ĐÁNH GIÁ sự KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH của VI KHUẨN gây BỆNH TRÊN cá TRA (pangasianodon hypophthalmus) NUÔI ở VÙNG nước lợ TỈNH TRÀ VINH bến TRE

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN TRẦN DUY PHƯƠNG ĐÁNH GIÁ SỰ KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN GÂY BỆNH TRÊN CÁ TRA (Pangasianodon hypophthalmus) NUÔI Ở VÙNG NƯỚC LỢ TỈNH TRÀ VINH - BẾN TRE LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2009 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com LỜI CẢM TẠ Xin tỏ long biết ơn sâu sắc chân thành đến Cô Từ Thanh Dung tận tình hướng dẫn, giúp đỡ, đóng gớp nhiều ý kiến quý báu tạo điều kiện thuận lợi suốt trình thực đề tài tốt nghiệp Thầy cô anh chị môn Sinh Học Bệnh Học Thủy Sản-Khoa Thủy Sản-trường Đại Học Cần Thơ giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi q trình thực đề tài Thầy bạn khoa Nông Nghiệp – Thủy Sản, trường Đại Học Trà Vinh nhiệt tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi trình thực đề tài Tập thể lớp bệnh học thủy sản K31 giúp đỡ tận tình LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com MỤC LỤC Trang Mục lục i Danh sách bảng iii Danh sách hình iv PHẦN I: ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN II: LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Tình hình dịch bệnh nuôi trồng thủy sản 2.2 Các bệnh thường xuất cá tra 2.3 Đặc điểm vi khuẩn Edwardsiella Aeromonas 2.4 Các nghiên cứu kháng thuốc vi khuẩn 2.5 Thuốc kháng sinh dùng nuôi trồng thủy sản 2.6 Các nhóm kháng sinh thường sử dụng nuôi trồng thủy sản PHẦN III: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .11 3.1 Vật liệu nghiên cứu 11 3.1.1 Đối tượng 11 3.1.2 Dụng cụ thí nghiệm 11 3.2 Hóa chất mơi trường .11 3.2.1 Hóa chất 11 3.2.2 Môi trường 11 3.3 Phương pháp nghiên cứu .11 3.3.1 Phương pháp điều tra 11 3.3.2 Phương pháp thu mẫu .12 3.3.3 Phương pháp định danh vi khuẩn 12 3.3.4 Phương pháp lập kháng sinh đồ 12 3.3.5 Phương pháp xác định MIC 13 PHẦN IV: KẾT QUẢ THẢO LUẬN 15 4.1 Kết điều tra 15 4.1.1 Thông tin chung 15 4.1.2 Thông tin kỹ thuật nuôi: .16 4.1.3 Tình hình bệnh sử dụng thuốc-hóa chất 17 4.2 Kết phân lập định danh vi khuẩn 19 4.2.1 Kết phân lập tiêu sinh hóa 19 i LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com 4.2.2 Kết định danh vi khuẩn E ictaluri Aeromonas sp kit API 20E 21 4.3 Kết kháng sinh đồ 21 4.3.1 Kết làm kháng sinh đồ Aeromonas sp 23 4.3.2 Kết làm kháng sinh đồ E ictaluri 25 4.4 Kết giá trị MIC 26 4.4.1 Giá trị MIC vi khuẩn Aeromonas sp 27 4.4.2 Giá trị MIC vi khuẩn E ictaluri 27 PHẦN V: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT .29 5.1 Kết luận .29 5.2 Đề xuất 29 PHẦN VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 PHỤ LỤC 34 ii LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com DANH MỤC BẢNG Bảng 4.1 Diện tích mặt nước trung bình hộ nuôi 16 Bảng 4.2 Kết kiểm tra đặc điểm hình thái, sinh hóa vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Aeromonas sp 19 Bảng 4.3 Giá trị MIC vi khuẩn Aeromonas sp 27 Bảng 4.4 Giá trị MIC vi khuẩn E ictaluri 28 iii LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com DANH MỤC HÌNH Hình 2.1: Các đường trao đổi kháng thuốc vi khuẩn động vật người (Prescott , 2000) Bảng 4.1 Bản đồ địa tỉnh Bến Tre Trà Vinh 15 Hình 4.2 Các loại kháng sinh thường sử dụng Trà Vinh Bến Tre 18 Hình 4.3 Cá tra bị bệnh mủ gan 20 Hình 4.4 Cá tra bị bệnh xuất huyết 20 Hình 4.5 Khuẩn lạc Aeromonas spp phát triển môi trường TSA 20 Hình 4.6 Khuẩn lạc E