Nghiên cứu quy trình lên men kết hợp để sản xuất bào tử nấm metarhizium và khả năng diệt mối của bào tử nấm qua lây nhiễm

Tiểu luận Đề tài: “ Nghiên cứu quy trình lên men kết hợp để sản xuất bào tử nấm Metarhizium khả diệt mối bào tử nấm qua lây nhiễm” LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phần I Mở đầu 1.1 Đặt vấn đề Mối (isoptera) lồi trùng có phạm vi phân bố rộng, ưa nhiệt chúng sống vùng có điều kiện khí hậu nhiệt đới cận nhiệt đới Chúng sống thân đê, thân đập, rừng, đồi, thân gỗ, đồ dùng gỗ , khác với nhiều loại côn trùng đơn sinh tổ mối “đơn vị sống” coi “x• hội” riêng biệt, tổ mối tuỳ theo lồi có từ vài trăm đến chục triệu con, chúng sinh sản nhanh có phạm vi phân bố rộng Trên giới đ• giám định 2700 lồi, nước ta đ• giám định 106 lồi Thức ăn chủ yếu mối xenllulo người ta đ• khám phá vai trị mối giúp cho phân huỷ thảm thực vật nhanh chóng, chúng góp phần cải tạo tính chất vật lí đất thơng qua việc đào bới thường xun Ngồi ý nghĩa mặt tự nhiên mối cung cấp nguyên liệu cho ngành y tế làm thuốc chữa bệnh thấp khớp tổ mối nhà kiến trúc sư áp dụng cơng trình kiến trúc Nhưng xét tổng thể mối lồi gây hại Do mối côn trùng chuyên dinh dưỡng nguồn thức ăn có chứa xenlullo nên mối gây hại nhà cửa, cơng trình xây dựng gỗ, đê điều đặc biệt nguy hiểm mối xem “ẩn hoạ thân đê”, đe doạ nghiêm trọng đến sống người Theo nghiên cứu sơ nước ta sức phá hoại chúng thật ghê gớm Ngồi ra, mối cịn phá hại cơng nghiệp hoa màu như: cao su, cà fê, chè, bông, lạc, sắn làm cho chết sinh trưởng kém, cịi cọc từ ảnh hưởng đến suất, chất lượng trồng Trong loài mối gây hại phải kể đến loài mối nhà Coptotermes, chúng phá hại trang thiết bị đồ dùng gỗ, đặc biệt di tích lịch sử Hàng năm mối làm cho hàng chục nhà di tích lịch sử có nguy bị sụp Chính cần phịng trừ mối Hiện có nhiều phương pháp phịng diệt mối phương pháp hố học, vật lý, thủ cơng… Tuy nhiên phương pháp tồn hạn chế Phương pháp hố học thuốc khơng thể tác dụng trực tiếp đến tổ mối được, khó tìm tổ mối chính, mùi vị bị mối phát nhanh chóng, chi phí cho lần tốn kém, đồng thời dẫn đến tính kháng thuốc nguy hiểm phương pháp ảnh hưởng trực tiếp tới sức khỏe người môi trường lượng thuốc sau xử lí thừa phân huỷ khơng hết cịn tồn dư lại Phương pháp vật lí gặp khó khăn việc xác định tổ mối đê đập tổ mối thường nằm sâu lòng đất Hiện nay, hướng phòng trừ mối mở biện pháp phịng trừ sinh học, phương pháp đ• có nhiều cơng trình khoa học ngiên cứu đ• mối bị kí sinh gây bệnh nấm (Metarhizium, Beauveria) vi khuẩn Bacillus, gây Trong chủng vi sinh vật kể Metarhizium chủng nấm có hiệu lực diệt mối mạnh Mặt LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com khác bào tử nấm có kích thước bé (trung bình vài ) chúng lại khơng có mùi vị nên mối khó phát Cơ chế gây hại bào tử nấm Metarhizium sau: Khi bào tử nấm bám dính thể mối, gặp điều kiện thích hợp sau 24 nảy mầm thành ống đâm xuyên qua lớp vỏ kitin hút dinh dưỡng đồng thời tiết chất độc giết chết mối Đây sở khả diệt mối cách lâu dài, hiệu an toàn môi trường người Đây phương pháp diệt trừ mối hay hướng khả thi, nhiên cơng trình nghiên cứu trước giải mức độ hồn thành khâu q trình Do để khẳng định đánh giá hiệu lực diệt mối chế phẩm Metarhizium Vì chúng tơi định thực đề tài “ Nghiên cứu quy trình lên men kết hợp để sản xuất bào tử nấm Metarhizium khả diệt mối bào tử nấm qua lây nhiễm” 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích: - Hồn thành quy trình lên men kết hợp để sản xuất bào tử nấm Metarhizium (m4; m5) phòng trừ mối - Đánh giá khả diệt mối trực tiếp lây nhiễm chế phẩm Metarhizium (m4; m5) sau lên men kết hợp 1.2.2 Yêu cầu: - Xác định đặc điểm hình thái nấm Metarhizium (M4; M5) - Quan sát phát triển bào tử nấm Metarhizium môi trường nuôi cấy kết hợp khác - Xác định ảnh hưởng yếu tố: Lượng mẫu, thời gian lên men kết hợp đến hình thành bào tử nấm Metarhizium - Thử khả diệt mối bào tử chủng Metarhizium (M4; M5) sau lên men kết hợp phương pháp lây nhiễm trực tiếp Phần II Tổng quan tài liệu 2.1 Giới thiệu Metarhizium anisopliae Sorok 2.1.1 Sơ lược lịch sử đời Metarhizium Từ năm 70 kỷ xix, nhà khoa học giới đ• nghiên cứu nhận thấy nhiều loại trìng bị nhiễm bệnh chết chủng vi nấm thuộc lớp nấm bất toàn (Deutermyceter) Năm 1878, nhà bác học người Nga Metschnhikov nghiên cứu bệnh bọ cứng hại lúa mì để tìm phương pháp phịng trừ đ• phát bệnh “nấm xanh” (nấm Entomophthora, đổi tên Metarhizium anisopliae) ơng đ• người học trị Isac Craxinstic nghiên cứu mơi trường ni cấy lồi nấm cho việc thử nghiệm hàng nghìn kilogram nấm để tách bào tử khiết đem LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com thử nghiệm sâu non bọ đầu dài (Boxthinoderes punctriventric) hại củ cải đường Kết sau dùng bào tử chất bột để tung đồng ruộng diệt sâu non đ• cho hiệu gây chết 55-80% sau 10-14 ngày Kể từ nhiều cơng trình nghiên cứu lớn, nhỏ khả ứng dụng Metarhizium cho phòng trừ nhiều đối tượng gây hại khác đ• tiến hành Cho đến đ• xác định 200 lồi trùng đối tượng công loại nấm có lồi mối loại trùng đặc biệt nguy hại 2.2.2 Đặc điểm hình thái Metarhizium anisopliae Metarhizium anisopliae thuộc họ moniliaceae, nấm bơng moniliales, lớp nấm bất tồn Deuteromycetes (Fungi imperfecty), có kiểu phát sinh bào tử trần nhóm Hyphomycetes [4] Trong chi Metarhizium có hai loại nấm xác định nhiều việc kí sinh gây bệnh cho trùng Metarhizium anisopliae Metarhizium flavoviride Nấm Metarhizium có màu lục xanh lục nên người ta gọi nấm lục cương Đặc điểm hình thái: Sợi nấm phát triển bề mặt trùng có màu từ trắng đến hồng, cuống sinh bào tử ngắn, mọc tỏa tròn đầu sợi nấm dày đặc Bào tử trần hình que 3,5 x 6, x 7,2 Màu từ lục xám