mặt nghiêng mặt đứng ống nghiệm Ủ 280C Đọc kết sau 14-28 Vi khuẩn lên men đường Glucose cho màu đỏ phần thạch nghiêng màu vàng phần thạch đứng (K (alkaline)/A (acid)) Vi khuẩn lên men đường Glucose Lactose Sucrose cho màu vàng phần thạch nghiêng màu vàng phần thạch đứng (A(acid)/A (acid)) Vi khuẩn lên men đường Lactose Sucrose cho màu vàng phần thạch nghiêng màu đỏ phần thạch đứng (A (acid)/K (alkaline)) Vi khuẩn không lên men đường Glucose, không lên men đường Lactose Sucrose cho màu đỏ phần thạch nghiêng màu đỏ phần thạch đứng (K (alkaline)/K (alkaline)) Vi khuẩn sinh H2S cho màu đen ống nghiệm 31 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Khả sinh indole Các bước thực hiện: Cho khoảng 3ml môi trường Nutrient broth vào ống nghiệm Thanh trùng 1210C 15 phút Để nguội Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm Để tủ ấm 280C Sau 48 nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s vào ống nghiệm Kết quả: Vi khuẩn sinh Indole cho phản ứng (+) với vòng màu hồng đến đỏ sậm bề mặt môi trường ngược lại 4 Khả phát triển vi khuẩn nồng độ muối khác Chuẩn bị môi trường 1% tryptone Thêm NaCl ứng với nồng độ muối 0; 0.5; 1; 1,5; 2% NaCl Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm, trùng 1210C 15 phút Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm Để tủ ấm 280C Đọc kết từ ngày Phản ứng dương tính ống nghiệm đục ngược lại Phản ứng Voges-Proskauer (VP): Môi trường MR-VP broth Cho 3ml môi trường vào ôngd nghiệm Thanh trùng 1210C 15 phút Để nguội Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm Ủ nhiệt độ 280C Sau 48 nhỏ 0.6 ml dung dịch thuốc thử A 0.2 ml dung dịch thuốc thử B vào ống nghiệm Lắc để ống nghiệm 30 phút Đọc kết quả: phản ứng dương tính có màu hồng mơi trường xuất hiện, ngược lại Thuốc thử: A: Hòa tan 5g alpha naphthol 100 ml ethyl alcohol B: Hòa tan 40g KOH 100 ml nước cất Khả sử dụng Citrate: Môi trường Simmon’s Citrate agar Đun sôi khuấy cho tan Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm trùng 1210C 15 phút Để nghiêng để tạo mặt phẳng nghiêng ống nghiệm để nguội Cấy vi khuẩn mặt nghiêng ống nghiệm, ủ tủ ấm 280C Đọc kết sau 2-7 ngày Vi khuẩn sử dụng citrate tạo màu xanh lơ môi trường Cimmon citrate agar ngược lại 10 Khả thủy phân Gelatine: 32 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Môi trường Nutrient agar-1% Gelatine Thanh trùng 1210C trông 15 phút Để nguội khoảng 450C, đổ môi trường đĩa Petri Cấy vi khuẩn lên đĩa Petri ủ 280C Sau 48 nhỏ thuốc thử HgCl2 lên bề mặt agar Đọc kết vòng 30 phút Nếu xuất vòng tròn lan rộng xung quanh chổ có vi khuẩn phát triển cho phản ứng dương tính ngược lại 11 Khả sử dụng Ure: Môi trường 0.1% Pepton + 0.2% KH2PO4 + 0.0012% Phenol red + 0.1% Glucose, thêm 2% Ur echo phản ứng Môi trường đối chứng khơng có ure Cho ml mơi trường vào ống nghiệm Thanh trùng 1210C 15 phút Cấy vi khuẩn vào hai ống nghiệm Để tủ ấm 280C Đọc kết vòng ngày Phản ứng dương tính ống nghiệm có ure chuyển sang màu hồng 12 Khả sử dụng loại đường: Môi trường: Các dung dịch đường