ictaluri phát triển mơi trường TSA 20 Hình 4.7 Vi khuẩn E ictaluri gram âm, que ngắn 21 Hình 4.8 Vi khuẩn Aeromonas sp gram âm, que ngắn 21 Hình 4.9 Kết định danh Aeromonas spp kit API 20E .22 Hình 4.10 Kết kháng sinh đồ chủng Aeromonas sp 22 Hình 4.11 Tỷ lệ phần trăm kháng thuốc kháng sinh chủng vi khuẩn Aeromonas sp 23 Hình 4.12 Tỷ lệ phần trăm kháng kháng sinh chủng vi khuẩn Edwardsiella ictaluri 25 Hình 4.13 Kết MIC Aeromonas sp nồng độ µg/ml 28 iv LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu đánh giá kháng thuốc hai loại vi khuẩn Aeromonas spp Edwardsiella ictaluri bệnh cá tra (pangasianodon hypophthamus) nuôi vùng nước lợ tỉnh Trà Vinh Bến Tre Kết khảo sát ban đầu cho thấy 100% số hộ nuôi vấn sử dụng thuốc kháng sinh để phòng trị bệnh Kết phân lập, kiểm tra tiêu định danh kit API 20E xác định 20 chủng vi khuẩn gây bệnh cá tra có 12 chủng E ictaluri chủng Aeromonas spp Để đạt mục tiêu đề ra, phương pháp lập kháng sinh đồ với loại thuốc kháng sinh thực 20 chủng vi khuẩn tìm Kết cho thấy đa số chủng E ictaluri kháng với florfenicol (50%), chloramphenicol (58%) tetracycline (42%), với ampicillin cefazoline nhạy với 100% số vi khuẩn E ictaluri phân lập Kết khơng tìm thấy vi khuẩn Aeromonas spp kháng với florfenicol chloramphenicol, có tới 50% vi khuẩn Aeromonas spp kháng với streptomycine 100% kháng với cefazoline Phương pháp pha loãng thuốc kháng sinh môi trường lỏng dựa theo tài liệu Clinical and Laboratory Standards Institure (CLSI), (2006b) sử dụng làm MIC ba loại kháng sinh chloramphenicol, oxytetracycline streptomycine Kết tìm thấy E ictaluri kháng với chloramphenicol mức cao (6/8 chủng) LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com PHẦN I ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Giới thiệu Thủy sản xem ngành kinh tế quan trọng Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) Những năm gần phát triển nhanh, góp phần tích cực vào việc nâng cao nguồn thu nhập cộng đồng tăng kim ngạch xuất Trong vòng 10 năm từ 1995 đến 2005, diện tích ni trồng thủy sản vùng ĐBSCL tăng 2,37 lần sản lượng tăng vọt 3,68 lần (Lê Tuấn Anh, 2008) Cùng với phát triển nhanh sản lượng, diện tích ni mơ hình ni thủy sản, nghề ni cá tra có tốc độ phát triển cao Theo thống kê Bộ Nông Nghiệp Phát Triển Nông Thôn cho thấy phát triển nhanh diện tích nuôi cá tra Sáu tháng đầu năm 2007 tổng diện tích ni gần 5.000 đến sáu tháng đầu năm 2008, diện tích tăng lên đạt gần 6.000 ha, sản lượng cá tăng theo nhanh từ triệu năm 2007 tăng lên 1,2 triệu năm 2008 Ngoài tỉnh có truyền thống ni cá tra Đồng Tháp, An Giang, gần tỉnh Sóc Trăng, Trà Vinh Bến Tre đầu tư phát triển Năm 2007, ngành thủy sản Bến Tre tập trung nuôi đối tương: tôm sú, tôm xanh, nghêu cá da trơn Tổng diện tích ni thủy sản năm 2007 43.000 Trong đó, diện tích ni cá da trơn 230 ha, với suất 35.000 (http://www.fistenet.gov.vn, cập nhật ngày 28/11/2008) Nuôi trồng thủy sản phát triển mạnh nhiều khía cạnh diện tích ni, mức độ thâm canh, loại hình ni, đầu tư sở hạ tầng chế biến sau thu hoạch Việc sử dụng thuốc, hóa chất đóng góp khơng nhỏ cho phát triển ngành việc cải tạo, trì chất lượng môi trường nuôi trường hợp bệnh bộc phát cần đến can thiệp thuốc-hóa chất Tuy nhiên, việc sử dụng quản lý thuốc, hóa chất ni trồng thủy sản cịn nhiều hạn chế trình độ người ni người cung cấp Điều dẫn đến việc sử dụng khơng loại thuốc kháng sinh Theo điều tra Mai Văn Tài (2004) có tới 138 loại kháng sinh sử dụng loại hình ni sản xuất giống thủy sản Việt Nam Khi việc sử dụng kháng sinh