đến oliu đến lục Bào tử xếp thành hình chuỗi chặt chẽ nhìn mắt thường người ta thấy bào tử tạo bề mặt thể côn trùng lớp phấn rõ màu xanh lục [14] Nấm Metarhizium anisopliae có bào tử dạng hình trụ, hình hạt đậu, khuẩn lạc có màu xanh hồng Chúng phát triển nhanh môi trường Czapek- Dox nuôi nhiệt độ 28oC (nuôi tủ định ôn) sau – 10 ngày ni cấy khuẩn lạc có đường kính - 8,5 cm Loại nấm Metarhizium anisopliae có hai loài dạng bào tử nhỏ lớn Tuy nhiên Metarhizium anisopliae chủng gây bệnh mạnh côn trùng thuộc cánh cứng Coleoptera 2.1.3 Đặc điểm sinh lý sinh hoá Metarhizium anisopliae Nấm Metarhizium anisopliae sinh trưởng tốt chất có kitin, chúng sống nhiệt độ thấp 80C, có biên độ độ ẩm rộng nơi tích lũy nhiều CO2và thiếu O2 chúng sống tới 445 ngày nhiệt độ nhỏ 100C lớn 450C nấm khơng thể hình thành bào tử Nhiệt độ thích hợp cho nảy mầm bào tử 280C pH = 6,8 - 70 dao động từ 3,3 – 8,5 Nấm có khả phân giải xenlulose kitin (lơng lớp vỏ ngồi trùng) [14] Độc tố diệt côn trùng nấm: Gồm số độc tố có tên DestruxinA, B, C, hay D Các ngoại độc tố sản phẩm thứ cấp vòng peptit, L-prolyn, L –leucine, anhydrie, L-prolyn, L-valine anhydride Desmethyl Destruxin B [12] 2.1.4 Cơ chế gây bệnh Metarhizium LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bào tử nấm phát tán gió lây nhiễm qua tiếp xúc cá thể mang mầm bệnh sau bám vào thể côn trùng, gặp ẩm độ nhiệt độ thích hợp (xâm nhập qua đường hơ hấp) bào tử nấm nảy mầm tiết độc tố Destruxin làm tê liệt hệ thần kinh côn trùng sử dụng dinh dưỡng trùng từ làm cho hệ quan côn trùng suy yếu dần chết sau 2-5 ngày phụ thuộc vào kích cỡ trùng Xác trùng chết thường khơ, khơng có mùi thối Sau vài ngày sợi nấm sẻ đâm qua lớp vỏ kitin lại phát tán bào tử ngồi tiếp tục chu trình gây bệnh với trùng 2.2 Tình hình nghiên cứu sử dụng Mertarhizium phòng trừ mối 2.2.1 Tình hình nghiên cứu sử dụng Metarhizium giới Những năm cuối kỷ xx, nhiều công trình nghiên cứu đ• khẳng định điều kiện tự nhiên vi nấm nhân tố gây chết quan trọng nhiều lồi trùng Mỗi nhóm trùng bị ảnh hưởng số vi nấm định Người ta đ• xác định 700 lồi vi nấm mầm bệnh cho lồi trùng Tuy nhiên, vào mức độ gây chết, điều kiện nuôi cấy, điều kiện sản xuất phổ tác dụng, người ta tập trung nghiên cứu vào nhóm vi nấm: Metarhizium, Beauveria, Verticilum Paecilomyces [14], [15] Metarhizium xác định mầm bệnh nguy hiểm 200 lồi trùng Tuy Metarhizium có lồi lại có nhiều chủng khác chủng thích nghi cao nhóm trùng xác định Trong nghiên cứu ứng dụng, vấn đề quan trọng hàng đầu phải tuyển chọn chủng thích nghi, có hiệu lực cao nhóm trùng xác định (Hanel 1982, Tanada Kaya 1993) theo Milner cộng [15] Những năm gần đây, xuất ngày nhiều cơng trình nghiên cứu sử dụng vi nấm để diệt trừ côn trùng, nghiên cứu sử dụng Metarhizium để phòng trừ mối kết 11 chế phẩm vi nấm diệt trùng đ• đưa vào sử dụng, có chế phẩm Metarhizium: chế phẩm BioBlast Mỹ dùng để diệt mối đất Đài Loan (Coptotermes formosanus); chế phẩm GreenMuscle Nam Phi để diệt châu chấu (Locusts); chế phẩm BioGreen úc để diệt bọ ngô đầu đỏ (Redheaded cokchafer) úc, nhóm nghiên cứu thuộc viện nghiên cứu côn trùng thành phố Canbera, tiến sỹ Milner (1998) chủ trì đ• nghiên cứu tuyển chọn từ 97 chủng Metarhizium, phân lập từ nguồn khác nhau, có chủng FI-1186 FI- 610 có hiệu lực mạnh ổn định loài mối Nasutitermes exitosus Coptotermes lacteus Họ đ• tiến hành hàng loạt thí nghiệm cho thấy nấm không lây nhiễm vào vật chủ đường tiêu hóa, mà trực tiếp xâm nhập qua vỏ thể, ấu trùng non bị tiêu diệt Xác mối bị chết nấm khô cứng, đầy sợi nấm trắng, sau tạo thành hệ bào tử màu xanh LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com đậm Các bào tử nảy mầm gặp độ ẩm cao thời tiết thích hợp Tuy nhiên thử nghiệm thực phịng thí nghiệm quy mơ nhỏ Tại Canada, nhóm nghiên cứu tiến sỹ Bary H.Track (1999) đứng đầu thuộc phòng thí nghiệm trùng học, trường đại học tổng hợp Toronto thử nghiệm số chủng nấm Metarhizium để diệt loài kiến loài mối Reticulitermes flavipes (loài mối gây hại nghiêm trọng cho cơng trình kiến trúc thành phố Toronto) Họ đ• phân lập số chủng vi nấm lồi Metarhizium anisopliae có hoạt lực cao với mối Reticulitermes flavipes Họ quan sát thấy bào tử vi nấm bám lên vỏ thể mối, mọc xun vào mơ hệ tuần hồn, giết chết mối vòng 24-48 giờ, tùy thuộc vào liều lượng tác dụng Bào tử vi nấm lây truyền từ cá thể sang cá thể khác thông qua hàng loạt hoạt động tiếp xúc trực tiếp với cá thể quần thể việc trao đổi thức ăn, tiêu thụ chất tiết, việc làm vệ sinh cho Vấn đề họ quan tâm nghiên cứu khả phát ngăn chặn mối đ• bị nhiễm bào tử vi nấm quần thể mối Mỹ, trung tâm hiệp hội nghiên cứu mối ngầm Đài Loan, M Guadalupe Rojas cộng (2000), đ• chứng minh bào tử lồi vi nấm bám vào vỏ kitin thể mối Coptotermes formosanus để nảy mầm, sau sợi nấm phát triển đâm xuyên vào thể mối diệt mối tốt Họ khẳng định bào tử nấm không độc với người, động vật môi trường Hướng nghiên cứu họ sử dụng bào tử vi nấm trộn với diflubensuzon vị trí đặt bả hỗn hợp Năm 2002, Tiến sỹ Haimanot Abebe đ• tiến hành thử nghiệm bào tử Metarhizium mối Macrotermes subhyalinus vùng Lenkemt Zuria (Ethiopia) Ơng đ• thử nghiệm bào tử ba nồng độ 4,6; 9,3 20 gram bào tử / tổ, tổ Macrotermes thử nghiệm có tuổi từ đến năm Sau 60 ngày thử nghiệm tỷ lệ mối chết đạt 61%, 64% 74% nồng độ tương ứng Sau 75 ngày tác giả quan sát thấy nấm Xylaria mọc tổ mối đ• thí nghiệm Tại hội nghị hố học mỹ tháng 4/2002 người ta đ• đưa trí phải thay phương pháp phịng trừ mối trùng, b• mối chế phẩm sinh học vi nấm Metarhizium, beauveria vi khuẩn bacillus Chế phẩm Bio Blast mỹ Ecoscience sản xuất bán thị trường dựa vào kết thử nghiệm mối Coptotemes