glucose, sucrose, galactose, mannitol, maltose, sorbitol, xylose, glycerol, rhamnose, Inositol Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm Ủ tủ ấm 280C Sau 48 đọc kết Phản ứng dương tính ống nghiệm chuyển sang màu vàng ngược lại 33 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHỤ LỤC Bảng số lượng cá chết ngày thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri Chủng A1: Mật độ tiêm từ 2,7x103 CFU/ml đến 2,7x103 CFU/ml Bể 10^8 T1 10^8 T2 10^8 T3 10^7 T4 10^7 T5 10^7 T6 10^6 T7 10^6 T8 10^6 T9 10^5 T10 10^5 T11 10^5 T12 10^4 T13 10^4 T14 10^4 T15 10^3 T16 10^3 T17 10^3 T18 0.85% NaCl T19 0.85% NaCl T20 0.85% NaCl T20 Không tiêm T22 Số cá 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 Ngày 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 Ngày 5 0 0 0 0 0 Ngày 6 6 0 0 0 0 Ngày 6 6 6 6 6 0 0 Ngày5 6 6 6 6 6 4 0 0 Ngày 6 6 6 6 6 6 6 6 0 0 Ngày 6 6 6 6 6 6 6 6 0 0 Ngày 6 6 6 6 6 6 6 6 0 0 Ngày9 6 6 6 6 6 6 6 6 0 0 Ngày 10 6 6 6 6 6 6 6 6 0 Ngày 11 6 6 6 6 6 6 6 6 0 Ngày 12 6 6 6 6 6 6 6 6 6 0 34 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chủng T8: Mật độ tiêm từ 0,4x102 CFU/ml đến 0,4x107 CFU/ml 10^2 T17 10^2 T18 0.85% NaCl T19 0.85% NaCl T20 0.85% NaCl T21 10 10 10 10 10 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 0 2 0 0 4 2 0 0 5 0 0 5 0 3 5 0 3 5 0 3 5 0 3 5 0 10^7 T1 10^7 T2 10^7 T3 10^6 T4 10^6 T5 10^6 T6 10^5 T7 10^5 T8 10^5 T9 10^4 T10 10^4 T11 10^4 T12 10^3 T13 10^3 T14 10^3 T15 10^2 T16 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 Ngày 0 0 0 0 0 0 0 Ngày 0 0 0 0 0 0 Ngày 1 0 0 0 0 Ngày 4 2 2 1 Ngày5 6 2 Ngày 8 3 Ngày 10 3 Ngày 8 10 3 Ngày9 10 Ngày 10 10 Ngày 11 10 Ngày 12 10 Bể Số cá 35 Không tiêm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chủng CAF258: Mật độ tiêm vi khuẩn từ 0,8x102 CFU/ml đến 0,8x107 CFU/ml 10^2 T17 10^2 T18 0.85% NaCl T19 0.85% NaCl T20 0.85% NaCl T21 10 10 10 10 10 10 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 10 6 4 1 0 0 10 5 1 0 0 10 8 1 0 0 9 10 8 1 0 0 9 9 10 8 1 0 0 9 9 10 8 1 0 0 Bể 10^7 T1 10^7 T2 10^7 T3 10^6 T4 10^6 T5 10^6 T6 10^5 T7 10^5 T8 10^5 T9 10^4 T10 10^4 T11 10^4 T12 10^3 T13 10^3 T14 10^3 T15 10^2 T16 Số cá 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 Ngày 0 0 0 0 0 0 0 Ngày 0 0 0 0 0 0 Ngày 0 0 0 0 0 Ngày 10 10 3 0 0 Ngày5 10 10 10 10 9 8 Ngày 10 10 10 10 9 8 10 Ngày 10 10 10 10 9 Ngày 10 10 10 10 9 Ngày9 10 10 10 10 9 Ngày 10 10 10 10 10 Ngày 11 10 10 10 10 Ngày 12 10 10 10 10 36 Không tiêm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chủng KSL103: Mật độ tiêm vi khuẩn từ 0,5x102 CFU/ml đến 0,5x107 CFU/ml 10^2 T17 10^2 T18 0.85% NaCl T19 0.85% NaCl T20 0.85% NaCl T21 Không tiêm 10 10 10 10 10 10 10 0 0 0 0 1 0 0 0 1 0 0 0 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 1 0 0 7 1 0 0 10 7 1 0 0 10 7 1 0 0 10 7 1 0 0 10^7 T1 10^7 T2 10^7 T3 10^6 T4 10^6 T5 10^6 T6 10^5 T7 10^5 T8 10^5 T9 10^4 T10 10^4 T11 10^4 T12 10^3 T13 10^3 T14 10^3 T15 10^2 T16 Số cá 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 