q mức, khơng kiểm sốt để trị bệnh cho cá, tơm điều tất yếu xảy vấn đề kháng thuốc chủng vi khuẩn gây bệnh đồng thời gây ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người Và việc phịng xử lý bệnh cho động vật thủy sản củng người sau gặp nhiều khó khăn Vấn đề kháng thuốc kháng sinh chủng vi khuẩn gây bệnh động vật thủy sản từ lâu nhiều tác giả nghiên cứu xác nhiều nhóm vi khuẩn phân lập từ ao nuôi cá da trơn kháng với nhiều loại kháng sinh Oxytetracycline, Tetracycline, Ampiciline, …(Depaola et al, 1995; Matyar et al., 2004; Mohamed Nawaz et al., 2006) Ở LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Việt Nam kháng thuốc kháng sinh dịng vi khuẩn phân lập từ ao ni thủy sản ĐBSCL nghiên cứu tìm thấy 169 dịng vi khuẩn kháng với loại kháng sinh thường dùng để trị bệnh cho động vật thủy sản (Nguyễn Thanh Phương ctv., 2005) Gần đây, Từ Thanh Dung ctv (2008) nghiên cứu kháng thuốc 64 chủng Edwardsiella ictaluri gây bệnh cá tra tìm đa số kháng với streptomycin (83%), oxytetracyline (81%)… Trong thời gian gần cá tra nhiều người dân tỉnh Trà Vinh, Bến Tre, Sóc Trăng đưa ni vùng nước lợ, việc kháng thuốc vi khuẩn gây bệnh cá tra nuôi vùng nước phổ biến cịn cá tra ni vùng nước lợ kháng thuốc vi khuẩn gây bệnh nào? Do đó, vấn đề cấp thiết nghiên cứu kháng thuốc vi khuẩn gây bệnh cá tra nuôi vùng nước lợ xảy để góp phần giảm thiểu thiệt hại kinh tế, tăng suất sản lượng cá tra kháng thuốc vi khuẩn gây Vì mà đề tài “Đánh giá kháng thuốc vi khuẩn gây bệnh cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi vùng nước lợ tỉnh Trà Vinh Bến Tre” thực 1.2 Mục tiêu đề tài Đánh giá kháng thuốc vi khuẩn gây bệnh mủ gan, xuất huyết cá tra nuôi vùng nước lợ tỉnh Trà Vinh Bến Tre đồng thời tìm loại thuốc đặc hiệu để tạm thời điều trị loại bệnh nguy hiểm cần thiết nhằm làm giảm thiệt hại cho người nuôi 1.2.1 Nội dung thực hiện: Điều tra tình hình sử dụng kháng sinh hộ nuôi cá tra vùng nước lợ hai tỉnh Trà Vinh Bến Tre Phân lập, định danh lập kháng sinh đồ 20 chủng vi khuẩn gây bệnh (E.ictaluri Aeromonas spp) Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) chủng vi khuẩn gây bệnh LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com 26 Matyar F., S DiÃnỗer, A Kaya, and ệ ầolak, 2004 Prevalence and resistance to antibiotics in Gram negative bacteria isolated from retail fish in Turkey, Annals of Microbiology, 54 (2), p.151-160 27 Mcnicol L.A, K M S Aziz, Imdadul Huq, James B Kaper, Hank A Lockman,Lt Elaine F Remmers, William M Spira, Mary J Voll, and Rita R Colwell, 1980 Isolation of Drug-Resistant Aeromonas hydrophila from Aquatic Environments Antimicrobial Agents And Chemotherapy, Mar 1980, P 477-483 28 Miranda Claudio D., Corinna Kehrenberg, Catherine Ulep, Stefan Schwarz, and Marilyn C Roberts., 2003 Diversity of Tetracycline Resistance Genes in Bacteria from Chilean Salmon Farms Agents and chemotherapy, Mar 2003, p 883–888 29 Mohamed Nawaz, Kindon Sung, Saeed A Khan, Ashraf A Khan, and Roger Steele, 2006 Biochemical and Molecular Characterization of Tetracycline-Resistance Aeromonas veronii Isolates from Catfish Applied and Environmental Microbiology, Oct 2006, p 6461-6466 30 Nguyễn Chính, 2005 Đánh giá tình hình sử dụng thuốc kháng sinh nuôi cá tra Pangasianodon hypophthamus thâm canh An Giang Can Thơ Luận văn cao học 2005, Khoa Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ 75 trang 31 Nguyễn Hữu Thịnh Trương Thanh Loan., 2007 Phân lập khảo sát đặc điểm kháng sinh Edwardsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ cá tra (Pangasius hypophthamus) ni thâm canh Tạp chí Khoa Học Kỹ Thuật Nông Lâm Nghiệp số 1&2/2007 Trang 175-179 32 Nguyễn Quốc Thịnh, Từ Thanh Dung Fugerson H.W, 2004 Nghiên Cứu mô bệnh học cá tra (Pangasius hypophthalmus) bị bệnh trắng gan, tạp chí khoa học – Đại Học Cần Thơ 2004 trang 120-125 33 Nguyễn Tấn Duy Phong, 2008 Điều tra trạng ni, bệnh tình hình sử dụng thuốc hóa chất ni thâm canh cá tra ao (Pangasianodon hypophthamu) Luận văn đại học 2008, Khoa Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ, 84 trang 34 Nguyễn Thanh Phương, Đặng Thị Hoàng Oanh, Từ Thanh Dung, Lê Xuân Sinh, 2005 Bacterial Resistance to Antimicrobials Use in Shrimp and Fish Farms in the Mekong delta, Vietnam Journal: Proceeding of the international workshop on: Antibiotic Resistance in Asian Aquaculture Environments 35 Pender J and E.E Stobberingh., 2007 Antibiotic Resistaceof motile Aeromonads in indoor catfish and farms in the southern part of the Nethelands International journal of Antimicrobial Agents, March 2008, p.261-265 36 Phạm Minh Thành, 2008 Giáo trình sản xuất giống cá nước ngọt, Khoa Thủy Sản- Trường Đại Học Cần Thơ 32 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com 37 Popovic T.N , R Coz-Rakovac, I Strunjak-Perovic, 2007 Commercial phenotypic tests (API 20E) in diagnosis of fish bacteria: a review Veterinarni Medicina, 52, 2007 (2 p): 49–53 38 Prescott, J.F., 2000 Antimicrobial drug resistane and its epidemiology In Antimicrobial therapy in veterinary medicine Lowa State University press/Ame pp 27-48 (796 p) 39 Samira Sarter, Hoang Nam Kha Nguyen, Le Thanh Hung, Jérôme Lazard, and Didier montet., 2007 Antibiotic Resistace in Gram-negative bacteria isolated from farmed catfish Food Control 18 (2007) p.1391-1396 40 Stock, I., and Bernd Wiedemann, 2001 Natural Antibiotic susceptibilities of Edwardsiella tarda, E ictaluri and E hoshinac Antibiomicrobial Agenrs and chemotherapy, Aug, 2001, P.2245-2255 41 Tangtrongpiros, J, 2005 Antibiotic Resistance Problem in Thailand Antibiotic Resistance in Asian Aquaculture Environments Prooceedings Index (ISBN N° 88-901344-3-7) 42 Trần Anh Dũng, 2005 Khảo sát tác nhân gây bệnh nuôi cá tra Pangasianodon hypophthalmus thâm canh An Giang Luận văn cao học 2005, Khoa Thủy Sản, Đại Học Cần Thơ, 66 trang 43 Từ Thanh Dung, 2008 Bài giảng Bệnh Vi khuẩn Trên Động Vật Thủy Sinh Khoa Thủy Sản- Trường Đại Học Cần Thơ 44 Tu Thanh Dung, Freddy Haesebrouck, Nguyen Anh Tuan, Patrick sorgeloos, Margo Baele, and Annemie Decostere, 2008 Antimicrobial susceptibility pattern of Edwarsiella ictaluri isolate from natural outbreaks of bacillary necrosis of Pangasianodon hypophthalmus in Vietnam Microbial Drug Resistance December 2008, 14(4) p: 311-316 45 Từ Thanh Dung, M Cramlish, H.W Fugerson, Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnh Đặng Thị Mai Thy., 2004 Xác định vi khuẩn gây bệnh trắng gan cá tra (Pangasius hypophthalmus) nuôi thâm canh Đồng Bằng Sông Cửu Long Tạp chí Khoa Học Đại Học Cần Thơ Trang 137-142 46 Võ Văn Ninh, 2001 Kháng sinh thú y Nhà Xuất Bản Trẻ, 2001 141 trang 47 Waltman W.D and E.B Shotts, 1986 Antibiomicrobial susceptibility of Edwardsiella ictaluri, Journal of U’ildife Disrasrs.21 (21.1986),pp173177 Các trang wedsite: www.fistenest.gov.vn cập nhật ngày 31/10/2008 www.vietlinh.com.vn cập nhật ngày 6/11/2008 33 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com PHỤ LỤC Phụ lục 1: PHIẾU THU THẬP THƠNG TIN VỀ TÌNH HÌNH BỆNH TRÊN CÁ TRA NI Thơng Tin Chung Họ tên