fomosanus 1000 điểm khắp 11 bang bị mối hại nước mỹ, chế phẩm sản xuất theo phương pháp lên men xốp sử dụng hai dạng bột mịn huyền phù, người ta tiến hành nghiên cứu cho thêm chất phụ gia để tăng tính dính bám đưa lượng bào tử Metarhizium vào 10% số cá thể quần thể mối 2.2.2 Nghiên cứu nước Việc nghiên cứu nấm gây bệnh trùng đ• cán khoa học kỹ thuật số trường đại học viện nghiên cứu bắt đầu tìm hiểu sâu nghiên LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com cứu chúng từ năm 70 thập kỷ XX Theo Phạm Bình Quyền (1994), sở khoa học phịng trừ sinh học, phòng trừ tổng hợp hiểu quy luật chế tự nhiên điều chỉnh số lượng côn trùng, nhằm sử dụng tối ưu chế vào việc hạn chế tác hại trùng gây nên nói chung mối nói riêng Tác giả đ• phân tích sâu sắc quan hệ vật chủ vật ký sinh thông qua yếu tố quần thể vật chủ vật ký sinh Đối với nhóm trùng khơng có đời sống x• hội, vai trị điều chỉnh số lượng trùng dịch bệnh thường thể mật độ quần thể gia tăng đến mức gần cực đại [12] Năm 1981 GS.TS Nguyễn Lân Dũng nghiên cứu nấm lục cương Metarhizium mơ tả hình thái, phân tích chế tác dụng, hướng dẫn cách phân lập, nuôi cấy phương pháp sản xuất sinh khối Metarhizium [4] Từ năm 1992, Phạm Thị Thùy cộng thuộc viện Bảo vệ Thực vật đ• phân lập, ni cấy thử nghiệm chủng Metarhizium thuộc loài Metarhizium anisopliae Metarhizium flavoviride để phịng trừ cho lồi sâu bọ hại nông, lâm nghiệp phương pháp phun trực tiếp bào tử Metarhizium đồng ruộng [5], [6], [7], [8] Năm 1996, Tạ Kim Chỉnh đ• phân lập, ni cấy số chủng Metarhiziumanisopliae thử nghiệm để diệt châu chấu di cư loài sâu bệnh hại nông nghiệp Tác giả thử nghiệm bào tử M anisopliae mối Coptotermes formosanus cho biết mối chết nấm sau ngày 91,35% mật độ 18 x 107 bào tử / ml Ngoài ra, tác giả thử nghiệm châu chấu di cư (Locusta mirgratioria) hiệu đạt tới 92,2% Năm 1997, Đại học Quốc gia Hà Nội đ• nghiệm thu đề tài: “Nghiên cứu vi nấm Metarhizium ansopliae chống mối hại trồng” Trong đ• phân lập nhiều chủng nấm có khả chống mối quan trọng bảo quản Bảo tàng giống vi sinh vật trường Năm 1998 Dương Ngọc Khê cộng thuộc viện khoa học lâm nghiệp đ• nghiên cứu tuyển chọn số chủng nấm Metarhizium để thử khả diệt mối coptotemes fomosanus phịng thí nghiệm, nghiên cứu đ• đưa chế phẩm LT50 , LT100 , LD50, LD100 chủng Metarhizium đ• tuyển chọn Coptotemes fomosanus cho biết có chủng có hiệu lực diệt mối cao [2] Phạm Thị Thùy cộng (2002- 2003) đ• nghiên cứu sử dụng nấm Metarhizium anisopliae để diệt bọ hại dừa cho tỉnh Bình Định phương pháp phun trực tiếp Kết cho thấy chế phẩm nấm Metarhizium anisopliae có hiệu cao với sâu non trưởng thành bọ dừa, đặc biệt hiệu kéo dài đến tuần sau phun, hiệu thể rõ dừa phục hồi màu xanh trở lại, điểm giá trị chế phẩm nấm hiệu kéo dài, nấm không gây ô nhiễm môi trường nguy hiểm người, không làm lồi kí sinh thiên địch có ích khác LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Từ năm 1998 đến năm 2002, Trịnh Văn Hạnh cộng Trung tâm nghiên cứu phịng trừ mối đ• nghiên cứu tuyển chọn chủng Metarhizium có hiệu lực cao để phịng trừ lồi mối gây hại điển hình nước ta, loài mối nhà nguy hiểm Coptotermes formosanus Shiraki; loài mối hại đê Odontotermes hainanensis loài mối hại đập Macrotermes annandalei Khi nuôi cấy môi trường Czapek - Dox mơi trường Sabouraud có bổ sung kitin đ• thu hàng trăm gram bào tử với khối lượng trung bình từ 1,9 x 109 đến 8,25 x 1010 bào tử/g Kết thử nghiệm trực tiếp lây nhiễm mối điều kiện phòng thí nghiệm mơ sau [9], [10] Từ 23 chủng vi nấm thu thập phân lập từ nguồn khác đ• tuyển chọn chủng Metarhizium có chủng phân lập từ tổ mối chết ngồi trường có khả gây bệnh làm chết mối điều kiện phịng thí nghiệm Với chủng chọn lọc có hiệu lực diệt mối cao M1, M2, M3 LT50 mối Coptotermes formosanus trung bình 2,6 ngày sau nhiễm bào tử Metarhizium Bào tử chủng M1, M2, M3 khơng có khả diệt mối C formosanus tiếp xúc trực tiếp mà truyền từ cá thể sang cá thể khác đàn mối, tỷ lệ số cá thể mối bị nhiễm bào tử lúc đầu đóng vai trị định Hiệu phương pháp thử nghiệm diệt mối C formosanus lây nhiễm bào tử M1 rõ ràng Tỷ lệ nhà dân thử nghiệm hết mối đạt gần 90% Kết mở triển vọng việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm diệt mối C formosanus lây nhiễm thay biện pháp dùng hoá chất Mối cánh O hainanensis bị chết 100% sau - 10 ngày đất đ• rắc bào tử M3 cho phép nghĩ tới khả nghiên cứu sản xuất chế phẩm để phun phòng mối cánh mặt đê vào mùa mối bay phân đàn Một phần kết nghiên cứu đ• trình bày Hội nghị Quốc tế Vi sinh vật Bangkok, Thái Lan tháng / 2000 Năm 1997 đại học quốc gia hà nội đ• nghiệm thu đề tài “ nghiên cứu vi nấm Metarhizium anisopliae chống mối hại trồng” Trong đ• phân lập nhiều chủng nấm có khả chống mối quan trọng bảo quản bảo tàng giống vi sinh vật trường Đ• có nhiều cơng trình sâu nghiên cứu hoạt tính Enzym ngoại bào chủng nấm Metarhizium là: - Năm 1995 tác giả Smithson S.L cộng đ• nhân vơ tính đặc trưng gen m• hố enzym Protease phân giải cutin từ nấm gây bệnh cho côn trùng Metarhizium anisopliae [17] - Năm 2000 tác giả Gillespie J.P; Charnley A.K đ• nêu vai trò Protease phân giải cutin từ nấm gây bệnh cho côn trùng Metarhizium anisopliae Mở hướng nghiên cứu cho công nghệ sinh học việc phịng chống bệnh trùng gây [18] LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Mới đây, sinh viên Lê Thùy Qun, trường é?i h?c Phuong éơng, đ• nghiên cứu thành công d? tài: “Nghiên cứu công ngh? s?n xu?t ch? ph?m n?m Metarhizium anisopliae sorok d? ?ng d?ng phòng tr? sâu hại tr?ng” Chế phẩm nấm Metarhizium từ nghiên cứu Lê Thuỳ Quyên diệt trừ loài sâu xanh bướm trắng, sâu khoang ăn đặc biệt khả tiêu diệt số lồi