Ngày 0 0 0 0 0 0 0 Ngày 0 0 0 0 0 0 Ngày 8 3 0 0 0 Ngày 10 10 Ngày5 10 10 10 Ngày 10 10 7 10 Ngày 10 10 7 10 Ngày 8 10 10 7 10 Ngày9 10 10 7 10 Ngày 10 10 10 7 Ngày 11 10 10 Ngày 12 10 10 Bể 37 PHỤ LỤC Kết tái định danh vi khuẩn E ictaluri sau gây cảm nhiễm: STT Chỉ tiêu Gram Hình dạng Di động Catalase Oxidase O-F glucose Simmons' citrate C1 que + + +/+ - A1 que + + +/+ - T8 que + + +/+ - 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 21 21 H2S Urea Nồng độ muối 0% 0,5% 1% 1,5% 2% Nitrite Indole VP MR Gelatin Thủy phân starch Tween 80 Các loại đường Manose Sucrose Xylose Glucose Mannit Glycerol Maltose Rhamnoso Inositol Galactose Sorbitol Crystal violet - - - - - + + + - + + + - + + + + - + + + - + + + - + + + + - + + + + - + + + + - + + + - + + + + - 19 CAF258 KSL103 que que + + + + +/+ +/+ - 38 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHỤ LỤC Mơ học Formol trung tính (Neutral buffered formalin: NBF) Formalin NaH2PO4 Na2HPO4 Nước cất 100 ml 4g 6,5 g 900 ml Dung dịch cố định Buoin’s Acid picric bão hòa Formol Glacial acetic acid 750 ml 125 ml 50 ml Harris’s haematoxyline Haematoxyline 100% alcohol Potassium alum Nước cất Mercuric oxide Glacial acetic acid 5g 50 ml 50 g lít 2,5 g 40 ml Hòa tan Potassium alum nước ấm Hòa tan Haematoxyline cồn, sau cho vào dung dịch Potassium alum vừa pha trên, thêm Mercuric oxide khuấy Để nguội, thêm Glacial acid lọc lại Eosin/Phloxine Stock Eosin (1% Eosin Y nước) Stock Phloxine (1% Phloxine B nước) 95% Ethanol Glacial acetic acid 100 ml 10 ml 780 ml ml Acid/ Alcohol Alcohol 70% Hydrochloric acid 990 ml 10 ml 2% Potassium acetate Potassium acetate 20 g Nước cất 1lít 39 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Qui trình xử lí mẫu Hóa chất Thời gian 1h 1h 1h 1h 1h 1h 1h 2h 2h 2h 2h 2h Cồn 80 Cồn 900 Cồn 950 Cồn 1000 Cồn 1000 Cồn 1000 Xylen Xylen Xylen Paraffin : Xylene Paraffin : Sáp ong Paraffin : Sáp ong Qui trình nhuộm mẫu (Harris's Haematoxylin & Eosin) Hóa chất Xylen Xylen Xylen Cồn 1000 Cồn 1000 Cồn 1000 Cồn 900 Cồn 800 Cồn 650 Haematoxylin 1% acid alcohol Eosine 2% Potassium acetate Cồn 650 Cồn 800 Cồn 900 Cồn 1000 Cồn 1000 Cồn 1000 Xylen Xylen Xylen Thời gian 10 phút 10 phút phút phút phút phút phút phút phút 10 phút Nhúng lần phút phút phút phút phút phút phút phút phút phút phút 40 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC Lời cảm tạ………………………………………………………………………i Tóm tắt…………………………………………………………………………ii Mục lục……………………………………………………………………… iii Danh sách bảng…………………………………………………………………v Danh sách đồ thị……………………………………………………………… v Danh sách hình……………………………………………………………… vi PHẦN 1: ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tình hình bệnh cá tra 2.2 Bệnh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri cá tra 2.1.1 Nguyên nhân gây bệnh .3 2.1.2 Đường lây lan 2.1.3 Dấu hiêu bệnh lý 2.3 Lịch sử bệnh mủ gan cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) 2.4 Một số thí nghiệm gây cảm nhiễm Edwardsiella ictaluri 2.5 Biến đổi mô học cá bệnh vi khuẩn E