chủ hộ (người vấn): Địa chỉ: Số điện thoại: Diện tích ni: Độ sâu: Số ao nuôi: Năm bắt đầu nuôi cá (kinh nghiệm): Mơ hình nuôi: Số vụ nuôi/năm: Thông Tin Về Kỹ Thuật Nuôi Cải tạo ao: Hóa chất sử dụng cải tạo, liều lượng: Nguồn giống: Mật độ thả (con/m2): Mùa vụ thả: Kích cỡ giống lúc thả: Xử lý giống thả: Loại thức ăn: Cách cho ăn: Số lần cho ăn: Quản lý yếu tố môi trường: Nguồn nước: Thay nước (lần/tháng): Các biện pháp xử lý khác: Tình hình bệnh 34 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Các bệnh xuất vụ nuôi trước: Bệnh xuất vụ nuôi gần nhất: Cách xử lý: Các bệnh thường gặp Bệnh ký sinh trùng: Loại ký sinh hay dấu hiệu bệnh: Giai đoạn cá mắc bệnh: Mùa vụ thường xảy ra: Mức độ thiệt hại: Bệnh vi khuẩn Loại vi khuẩn hay dấu hiệu bệnh: Giai đoạn cá mắc bệnh: Mùa vụ thường xảy ra: Mức độ thiệt hại: Bệnh khác Loại bệnh hay dấu hiệu bệnh: Giai đoạn cá mắc bệnh: Mùa vụ thường xảy ra: Mức độ thiệt hại: Xử Lý Bệnh Điều chỉnh môi trường: Điều chỉnh thức ăn: Sử dụng thuốc/hóa chất: 35 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Người (cơ quan) tư vấn dùng thuốc/hóa chất: Loại thuốc/hóa chất: Li ều lượng: Thời gian điều trị: Hi ệu quả: Loại thuốc/hóa chất: Li ều lượng: Thời gian điều trị: Hi ệu quả: Chủ hộ Người thu thập thông tin ………………… ……………………………… 36 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Phụ lục 2: PHIẾU THU MẪU CÁ TRA BỆNH Số TT:…… Ngày thu mẫu: Họ tên người nuôi: Địa chỉ: Điện thoại: Loài cá: Tuổi hay cỡ cá: Trọng lượng (g): Chiều dài (cm): Chi ều Cao (cm): Kích thước ao: Dài (m): Rộng (m): Sâu (m): Kích thước bè: Dài (m): Rộng (m): Sâu (m): Số lượng cá thả ao hay bè: Mật độ cá thả (con/m2, con/m3): Ngày thả cá: Nguồn giống: Vệ sinh, cải tạo ao/bè (có/khơng): Hóa chất sử dụng, liều lượng: Vôi: Thuốc tím: Các loại khác: Loại thức ăn: Ngày mua thức ăn: Thức ăn tươi sống: % thức ăn/trọng lượng thể: Tần số cho ăn: Thức ăn chế biến: % thức ăn/trọng lượng thể: Tần số cho ăn: Nguồn nước: Chất lượng nước: 37 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Các tiêu môi trường: pH: NH4+: Độ kiềm: Màu nước ao hay bè: Có thay nước hay khơng: Thời giant hay nước: Ngày xuất bệnh: Số cá chết hàng ngày: Tăng/giảm: Dấu hiệu bệnh lý: v Bên ngoài: Hoạt động bơi lội: Màu sắc thể: Vết thương da: Tập tính bắt mồi (bình thường, giảm, bỏ ăn) (%): Hoạt động mang: Triệu chứng khác: v Bên trong: Có dịch nhầy xoang thể: Có dịch nhầy ruột: Màu sắc hình dạng gan, thận, tỳ tạng: Màu sắc hình dạng quan khác: Triệu chứng khác: Ngày bắt đầu dung thuốc: Các loại thuốc sử dụng, liều lượng: Loại thuốc sử dụng có hiệu khơng: Hướng chẩn đoán: Đề nghị: Tên người thu mẫu 38 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Phụ lục Các bước thực kiểm tra tiêu Ghi nhận dấu hiệu bên cá Mổ cá ghi nhận biểu quan nội tạng Phân lập vi khuẩn từ gan, thận, tỳ tạng lên môi trường thạch TSA Áp dụng biện pháp vô trùng để tránh trường hợp bị tạp nhiễm Ủ đĩa môi trường nhiệt độ 28-30oC Sau 18-24 quan sát ghi nhận hình thái khuẩn lạc (48 với nhóm Edwardsiella) Tiếp tục tách rịng, theo dõi để đạt đĩa cấy Sau tiến hành test tiêu bản: v Nhuộm Gram: Cho giọt nước muối sinh lý lên lame Dùng que cấy triệt trùng lấy khuẩn lạc trãi lên lame Để lame khô tự nhiên Hơ lướt lame lên đèn cồn, để cố địnhvi khuẩn, để nguội Nhuộm Crystal violet (dd1) khoảng phút, rữa lame nước Nhuộm iodine (dd2) phút, rửa lame nước Rửa lame dung dịch alcohol/acetone (dd3) từ 2-3 giây Rửa lame lại nước Nhuộm safranin (dd4) khoảng phút, rửa lại nước để khơ Quan sát lame kính