trùng hại sống đất bọ hung, mối đất ứng dụng thực tế nấm Metarhizium để tiêu diệt bọ đen ăn mía, mối đất ăn thông trắng, bồ đề, hại điều, ăn quả, sâu xanh bướm trắng ăn su hào, bắp cải, sâu khoang hại cà chua cho kết diệt trừ sâu bệnh 70% Một hướng nhà khoa học nghiên cứu để sản xuất sinh khối nấm Metarhizium nguồn chất rẻ tiền mà thu sinh khối lớn [5] Nghiên cứu sử dụng Metarhizium để phòng trừ mối hướng nghiên cứu nhiều nhà khoa học nước quan tâm Các kết nghiên cứu phân lập, nuôi cấy, tuyển chọn thử nghiệm bào tử khiết để diệt trừ trực tiếp cá thể mối định điều kiện phịng thí nghiệm đ• làm sáng tỏ chế gây bệnh hiệu lực diệt mối cao nấm mối Tuy nhiên, điều quan trọng không tuyển chọn chủng Metarhizium có hiệu lực diệt mối cao phịng thí nghiệm mà cịn phải nghiên cứu quy trình lên men để sản xuất thu bào tử nhiều Trong trình sản xuất thu bào tử phải sử dụng nguồn nguyên liệu thô, rẻ tiền mà thu lượng bào tử nhiều từ lựa chọn mơi trường thích hợp để sản xuất qui mô rộng với giá thành phải rẻ Để lựa chọn quy trình lên men kết hợp thích hơp cho sinh trưởng phát triển chủng Metarhizium đề tài đáp ứng phần nhiên để có quy trình lên men kết hợp thích hơp cần nghiên cứu thêm 2.2 Mối nhà Coptotermes foramsanus Shiraki Loài mối Coptotermes giống mối phân bố rộng r•i giới Chúng thuộc họ Rhinotermitidae hay cịn gọi nhóm mối ngầm thị (Urban subterranean termite) Đến đ• xác định 28 lồi thuộc giống mối [1], [3] Đặc trưng giống mối mối lính có hình ovan hình trứng Trên đầu có lỗ trán lồi phía trước Từ mối lính tiết dịch màu trắng sữa Dịch chuyển thành chất co gi•n cao su tiếp xúc với khơng khí Râu có từ 14-16 đốt, lưng ngực trước phẳng Mối cánh đầu hình trứng, râu có từ 18-23 đốt Tấm lưng ngực trước hẹp đầu, vẩy cánh trước hẹp phía cánh sau, gân cánh hình lưới màu nhạt, mặt cánh có lơng [1] Coptotermes giống mối gây nhiều thiệt hại cho người khả thích nghi cao với điều kiện mơi trường Chúng công trực tiếp vật liệu, đồ dùng gỗ xuyên qua mạch vữa xi măng mác thấp, ngầm lớp bê LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com tông, nhựa đường vào làm tổ cơng trình xây dựng, gây ảnh hưởng đến ổn định, an tồn mỹ quan cơng trình Vì vậy, mối Coptotermes xếp vào nhóm mối hại cơng trình xây dựng (cịn gọi mối nhà) Tuy nhiên, số lồi thuộc nhóm cịn gây hại cho làm tổ thân đê, đập [11] 2.2.1 đặc tích sinh học: Trong lồi thuộc giống Coptotermes Coptotermes formosanus Shiraki lồi có phân bố rộng giới Lồi mối có nguồn gốc từ Đài Loan (Trung Quốc), làm tổ ngầm đất cấu trúc khác cơng trình, nên cịn có tên gọi chung mối ngầm Đài Loan (Formosan subterranean termite-FST) Nó đưa vào nhật bản, Guam, Srilanka, Nam Phi Mỹ sau chiến tranh giới thứ hai, tàu thủy phương tiện chở loài mối ngầm phát tán khắp giới Đến nơi mới, nhờ thích ứng cao khả sinh sản lớn mối Coptotermes formosanus đ• nhanh chóng phát triển mở rộng vùng phân bố Tuy mối Coptotermes formosanus loài bay yếu, với khả thay mối chúa phân đàn nhanh chóng với việc người di chuyển đất vật liệu đ• bị nhiễm mối góp phần tạo lan tràn nội địa loài mối Phần lớn đàn mối Coptotermes formosanus làm tổ ngầm đất hay cấu trúc cơng trình xây dựng Tổ chúng lớn, xốp thường có hình nón có hình dạng khác phụ thuộc vào vị trí làm tổ, có màu nâu đen màu xám tro [1], [3] Mối sử dụng chất tiết trộn với gỗ vụn đất làm nguyên liệu xây tổ Cấu trúc tổ tuân theo quy định chặt chẽ Các cột đất xây theo dạng “cánh sao” nối với cách tinh vi, thuận lợi cho mối di chuyển, lại cản trở cho kẻ muốn xâm nhập Phía đáy tổ, mối tạo nhiều phiến mỏng xếp chồng lên nhau, phiến có lỗ nhỏ để mối chui qua Giữa phiến khe, hốc rỗng, sống ổn định khoang đó, gọi hồng cung Coptotermes formosanus lồi mối khơng làm vườn cấy nấm, nên tổ chúng có cấu trúc rỗng đơn giản lồi mối làm tổ có vườn cấy nấm Việc điều tiết vi khí hậu tổ đơn giản Chúng tập trung số lượng cá thể tổ nhiệt môi trường xuống thấp phân tán nhiệt độ lên cao [1] Hàng năm vào khoảng tháng 4, tháng tháng có sớm lúc mà thời tiết, khí hậu thuận lợi cho mối bay giao hoan, khoảng thời gian mà tổ mối bắt đầu hình thành Mối thường bay vào lúc hồng hơn, độ ẩm khoảng 95% Vào mùa mối bay bắt gặp hàng ngàn mối cánh bay cửa sổ, xung quanh nguồn sáng cố định Sau vài bay, chúng hạ cánh xuống đất hay vị trí để tự rụng cánh cặp đơi Mỗi tổ Coptotermes formosanus có số lượng mối cánh trưởng thành lớn có LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com - Tiến hành lên men chìm hai chủng nấm Metarhizium (M4, M5) môi trường (sabouraud, czapek-Dox) với thời gian định (2-10) ngày, lượng mẫu thích hợp 4-10%(ml/g) Sau lấy mẫu cấy lên mơi trường lên men xốp (cơm từ gạo, trấu cám) thời gian từ 10-15 ngày thu đếm số lượng bào tử đĩa petri - Mục đích thí nghiệm: Xác định môi trường tốt nhất, thời gian lượng mẫu thích hợp (mỗi cơng thức thí nghiệm nhắc lại lần) - Kết thí nghiệm 3.2.1.3.Thí nghiệm 3: Thí nghiệm xác định hiệu lực diệt mối bào tử Metarhizium phương pháp rắc bào tử trực tiếp đĩa petri (lượng bào tử Metarhizium tính theo gam) Thí nghiệm tiến hành đĩa petri với 100 mối (90 mối thợ với 10 Mối lính): Mỗi công thức nhắc lại lần CT : Đối chứng (không cho bào tử) CT : 0,005g bào tử nấm Metarhizium (M4, M5) CT : 0,01g bào tử nấm Metarhizium (M4, M5) CT : 0,03g bào tử nấm Metarhizium (M4, M5) CT : 0,05g bào tử nấm Metarhizium (M4, M5) - sau 24 bắt đầu đếm số cá thể mối chết - sau 10 ngày tổng kết chọn nồng độ diệt mối thích hợp - Yêu cầu thí nghiệm xác định lượng bào tử khiết tính theo (gam) thích hợp - kết thí nghiệm 3.2.1.4 Thí nghiệm4: xác định hiệu lực diệt mối bào tự Metarhizium phương pháp lây nhiễm mô hình hộp (mối sau đ• nhuộm chất Xanh