ictaluri .7 PHẦN 3:VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Thời gian địa điểm 3.2 Vật liệu nghiên cứu 3.3 Phương pháp nghiên cứu .8 3.3.1 Chuẩn bị hệ thống bể 3.3.2 Cá thí nghiệm 3.3.3 Vi khuẩn 3.3.4 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri cá tra .11 3.3.4.1 Xác định LD50 theo phương pháp Reed Muench (1938) 12 3.3.4.2 Tái phân lập tái định danh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri phương pháp truyền thống 12 3.3.5 Mô học 13 3.3.6 Xử lý số liệu 14 PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 15 4.1 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri 15 4.1.1 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri chủng A1 .15 4.1.2 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri chủng T8 .16 iii41 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4.1.3 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri chủng CAF258 16 4.1.4 Thí nghiệm cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri chủng KSL103 17 4.2 Thảo luận chung .18 4.3 Dấu hiệu bệnh lý cá sau gây cảm nhiễm vi khuẩn E ictaluri 21 4.4 Kết tái phân lập định danh vi khuẩn E ictaluri 21 4.5 Biến đổi mô học cá tra bệnh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 24 CHƯƠNG V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 26 5.1 Kết luận 26 5.2 Đề xuất .26 TÀI LIỆU THAM KHẢO 27 PHỤ LỤC 30 PHỤ LỤC 34 PHỤ LỤC 38 PHỤ LỤC 39 iv42 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH BẢNG Bảng 3.1: Các chủng vi khuẩn sử dụng gây cảm nhiễm Bảng 3.2: Mật độ vi khuẩn E ictaluri (CFU/ml) gây cảm nhiễm 11 Bảng 4.4: Kết tái định danh vi khuẩn sau gây cảm nhiễm 22 DANH SÁCH ĐỒ THỊ Đồ thị 4.1.1: Tỉ lệ cá chết (%) theo ngày cảm nhiễm chủng A1 15 Đồ thị 4.1.2: Tỉ lệ cá chết (%) theo ngày cảm nhiễm chủng T8 .16 Đồ thị 4.1.3: Tỉ lệ cá chết (%) theo ngày cảm nhiễm chủng CAF258 17 Đồ thị 4.1.4: Tỉ lệ cá chết (%) theo ngày cảm nhiễm chủng KSL103 18 43v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH HÌNH Hình 3.1: Sơ đồ chuẩn bị vi khuẩn thí nghiệm 10 Hình 4.3: Nội tạng cá tra bị nhiễm E ictaluri 21 Hình 4.4.1: Gram vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 23 Hình 4.4.2: Kết test sinh hóa vi khuẩn E ictaluri 23 Hình 4.5: Gan thận cá tra bệnh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri ……….24 vi 44 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... lực vi khuẩn E ictaluri cá tra hạn chế đề tài:? ?Xác định LD50 cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) bị nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri? ?? thực Mục tiêu đề tài nhằm: Xác định độc lực chủng vi khuẩn. .. nhiễm vi khuẩn Edwardsiella ictaluri? ?? thực phương pháp tiêm vi khuẩn E ictaluri cá tra giống Nhằm so sánh độc lực chủng vi khuẩn E ictaluri với khảo sát biến đổi mô học gan thận cá tra bị nhiễm vi. .. tạng cá tra bị nhiễm E ictaluri 21 Hình 4.4.1: Gram vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 23 Hình 4.4.2: Kết test sinh hóa vi khuẩn E ictaluri 23 Hình 4.5: Gan thận cá tra bệnh vi khuẩn