hiển vi quang học (40X 100X) Vi khuẩn Gram (+): màu xanh / tím Vi khuẩn Gram (-): màu hồng v Tính di động: Cho Vaseline lên góc lamelle đặt ngữa lamelle lên bàn Dung pipet tiệt trùng nhỏ giọt nước muối sinh lý lên lamelle Tiệt trùng que cấy, lấy khuẩn lạc hịa tan vào giọt nước muối lamelle Dùng lame đặt nhẹ nhàng lên lamelle cho lame không chạm vào giọt nước muối sinh lý chứa vi khuẩn Cẩn thận lật nhanh lame để giọt nước treo ngược lamelle Đặt lame lên kính hiển vi, quan sát tính di động vi khuẩn vật kính 40X v Phản ứng Oxidase Chạm nhẹ que thử oxidase vào khuẩn lạc đĩa agar dung que cấy nhặt khuẩn lạc cho tiếp xúc que thử oxidase 39 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Quan sát que thử 30 giây quan sát thai đổi màu sắc: que thử chuyển màu xanh đậm cho phản ứng oxidase dương tính (+) khơng chuyển màu âm tính (-) v Phản ứng Catalase Nhỏ giột dung dịch H2O2 3% lên lame Dung que cấy triệt trùng lấy vi khuẩn cho vào dung dịch H2O2 3% Phản ứng Catalase dương tính có tượng sủi bọt, catalase âm tính không sủi bọt v Khả lên men oxy hóa đường glucose (O-F test) Chuẩn bị ống nghiệm chứa môi trường O/F tiệt trùng Dung que cấy tiệt trùng lấy vi khuẩn đĩa agar cấy thẳng vào ống nghiệm chứa môi trường O/F, sau phủ 0,5-1 ml dầu paraffin tiệt trùng vào ống nghiệm tạo điều kiện yếm khí ống nghiệm (F), ống cịn lại kiểm tra tính hiếu khí vi khuẩn (O) Để ống nghiệm vào tủ ấm 28-30oC Đọc kết sau 1-7 ngày Lên men (F) ống có phủ dầu paraffin chuyển màu vàng Oxy hóa (O) ống khơng có phủ dầu paraffin chuyển sang màu vàng Không phản ứng ống nghiệm màu xanh Bảng 3.1: Bảng kiểm tra kết test O/F Ống tiếp xúc với không Ống phủ dầu paraffin khí Kết Xanh Xanh Không phản ứng với glucose Xanh lơ phần Xanh Phản ứng kiềm tính Vàng Xanh Phản ứng oxy hóa Vàng Vàng Phản ứng lên men v Phản ứng 0/129 Phản ứng dùng để phân biệt nhóm vi khuẩn Aeromonas Vibrio Aeromonas kháng với 0/129 cịn Vibrio ngược lại Phương pháp: Vi khuẩn sau phục hồi từ tủ âm 80 đạt đĩa cấy môi trường TSA Dùng que cấy tiệt trùng cho khuẩn lạc vào ống nghiệm chứa sẵn 5ml nước muối sinh lý (0,85%NaCl) tiệt trùng Sau đó, xác định mật 40 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com số vi khuẩn cách đem so với máy so màu quang phổ bước sóng 610nm OD = 0,1 ± 0,02 để mật số vi khuẩn vào khoảng 1x108 CFU/ml Dùng tăm tiệt trùng thấm dung dịch vi khuẩn trãi lên đĩa mơi trường TSA sau để yên phút Dán đĩa 0/129 (10µg) lên đĩa môi trường trãi vi khuẩn Đem ủ tủ ấm 28-30oC đọc kết sau 24 Kết quả: Vi khuẩn mẫn cảm với 0/129 tạo vịng vơ trùng có đường kính ≥ 15 mm quanh đĩa 0/129 Ngược lại, vi khuẩn kháng với 0/129 khơng tạo vịng vơ trùng v Phương pháp định danh vi khuẩn kit API 20E (Biomerieus® SA 69280 marcy I’Etoile - France) Cho nước cất nước máy vào khay nhựa kit để giữ ấm trình ủ tủ ấm Đặt kit API vào khay nhựa Chuẩn bị dung dịch vi khuẩn: dùng que cấy tiệt trùng lấy khuẩn lạc cho vào ml nước muối sinh lý nước cất tiệt trùng lắc trộn Các bước thực hiện: Dùng dung dịch vi khuẩn cho vào đầy ô CIT, VP GEL Tương tự cho vi khuẩn vào đầy phần tuýp ô ADH, LCD, ODC, H2S URE, cho dầu paraffin vào đầy phần lõm ô Tiếp theo dùng dung dịch vi khuẩn cho vào đầy phần tuýp ô lại Đậy nắp khay ủ tủ ấm 26-28oC Đọc kết sau 24-48 Đọc kết quả: Kiểm tra ghi nhận tiêu không cần thêm thuốc thử Các tiêu cần thêm thuốc thử: Cho giọt thuốc thử TDA vào ô TDA, đọc kết sau vài giây Cho gọt thuốc thử IND vào ô IND, đọc kết sau vài giây Cho giọt thuốc thử VP1 sau cho tiếp giọt thuốc thử VP2 vào ô VP, đọc kết