methylen) Phương pháp lợi dụng số tập tính quan hệ đời sống x• hội mức tiếp xúc thường xuyên cá thể mối có đẳng cấp khác tổ mối để truyền bào tử vào tổ mối làm chết tổ mối Thí nghiệm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Đối chứng 1, 3, 4: Hộp nhựa màu trắng, hình chữ nhật (20cmx15cm), có nắp đậy khoan lỗ để nối ống dây hình mơ tả 2: Là ống dẫn màu trắng có đường kính 0.8cm, chiều dài ống thay đổi 10cm, 50cm, 100cm, 300cm Tổng số cá thể mối đem thí nghiệm hộp 1000 (có thể 2000, 5000 con) có 10% mối lính, số cá thể nhiễm bào tử Metarhizium 20% - Lượng bào tử Metarhizium đem nhiễm xác định thích hợp có đựơc từ thí nghiệm Số lần nhắc lại lần, lấy giá trị trung bình, điều kiện tiến hành nhau, quan sát, mô tả tượng xảy ra, xác định số ngày mối chết 100% 3.2.2 Phương pháp nghiên cứu: 3.2.2.1 Chuẩn bị dụng cụ mơi trường thí nghiệm * Chuẩn bị dụng cụ - Đĩa petri thuỷ tinh, ống nghiệm rửa sạch, để khơ, gói giấy báo đem khử trùng phương pháp nhiệt khô (121oC giờ) - Khử trùng vệ sinh buồng cấy trước sau sử dụng - Các dụng cụ que cấy, đũa thuỷ tinh phải khử trùng lửa đèn cồn trước sau cấy nấm - Dụng cụ để nhử mối, bắt mối, nuôi mối… * Chuẩn bị môi trường Sử dụng môi trường Czapek - Dox Sabouraud Môi trường hấp khử trùng 121oC 20 phút Môi trường đổ đĩa: Môi trường sau khử trùng để nguội đến 50 -60oC, bổ sung kháng sinh Lắc nhẹ bình mơi trường để đảm bảo môi trường đồng trước LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com đổ đĩa Việc đổ đĩa thực buồng cấy vô trùng, rót vào đĩa petri thuỷ tinh lượng mơi trường thích hợp khoảng 20ml/đĩa Mơi trường chìm: mơi trường Sabouraud, czapek-Dox không bổ sung agar, dùng để nuôi cấy nhân giống cấy chuyển sang môi trường xốp Môi trường lên men xốp: +CT1: Môi trường 100% cơm từ gạo : +CT2: Môi trường trấu cám (20% trấu, 80% cám từ gạo) 3.2.2.2 Phương pháp xác định đặc điểm hình thái, hình dạng bào tử, sợi khí sinh cuống phát sinh bào tử chủng nấm Metarhizium (M4, M5) - Nuôi quan sát khuẩn lạc hai chủng nấm Metarhizium (M4; M5) môi trường Czapek-Dox có hai giai đoạn + Thứ nhất: Cấy chấm bào tử hai chủng Metarhizium (M4; M5) lên đĩa petri theo dõi quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc (màu sắc, kích thước, tốc độ phát triển ) khuẩn lạc hai chủng nấm Metarhizium (M4; M5) + Thứ hai: Quan sát bào tử, sợi khí sinh khuẩn lạc kính hiển vi thực cách cấy gạt bào tử lên đĩa petri Sau ngày cắm lamen lên đĩa petri vừa gạt nghiêng góc 45o so với mặt thạch, sau ngày lấy lamen đem soi kính hiển vi quan sát đặc điểm hình thái bào tử, sợi khí sinh hai chủng nấm Metarhizium (M4; M5) - Theo dõi sinh trưởng, phát triển, phát sinh bào tử đếm bào tử nấm hai chủng nấm Metarhizium (M4; M5) môi trường với điều kiện ta cần xác định từ xác định mơi trường, thịi gian, lượng mẫu thích hợp Có hai phương pháp đếm bào tử đếm trực tiếp kính hiển vi đếm gián tiếp phương pháp pha loảng bào tử sau cấy lên mơi trường thạch đặc sau ngày đếm khuẩn lạc đĩa petri + Đếm trực tiếp kính hiển vi: sử dụng phòng đếm hồng cầu (Thoma, Goriaev) Nguyên tắc: Đếm số lượng bào tử có đơn vị thể tích phịng đếm từ suy số lượng tế bào có 1ml nhân với độ pha lo•ng đ• biết số tế bào dịch ban đầu Phịng đếm hồng cầu có 25 lớn, khoảng trống phiến kính kính có chiều cao 0,02 mm, tổng diện tích 1mmơơơ2 Như 1cm3 (1ml) ứng với x 104 lần thể tích phịng đếm Cách tiến hành: Pha lo•ng cho mẫu vào phịng đếm, khơng để tràn ngồi Đếm số lượng bào tử có vài lớn, tính giá trị trung bình (a) Gọi K hệ số pha lo•ng Số bào tử/ml =a x 25 x 5.104 x 1/K + Phương pháp đếm số khuẩn lạc đĩa thạch: Để xác định tổng số tế bào có đơn vị thể tích người ta thường dùng thuật ngữ “đơn vị hình thành khuẩn lạc đơn vị thể tích” (CFU/v – Conoly Forming Unit/v) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Ưu điểm phương pháp tế bào sống phát Muốn tách rời tế bào cần pha lo•ng mẫu kèm lắc mạnh dịch đ• pha lo•ng Sau thu dịch đ• pha lo•ng nồng độ khác ta tiến hành bắt dầu từ ống nghiệm lo•ng cấy lên đĩa petri vô trùng nhỏ lên dàn mặt thạch, đĩa có ghi ký hiệu tương ứng với độ pha lo•ng sau ủ 25oC ngày Sau tiến hành đếm số khuẩn lạc đĩa thạch tính kết Trừ đĩa thạch khuẩn lạc dầy đặc khơng đếm lấy đĩa khuẩn lạc có đơn vị đo khoảng 30 CFU -300 CFU Từ số khuẩn lạc đĩa suy số tế bào (CFU) có mẫu vật cách tương đối CFU/ml(g) = a x 1/K x1/V a- Số khuẩn lạc trung bình xuất đĩa cấy có nồng độ pha lo•ng V - Thể tích pha lo•ng dược cấy gạt mặt đĩa thạch K - Độ pha lo•ng dịch cấy 3.2.2.3 Phương pháp thu bào tử thử khả diệt mối từ chủng đ• ni cấy từ mơi trường xốp Tiến hành thí nghiệm: Sau 15 ngày nuôi cấy môi trường xốp lấy nấm khỏi túi ni lông phơi khơ nhiệt độ phịng tránh ánh nắng trực tiếp, sau đem nghiền nhỏ dùng sàng 2-3mm sàng hạt để thu bào tử tinh khiết Cân 0.005gam, 0.01gam, 0.03gam, 0.05 đĩa đối chứng bào tử cho vào đĩa (kích thước x 1,5 cm) mối đ• đếm sẵn (10% mối lính+ 90% mối thợ) - Hàng ngày theo dõi đếm số lượng mối chết đĩa Thống kê số liệu để đánh giá chung - Đánh giá chọn nồng độ thích hợp chủng Metarhizium có hiệu lực diệt mối cao hiệu kinh tế 3.2.2.4 Thử hiệu lực diệt mối qua lây nhiễm bào tử nấm Metarhizium tổ mối mơ hình hình hộp - Phương pháp lây nhiễm phương pháp nhiều sở phòng chống mối quần thể sử dụng rộng r•i để xử lý mối nước ta Phương pháp lợi dụng số tập tính mức độ quan hệ, tiếp xúc thường xuyên cá thể mối khác đẳng cấp quần thể mối để truyền chất độc từ số cá thể sang quần thể làm chết tổ mối - Mối thí nghiệm Coptotemes fomosanus lấy từ tổ mối phịng sinh học phân tử – Bộ môn sinh học ứng dụng – Khoa công nghệ sinh học, đưa vào đĩa petri (kích thước 9cm x 1,5 cm), đáy có miếng giấy lọc đ• nhuộm XanhMethylen nồng độ 35%, có độ ẩm phù hợp, để đảm bảo cho điều kiện sống bình thường, đĩa petri có 100 mối 10% mối thợ, có đĩa đối chứng cịn lại đĩa có chất Xanhmethylen nhuộm lên giấy, sau khoảng thời gian 1giờ, giờ, 24giờ đếm số cá thể đĩa petri đ• bị nhuộm màu (trừ mối thợ) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com - Sau thu mối bị nhuộm màu gần hoàn tồn ruột trước, ruột ruột sau tiến hành thí nghiệm xác định khả di chuyển mối mơ hình hộp Hộp nhựa màu trắng, hình chữ nhật (20cmx15cm), có nắp đậy khoan lỗ để nối ống dây hình mơ tả Là ống dẫn màu trắng có đường kính 0.8cm, chiều dài ống thay đổi 10cm, 50cm, 100cm, 300cm Tổng số cá thể mối đem thí nghiệm hộp 1000 (có thể 2000, 5000 con) có 10% mối lính, số cá thể nhiễm bào tử Metarhizium 20% - Lượng bào tử Metarhizium đem nhiễm xác định thích hợp có đựơc từ thí nghiệm Số lần nhắc lại lần, lấy giá trị trung bình, điều kiện tiến hành nhau, quan sát, mô tả tượng xảy ra, xác định thời gian mối chết 100% Phần IV Kết nghiên cứu thảo luận 4.1 Kết quan sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc, bào tử, sợi khí sinh cuống phát sinh bào tử hai chủng nấm Metarhizium (M4; M5) Hai chủng nấm Metarhizium (M4; M5) lấy từ phịng thí nghiệm vi sinh, Bộ mơn sinh học phân tử vi sinh vật ứng dụng – Khoa Công Nghệ Sinh học Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội Tiến hành quan sát số đặc điểm hình thái, màu sắc khuẩn lạc, dạng bào tử hai chủng nấm Metarhizium (M4; M5) Thí nghiệm tiến hành môi trường Czapek – Dox, kết quan sát khuẩn lạc trình bày trình bày bảng bảng Hình 1: Khuẩn lạc chủng M4 sau 10 ngày nuôi cấy mơi trường Czapek-Dox Hình2: Bào tử sợi khí sinh cuống phát sinh bào tử chủng M4 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com sau ngày nuôi cấy môi trường Czapek- Dox TG nuôi cấy (ngày) ĐK khuẩn lạc (cm) Đặc điểm ni cấy Đặc điểm hình thái bào tử trần Màu sắc mặt trước khuẩn lạc màu sắc mặt sau khuẩn lạc dạng mặt khuẩn lạc hình dạng cuống bào tử bề mặt bào tử màu sắc bào tử trần 1,22 Màu trắng màu trắng Nằm ngang E líp Mịn Xanh rêu 3,41 xanh lục, xung quanh màu trắng xanh nhạt xung quanh màu trắng 6,02 xanh lục – xanh nhạt – màu trắng màu trắng xanh nhạt màu trắng 7,25 xanh lục – xanh nhạt – xanh lục –màu trắng vàng xanh màu vàng xanh 10 8,46 xanh lục – xanh nhạt – xanh lục –màu trắng màu vàng xanh nhạt xung quanh màu trắng Bảng 1: Đường kính, đặc điểm hình thái, màu sắc khuẩn lạc bào tử chủng nấm Metarhizium M4 Hình 3: Khuẩn lạc chủng M5 sau 10 ngày nuôi cấy môi trường Czapek-Dox Hình 4: Bào tử, sợi khí sinh cuống phát sinh bào tử chủng M5 sau ngày nuôi cấy mơi trường Czapek-Dox Bảng 2: Đường kính, đặc điểm hình thái, màu sắc khuẩn lạc bào tử chủng nấm Metarhizium M5 TG nuôi cấy (ngày) ĐK khuẩn lạc (cm) Đặc điểm ni cấy Đặc điểm hình thái bào tử trần LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Màu sắc mặt trước khuẩn lạc màu sắc mặt sau khuẩn lạc dạng mặt khuẩn lạc hình dạng cuống bào tử bề mặt bào tử màu sắc bào tử trần 1,32 xanh nhạt xung quanh màu trắng màu trắng Xanh lục 3,56 xanh rêu đậm xung quanh màu trắng màu trắng nằm ngang Elíp mịn vàng xanh xung quanh 5,72 màu xanh lục xung quanh màu trắng màu vàng đến vàng xanh màu trắng 7,24 xanh lục đến xanh nhạt cung màu trắng vàng xanh đến xanh nhạt đến trắng 10 8,43 xanh lục xung quanh màu trắng màu vàng đến vàng xanh đến trắng Kết bảng bảng cho thấy, hai chủng M4 M5 có đặc điểm gần giống với màu sắc khuẩn lạc, màu sắc mặt sau khuẩn lạc dạng mặt khuẩn lạc Bào tử hai chủng có hình dạng giống có bề mặt mịn, song màu sắc chúng khác nhau, chủng màu xanh rêu (M4) có vịng màu sắc nhạt đậm xen kẻ tạo nên vịng trịng đồng tâm hình vịng trịn năm gỗ Còn chủng màu xanh lục (M5) bề mặt có hệ sợi nấm màu trắng xung quanh khuẩn lạc Kích thươớc khuẩn lạc đo sau 10 ngày nuôi cấy môi trường Czapek - Dox chủng M4 M5 khơng chênh lệch điều cho thấy ni cấy mơi trường thích hợp nhiệt độ thích hợp hai chủng nấm phát triển tốt 4.2: Lựa chon môi trường, thời gian, lượng mẫu lên men thích hợp Để thực lên men kết hợp phải tiến hành lên men chìm hai chủng nấm bình thuỷ tinh ni máy lắc với thời gian ngày 28oC, 200 vịng/phút sau dùng pipet 1ml hút lượng mẫu cấy lên môi trường xốp Sau 10 ngày nuôi cấy khối chất đ• thể sinh trưởng LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com phát triển chủng nấm Metarhizium mức nhiều nhiều qua màu sắc, từ màu xám môi trường cơm màu vàng xám mơi trưịng trấu cám chuyển thành màu xanh thẫm xanh lục Sau lên mên xốp bóng kính 15 ngày đem phơi khơ nhiệt độ phịng khoảng ngày, sau dùng sàng để thu bào tử dạng tinh khiết xác định hàm lượng bào tử cách pha lo•ng đếm khuẩn lạc đĩa petri Kết đếm bào tử xác đinh sau: Bảng 3: Lươợng bào tử (bt/g) chủng M4, M5 sau lên men kết hợp CT Chủng Ct1 (100% com) Ct2 (20% tr?u + 80% cỏm g?o) M4 218 x108 108 x107 M5 225 x108 120 x107 Qua bảng cho thấy hai chủng M4; M5 cơng thức có lượng bào tử cao cơng thức thí nghiệm Vậy mơi trường lên men kết hợp thích hợp để chủng Metarhizium phát sinh bào tử 100% cơm (MT xốp) Sau xác định lượng bào tử 1gam bào tử tinh khiết tiến hành xác định mơi trường lên men chìm tốt nhất, cách pha lo•ng 1gam bào tử nứơc vơ trùng thành lần sau đêm nồng độ nhỏ đem nuôi cấy môi trường lỏng lắc Czapek-Dox, kết sau ngày, 2ngày, 3ngày, 4ngày, 5ngày nuôi cấy xác định lượng bào tử cách đếm khuẩn lạc đĩa thạch Kết bảng sau Bảng 4: số lượng bào tử sau ngày nuôi cấy TG (ngày) Chủng M4 78 121 135 107 99 M5 65 109 119 92 89 Qua bảng kết theo dõi ta thấy thời gian lên men chìm cho hiệu sau ngày lượng bào tử thu nhiều Sau lên men kết hợp để xác định tiến hành thu đếm