sau 10-15 phút Trước đọc kết , kit API 20E phải đạt tối thiểu tiêu cho kết dương tính Ngược lại cần ủ mẩu thêm vài Sau cho thuốc thử vào đậy nắp khay nhựa lại Khi cho thuốc thử vào tiêu khơng nên ủ lại tủ ấm Kiểm tra kết test API 20E 41 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Bảng 3.2: Kết Test API 20E Chỉ tiêu ONPG Thành phần Phản ứng/enzyme Β-galactosidase Âm tính Khơng màu Dương tính Vàng Arginine hidrolate Vàng Đỏ/cam ADH Ortho-nitrophenyl galactosidase Arginine LDC Lysine Lysine decarboxylate Vàng Đỏ/cam ODC Ornithine Ornithine decarboxylate Xanh nhạt/vàng Xanh lá/xanh CIT sodium citrate Sử dụng citrate Không màu/xám nhạt Vệt mãnh H2 S Sodium Thiosulphate Sản phẩm H2S Vàng Đỏ/cam URE Urea Men urease Vàng Nâu nhạt TAD L-Tryptophane Tryptophane deaminase Xanh nhạt/vàng Hồng IND L-Tryptophane Sản phẩm indole Không màu Hồng/đỏ VP Sodium Pyruvate Sản phẩm acetone Không có màu Khuyếch đen tán màu đen GEL Gelatin Gelatinase Xanh/xanh Vàng GLU D-glucose Lên men/oxh glucose Xanh/xanh Vàng MAN D-manitol Lên men/oxh manitol Xanh/xanh Vàng INO Inositol Lên men/oxh Inositol Xanh/xanh Vàng SOR D-sorbitol Lên men/oxh sorbitol Xanh/xanh Vàng RHA L-Rhamnose Lên men/oxh Rhamnose Xanh/xanh Vàng SAC D-sucrose Lên men/oxh sucrose Xanh/xanh Vàng MEL D-melibiose Lên men/oxh melibiose Xanh/xanh Vàng AMY Amygdalin Lên men/oxh Amygdalin Xanh/xanh Vàng ARA L-arabinose Lên men/oxh arabinose Xanh/xanh Vàng đen đỏ 42 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Phụ lục Bảng 4.1 Dấu hiệu bệnh lý đặc điểm khuẩn lạc vi khuẩn Aeromonas sp Ký hiệu vi khuẩn ATV0803 ATV0804 ATV0805 ATV0910 ABT0906 ABT0907 ABT0908 ABT0909 Dấu hiệu bệnh lý Da, vi xuất huyết, thận có dốm trắng Da, vi, hậu mơn xh Nội tạng xuất huyết, dịch vàng Da, vi, hậu môn xh Nội tạng xuất huyết, dịch vàng Da, vi xuất huyết, thận có dốm trắng Da, vi, hậu môn xuất huyết Mắt phù Da, vi, hậu môn xuất huyết Mắt phù Da, vi, hậu môn xuât huyết Da, vi, hậu môn xuât huyết Môi trường nuôi cấy Phát triển Mơ tả khuẩn lạc Trịn, nhỏ, trắng đục TSA Thuần TSA Thuần Tròn, nhỏ, trắng đục Que ngắn TSA Thuần Tròn, nhỏ, trắng đục Que ngắn TSA Thuần TSA Thuần TSA Thuần TSA Thuần TSA Thuần Tròn, nhỏ, trắng đục Tròn, nhỏ, trắng đục Tròn, nhỏ, trắng đục Tròn, nhỏ, trắng đục Trịn, nhỏ, trắng đục Hình dạng vi khuẩn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Que ngắn Bảng 4.2 Dấu hiệu bệnh lý đặc điểm khuẩn lạc vi khuẩn E ictaluri Ký hiệu vi khuẩn ETV09 01 ETV09 02 ETV09 03 ETV09 04 ETV09 05 ETV09 06 EBT090 EBT090 EBT090 EBT091 EBT091 EBT091 Dấu hiệu bệnh lý Gan, thận, tỳ sưng to, có nhiều đốm trắng Gan, thận, tỳ sưng to, có nhiều đốm trắng Gan, thận, tỳ sưng to, có nhiều đốm trắng Gan, thận, tỳ sưng to, có nhiều đốm trắng Gan, thận, tỳ sưng to, có nhiều đốm trắng Gan, thận, tỳ sưng to, có nhiều đốm trắng Gan, thận, tỳ sưng to, có nhiều đốm trắng Gan, thận, tỳ sưng to, có nhiều đốm trắng Gan, thận, tỳ sưng to, có nhiều đốm trắng Gan, thận, tỳ sưng to, có nhiều đốm trắng Gan, thận, tỳ sưng to, có nhiều đốm trắng Gan, thận, tỳ sưng to, có nhiều đốm trắng Mơi trường nuôi cấy Phát triển TSA Thuần TSA Thuần TSA Thuần TSA Thuần TSA Thuần TSA Thuần TSA Thuần TSA Thuần TSA Thuần TSA Thuần TSA Thuần TSA Thuần Mô tả khuẩn lạc tròn, trắng đục, li ti tròn, trắng đục, li ti tròn, trắng đục, li ti tròn, trắng đục, li ti tròn, trắng đục, li ti tròn, trắng đục, li ti tròn, trắng đục, li ti tròn, trắng đục, li ti tròn, trắng đục, li ti tròn, trắng đục, li ti tròn, trắng đục, li ti tròn, trắng đục, li ti Hình dạng vi khuẩn Que dài Que dài Que dài Que dài Que ngắn Que ngắn Que dài Que ngắn Que ngắn Que dài Que dài Que dài 43 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Bảng 4.3 Kết kháng sinh đồ chủng Aeromonas STT FFC TE CEZ CHL DO AM SM (mm) (mm) (mm) (mm) (mm) (mm) (mm) ATV0803 36 34 35 28 16 ATV0804 30 30 36 28 14 ATV0805 32 32 34 28 14 ATV08010 34 30 35 28 14 ABT0906 34 15 34 19 19 ABT0907 36 34 34 30 15 ABT0908 36 32 36 26 12 ABT0909 40 30 36 30 18 Vi Khuẩn STT Vi Khuẩn ATV0803 ATV0804 ATV0805 ATV08010 ABT0906 ABT0907 ABT0908 ABT0909 FFC TE CEZ CHL DO AM SM S S S S S S S S S S S S R S S S R R R R R R R R S S S S S S S S S S S S I S S S R R R R R R R R I R R R I I R I Bảng 4.4 Kết kháng sinh đồ chủng Edwardsiella STT Vi Khuẩn 10 11 12 ETV0801 ETV0802 ETV0803 ETV0804 ETV0805 ETV0906 EBT0907 EBT0908 EBT0909 EBT0910 EBT0911 EBT0912 CEZ SM TE AM FFC DO CHL (mm) (mm) (mm) (mm) (mm) (mm) (mm) 32 40 34 40 28 40 30 38 30 36 30 36 34 34 36 42 34 44 36 40 38 44 28 45 34 18 42 36 20 40 10 40 15 38 18 10 38 8 36 30 38 40 30 40 34 34 32 36 44 36 10 32 10 40 40 15 40 40 15 44 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com STT 10 11 12 Vi Khuẩn ETV0801 ETV0802 ETV0803 ETV0804 ETV0805 ETV0906 EBT0907 EBT0908 EBT0909 EBT0910 EBT0911 EBT0912 CEZ S S S S S S S S S S S S SM R R R R I R I R R R R R TE S S S S S R R S S R R R AM S S S S S S S S S S S S FFC S S S S R R R S S R R R DO S S S S S I R S S R I I CHL S S S S R R R R S R R R Bảng 4.5 Kết MIC chủng Aeromonas ATV0805 ATV0806 ABT0807 ABT0808 Chloramphenicol (µg/ml) 8 8 Oxytetracycline (µg/ml) 4 Streptomicine (µg/ml) 64 64 32 64 Bảng 4.6 Kết MIC chủng Edwardsiella ictaluri ETV0802 ETV0803 ETV0805 EBT0906 EBT0907 EBT0910 EBT0911 EBT0912 Chloramphenicol (µg/ml) 64 64 64 64 64 64 Oxytetracycline (µg/ml) 4 64 128 32 64 32 Streptomicine (µg/ml) >1024 >1024 16 >1024 >1024 >1024 >1024 >1024 45 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com Bảng 4.7: Thao tác pha loãng kháng sinh ống nghiệm 10 11 12 Nồng độ cần đạt (ppm) 1024 512 256 128 64 32 16 0,5 Thể tích dung dịch kháng sinh (ml) Thể tích nước muối sinh lý (ml) 25 ml (dd thuốc gốc 1) 25 ml (1024 ppm) 25 ml (512 ppm) 25 ml (dd thuốc gốc 2) 25 ml (128 ppm) 25 ml (64 ppm) 25 ml (32 ppm) 25 ml (16 ppm) 25 ml (8 ppm) 25 ml (4 ppm) 25 ml (2 ppm) 25 ml (1 ppm) 25 ml 25 ml 25 ml 25 ml 25 ml 25 ml 25 ml 25 ml 25 ml 25 ml 25 ml 25 ml Bảng 4.8: Nuôi vi khuẩn nồng độ thuốc kháng sinh khác Số MIC 10 11 12 Hàm lượng cuối (ppm) 512 256 128 64 32 16 0,5 0,125 Thể tích dd thuốc kháng sinh ml (1024 ppm) ml (512 ppm) ml (256 ppm) ml (128 ppm) ml (64 ppm) ml (32 ppm) ml (16 ppm) ml (8 ppm) ml (4 ppm) ml (2 ppm) ml (1 ppm) ml (0,5 ppm) Thể tích vi khuẩn (ml) ml ml ml ml ml ml ml ml ml ml ml ml 46 LUAN VAN LUONG : add luanvanchat@agmail.com PDF created withCHAT FinePrint pdfFactory Prodownload trial version http://www.fineprint.com ... đưa nuôi vùng nước lợ, vi? ??c kháng thuốc vi khuẩn gây bệnh cá tra nuôi vùng nước phổ biến cịn cá tra ni vùng nước lợ kháng thuốc vi khuẩn gây bệnh nào? Do đó, vấn đề cấp thiết nghiên cứu kháng thuốc. .. bệnh cá tra (Pangasianodon hypophthalmus) nuôi vùng nước lợ tỉnh Trà Vinh Bến Tre? ?? thực 1.2 Mục tiêu đề tài Đánh giá kháng thuốc vi khuẩn gây bệnh mủ gan, xuất huyết cá tra nuôi vùng nước lợ tỉnh. .. vi khuẩn từ mẫu cá bệnh Tất vấn đề từ vi? ??c điều tra nêu đòi hỏi cần phải có nghiên cứu đánh giá sơ vấn đề bệnh kháng thuốc vi khuẩn gây bệnh cá tra nuôi vùng nước lợ tỉnh Trà Vinh Bến Tre nên vi? ??c