lượng bào tử gam Thu bào tử phương pháp nghiền sơ mơi trường sau sàng thu bào tử Để đếm bào tử dùng phương pháp pha lo•ng đếm khuẩn lạc đĩa thạch Kết đếm bào tử ghi bảng sau Bảng 5: Lượng bào tử (bt/g) lên men kết hợp với lượng mẫu cấy khác LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chủng Đếm khuẩn lạc (CFU) = n x 107 CT1 (2%) CT2 (4%) CT3 (6%) CT4 (8%) CT5 (10%) M4 103 155 132 137 146 M5 91 112 132 107 124 Qua bảng sau thấy cấy với lượng mẫu khác lên mơi trường phát triển hai chủng nấm Metarhizium khơng khác Nghi• bào tử hai chủng Metarihizium M4, M5 phát sinh công thức không chênh lệch Nhưng với chủng M4 lượng mẫu cấy 4% bào tử phát triển nhiều (155), chủng M5 lượng mẫu cấy 6% bào tử phát triển nhiều (132) Vậy lượng mẫu cấy thích hợp từ mơi trường lên men chìm sang mơi trường lên men xốp thích hợp chủng M4 4% , chủng M5 6% 4.5: Thử khả diệt mối trực tiếp bào tử chủng nấm Metarhizium (M4; M5) sau lên men kết hợp Sau xác định quy trình lên men kết hợp cho hiệu cao tiến hành sàng lọc thu bào tử để đưa vào thử nghiệm phịng thí nghiệm thực tế Tiến hành thử đĩa petri nhựa với số lượng 100 (90 mối thợ 10 mối lính) với nồng độ Kết tìm hiểu, theo dõi bảng 3: Bảng 6: Tỷ lệ % mối chết theo thời gian rắc bào tử M4 Công thức Tỉ lệ % mối chết theo thời gian (ngày) CT1(ĐC) 0.50 0.75 2.00 2.75 2.75 4.00 CT2 1.75 4.25 7.50 13.25 19.50 29.50 CT3 3.00 14.75 26.25 39.25 56.75 81.50 CT4 20.00 41.75 69.50 86.75 98.25 100.00 CT5 37.50 76.00 94.25 100.00 Bảng7 :Tỉ lệ mối chết theo thời gian rắc bào tử chủng M5 Công thức Tỉ lệ % mối chết theo thời gian (ngày) CT1(ĐC) 0.00 0.25 1.50 2.75 3.25 3.50 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com CT2 1.00 2.00 3.50 4.00 7.50 13.00 CT3 1.75 13.25 18.75 36.00 58.00 83.50 CT4 20.25 38.75 57.25 79.00 93.25 98.75 CT5 36.75 58.75 86.25 99.50 100.00 \Theo dõi công thức thí nghiệm hai chủng nấm Metarhizium M4, M5 cho thấy công thức khác tỉ lệ mối chết khác CT1 (Đ/C) tỉ lệ mối chết không đáng kể, đa phần mối sống di chuyển nhanh nhẹn, CT ta thấy tỉ lệ mối chết tăng dần theo lượng bào tử cụ thể CT5 lượng bào tử cho vào lớn tỉ lệ mối chết ngày 30% Tỉ lệ mối chết tỉ lệ thuận với thời gian thí ngiệm Theo dõi khả diệt mối hai chủng hai chủng M4 M5 lượng bào tử đem thí nghiệm ta thấy tỉ lệ % mối chết M4 gây chết nhiều M5 , CT5 chủng M4 tỉ lệ mối chết hoàn toàn sau ngày, chủng M5 tỉ lệ mối chết hoàn toàn sau ngày Sau xác định khả diệt mối chủng M4 chủng M5 Chúng tơi đ• tiến hành thử hai chủng nấm chủng M4 với nồng độ 0.04g với số lượng cá thể khác cụ thể kết sau: Bảng 8: Tỉ lệ % mối chết theo thời gian rắc bào tử chủng nấm M4 cho mức thể khác Số cá thể (Con) Tỷ lệ % mối chết theo thời gian (ngày) 100 82 87 93 100 200 53 73 87 91 100 300 23 39 72 83 95 100 Như qua bảng 3, bảng 4, bảng ta thấy nồng độ diệt mối cao CT5 (0.05g) nhiên dùng nồng độ bào tử 0.04g kết chênh lệch khơng nhiều rắc 100 cá thể, thời gian có kéo dài để tít kiệm đảm bảo lợi nhuận kinh tể thực tế áp dụng nồng độ 0.04g bào tử/200 cá thể để diệt tổ mối Vì chúng tơi định chọn mức nồng độ để thử nghiệm khả diệt mối qua lây nhiễm bào tử Metarhizium mô hình hộp 4.6 Thử khả diệt mối qua lây nhiễm mơ hình hộp bào tử Metarhizium M4 Sau xác định khả diệt mối chủng M4 chủng M5 nồng độ bào tử 0.04/200 cá thể Chúng tơi đ• tiến hành thử chủng nấm chủng M4 với nồng độ 0.04g với số lượng cá thể khác cụ thể kết sau Để xác định khả diệt mối rõ ràng chúng tơi đ• tiến hành thí nghiệm mức độ cá thể khác nhau, độ dài ống dẫn khác cụ thể sau LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Thí nghiệm xác định hiệu lực diệt mối bào tử M4 độ dài ống nối 10cm, với số lượng cá thể khác Kết theo dõi bảng sau: Bảng 9: Kết mơ hình hộp STT Tổng số cá thể (con) Số cá thể nhiễm BT (con) Chiều dài ống nối (cm) TG mối chết (ngày) 100% Đối chứng 1000 200 10 11 Mối sống hoạt động bình thường 3000 200 10 23 5000 200 10 28 Vì điều kiện mơ hình thí nghiệm khơng thể theo dõi số cá thể mối chết theo ngày, mà theo dõi xác định số ngày mối chết 100% Sau rắc chế phẩm nấm, mối lơ thí nghiệm lơ đối chứng hoạt động tốt, có nhiều mối hai đường thơng Sau vài ngày, mối lơ thí nghiệm bắt đầu di chuyển chậm chạp lại qua ống nối, số lượng mối chết tăng dần theo thời gian đạt 100% Lô đối chứng theo dõi 30 ngày, ta thấy tỷ lệ mối chết ít, mối hồn tồn khoẻ mạnh, hoạt động lưu thơng đường ống nối bình thường Thí nghiệm xác định hiệu lực diệt mối bào tử M4 độ dài ống nối 10cm, 50cm, 100cm với số lượng cá thể 1000 200 cá thể đ• nhuộm màu đ• nhiễm bào tử, kết theo dõi sau: Bảng 10: Kết mơ hình hộp nhuộm cá thể mối stt Tổng số cá thể (con) Số cá thể nhiễm bao tử (con) Chiều dài ống nối (cm) TG mối chết (ngày) 100% Đối chứng 1000 200 10 10 Mối sống hoạt động bình thường 1000 200 50 24 1000 200 100 31 Như vậy, kết theo dõi ta thấy mối mang vi nấm từ hộp qua ống nối sang hộp để truyền tác nhân gây bệnh bào tử nấm Metarhizium cho cá thể mối Qua bảng ta thấy điều kiện thí nghiệm, số lượng mối đem thí nghiệm tăng lên thời gian mối chết 100% tăng lên Qua bảng ta thấy số khác điều kiện thí nghiệm khả diệt mối tỉ lệ thuận với chiều dài ống nối Từ ta rút kết luận số lượng cá thể tổ mối mối nhiễm bào tử, số cá thể nhiễm lớn khả diệt mối nhanh Và yếu tố khoảng cách quan trọng tốc độ lây truyền gây bệnh đàn mối, khoảng cách ngắn khả lây nhiễm cao tốc độ diệt mối nhanh ngược lại LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phần V Kết luận đề nghị 5.1 Kết luận Lựa chọn quy trình lên men kết hợp thích hợp cho phát sinh bào tử hai chủng nấm Metarhizium (M4; M5) là: + Môi trường lên men kết hợp thích hợp là: Mơi trường lên men chìm (CzapekDox) môi trường lên men xốp (100% cơm từ gạo) + Thời gian lên men chìm thích hợp cho hai chủng nấm Metarhizium (M4, M5) ngày + Lượng mẫu thích hợp cấy từ mơi trường lên men chìm sang mơi trường lên men xốp: Của chủng M4 4%, chủng M5 6% (4% 6% lượng mẫu cấy từ mơi trường lên men chìm sang môi trường lên men xốp) Thử khả diệt mối bào tử hai chủng nấm Metarhizium thấy bào tử chủng M4 có khả diệt mối cao bào tử chủng M5 Bào tử chủng M4 mối chết 100% sau ngày, bào tử chủng M5 mối chết 100% sau ngày Xác định khả diệt mối bào tử hai chủng nấm Metarhizium qua lây nhiễm - Khi lõy nhi?m qua mụ hỡnh h?p ta th?y s? lu?ng cỏ th? m?i nhi?m bào t? l?n thỡ kh? nang di?t m?i nhanh chi?u dài ?ng n?i khụng thay d?i, s? lu?ng cỏ th? tang d?n thỡ th?i gian m?i ch?t t? l? thu?n v?i s? lu?ng m?i, s? lu?ng m?i tang lờn l?n th?i gian m?i ch?t 100% tang thờm 12 ngày, n?u lu?ng m?i tang lờn l?n thỡ th?i gian m?i ch?t tang 16 ngày - Trong di?u ki?n s? lu?ng cỏ th? khụng thay d?i thỡ th?i gian mà m?i ch?t t? l? thu?n v?i chi?u dài ?ng n?i Khi tang ?ng n?i dài l?n thỡ th?i gian m?i ch?t 100% tang thờm 15 ngày, tang ?ng n?i dài 10 l?n thỡ th?i gian gõy ch?t 100% tang thờm 22 ngày 5.2 Đề nghị Sau thực đề tài, để đề tài hồn thiện tơi có số đề nghị sau: Cần nghiên cứu thêm quy trình thu hồi bảo quản chế phẩm sau lên men để đưa sản xuất chêt phẩm vi nấm quy mô công nghiệp Tiến hành đánh giá thử hiệu lực bào tử nấm Metarhizium số loại côn trùng gây hại khác: sâu xanh, sâu tơ, châu chấu, cào cào để mở rộng phạm vi ứng dụng loại vi nấm LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Cần có nghiêm cứu sâu sát thực mối số lượng cá thể mối lớn hơn, đưa thực tế số lượng mối lớn hơn, khả dính bám bào tử mối, số lượng cá thể nhiễm bào tử Cơ chế gây chết bào tử, chế lây nhiễm cá thể nhiễm bào tử cá thể không nhiễm quần thể Phần VI Tài liệu tham khảo Tài liệu Tiếng Việt Chu Thị Thơm, Phan Thị Lài, Nguyễn Văn Tó (2006) Phương pháp phòng chống mối NXB Lao động Hà Nội Nguyễn Dương Khuê cộng tác viên Thử nghiệm dùng vi nấm Metarhizium cho phịng trừ mối nhà Tạp chí Nơng nghiệp phát triển LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nguyễn Đức Khảm (1976) Mối miền Bắc Việt Nam NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội Nguyễn Lân Dũng (1981) Sử dụng vi sinh vật để phòng trừ sâu hại trồng NXB Khoa học kỹ thuật Hà Nội Phạm Thị Thuỳ (1990-1995) Đánh giá hiệu lực chế phẩm nấm Beauveria Metarhizium trừ số sâu hại nông nghiệp Tuyển tập cơng trình nghiên cứu biện pháp sinh học phịng trừ dịch hại trồng nông nghiệp NXB Nông nghiệp Phạm Thị Thuỳ cộng (1996-2000) Thành phần ký sinh thiên địch có ích châu chấu nghiên cứu ứng dụng chế phẩm nấm Metarhizium để phòng trừ châu chấu hại trồng lâm nghiệp Việt Nam Phạm Thị Thuỳ, Trần Thanh Tháp (3/1997) Khảo nghiệm chế phẩm nấm Bevauria basiana Vuill nấm Metarhizium Sorok để phịng trừ sâu đo xanh Tạp chí Bảo vệ Thực vật số 153 Trịnh Văn Hạnh, Võ Thu Hiền, Phan Trọng Nhật (2001) Nghiên cứu khả gây chết loài mối Coptotermes formosanus bào tử số chủng Metarhizium Tuyển tập kết khoa học công nghệ 1999 - 2000 NXB Nông nghiệp Phạm Thị Thuỳ cộng (1991-1995) Nghiên cứu công nghệ sản xuất ứng dụng chế phẩm nấm Beauveria va Metarhizium để phòng trừ số sâu hại trồng Tuyển tập cơng trình nghiên cứu Bảo vệ thực vật NXB Nông nghiệp 10 Trịnh Văn Hạnh, Võ Thu Hiền, Phan Trọng Nhật (2001) Nghiên cứu khả lây nhiễm bào tử Metarhizium loài mối Coptotermes formosanus Tuyển tập kết khoa học công nghệ 1999 - 2000 NXB Nông nghiệp 11 Vũ Văn Tuyển (1982) Mối hại đê đập, hồ chứa nước Việt Nam biện pháp phịng trừ Luận án Phó tiến sĩ sinh học Hà Nội 12 Phạm Bình Quyền (1994) Sinh thái học côn trùng NXB Giáo dục 6.2 Tài liệu Tiếng Anh 13 Barry H Strack (1999) Biology control of termites by the Fungal Entomophthogen Metarhizium anisopliae Uban Entomology laboratory 14 Gams and Rozsypal (1999) The effect Metarhizium (Mestch) Sorokin 15 Milner, R T, J A Staples., T R Hartley, G G Lutton., F Drive and J A L.Watson (1998) Occuren of Metarhizium anisopliae innest and feeding sites of Autralian termite Mycol Res.10292:216_220 16 Suzukiw J(2000) The Formosanus termites for Agricultural research 46: - 17 Thomas G Shelton (1997) Formosanus subterranean termitees Grachnate research assistant Auburn University 18 Smithson S.L., Paterson I.C., Bailey A.M., Screen S.E., Cobb B., Hunt B.A., Charnley A.K.,Cooper R.M., Clarkson J.M (1995) Cloning and characterisation of a gene encoding a cuticle-degrading protease from the insect pathogenic fungus Metarhizium anisopliae Gene; T?p 166; Trang 161-165 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 19 Pei Yan, Ji Zhixia, Yang Xingyong (2000) Purification and characterization of cuticle-degrading protease from entomopathogenic fungus, Metarhizium anisopliae Acta microbiologica sinica; T?p 40; S? 3; Trang 311-317 20 Thomas G Shelton (1997) Formosanus subterranean termitees Grachnate research assistant Auburn University LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... men kết hợp để sản xuất bào tử nấm Metarhizium khả diệt mối bào tử nấm qua lây nhiễm? ?? 1.2 Mục đích yêu cầu 1.2.1 Mục đích: - Hồn thành quy trình lên men kết hợp để sản xuất bào tử nấm Metarhizium. .. 0.04g bào tử/ 200 cá thể để diệt tổ mối Vì chúng tơi định chọn mức nồng độ để thử nghiệm khả diệt mối qua lây nhiễm bào tử Metarhizium mơ hình hộp 4.6 Thử khả diệt mối qua lây nhiễm mơ hình hộp bào. .. trường lên men xốp) Thử khả diệt mối bào tử hai chủng nấm Metarhizium thấy bào tử chủng M4 có khả diệt mối cao bào tử chủng M5 Bào tử chủng M4 mối chết 100% sau ngày, bào tử chủng M5 mối chết