TIÊU CHUẨN hóa PHƯƠNG PHÁP xác ĐỊNH các CHỈ TIÊU SINH hóa của trung tâm học liệu đh cần thơ tài liệu học tập và nghiên cứu VI KHUẨN aeromonas hydrophila tại KHOA THỦY sản

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA THỦY SẢN BỘ MÔN SINH HỌC VÀ BỆNH THỦY SẢN NGUYỄN HÀ GIANG TIÊU CHUẨN HÓA PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ TIÊU SINH HÓA CỦA Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu VI KHUẨN Aeromonas hydrophila TẠI KHOA THỦY SẢN LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NUÔI TRỒNG THỦY SẢN CHUYÊN NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN 2008 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm ơn quý thầy cô Khoa Thuỷ sản – Trường Đại học Cần Thơ Đặc biệt thầy cô thuộc môn Sinh học Bệnh học Thủy sản truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm quý báu suốt trình em học tập nghiên cứu trường Xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Đặng Thị Hoàng Oanh chị Nguyễn Thị Tiên tận tình hướng dẫn giúp đỡ em nhiều trình thực đề tài tốt nghiệp Đồng thời xin gởi lời cám ơn đến cô cố vấn Nguyễn Thị Thu Hằng gia đình bạn lớp Bệnh học Thủy sản K30 động viên hỗ trợ cho em thời gian học tập thực đề tài tốt nghiệp Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu i LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TĨM TẮT Trung Đề tài thực nhằm tìm hiểu tiêu sinh lý sinh hóa sai khác từ phương pháp truyền thống sử dụng kít API 20E Đồng thời so sánh với kết định danh nghiên cứu trước môn số tài liệu nghiên cứu khác Qua đó, đề xuất chủng vi khuẩn A hydrophila tham khảo với phương pháp xác định tiêu sinh lý sinh hóa dùng để định danh vi khuẩn điều kiện phịng thí nghiệm Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ Các tiêu hình thái, sinh lý sinh hóa chọn để định danh dựa theo hệ thống phân loại Baumann et al(1984) Các đặc điểm sinh lý, sinh hóa xác định dựa theo cẩm nang Cowan Steel (Barrow Feltham, 1993) phương pháp West Colwell (1984) Tám chủng Aeromonas hydrophila (A hydrophila) gồm CAF (LMG 2844, chủng chuẩn), CAF 23, CAF25, CAF 131, CAF 132, CAF 133, CAF 134 CAF 135 chủng phân lập định danh từ đề tài trước trữ tủ âm 800C Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ Các chủng A hydrophila vi khuẩn gram âm, hình que ngắn, di động, catalase dương tính, oxidase âm tính tâm Họclạcliệu @ Tài học tậpchủng nghiên cứu có khuẩn dạngĐH trịn,Cần nhẵn.Thơ Đặc điểm khácliệu A hydrophila với nghiên cứu trước chủng cho kết oxidase âm tính Phương pháp định danh truyền thống API 20E thể tiêu giống kết thể giống khác phản ứng chủng nghiên cứu tiêu arginine ornithine điều kiện phịng thí nghiệm Các chủng nghiên cứu qua kiểm tra phương pháp PCR (Panangala et al, 2007) chưa cho sản phẩm đặc hiệu (không vạch 209bp) ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC Trang PHẦN GIỚI THIỆU 01 PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 03 2.1 Bệnh động vật thủy sản 03 2.2 Bệnh vi khuẩn động vật thủy sản 04 2.3 Vi khuẩn Aeromonas sp 05 2.4 Phương pháp định danh vi khuẩn Aeromonas hydrophila 08 PHẦN PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 3.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 11 3.2 Vật liệu 11 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu 3.2.1 Vật liệu nghiên cứu 11 3.2.2 Thiết bị 11 3.2.3 Hóa chất, thuốc thử mơi trường để kiểm tra tiêu hình thái, sinh lý sinh hóa vi khuẩn 11 3.2.4 Các hóa chất cần thiết cho phản ứng PCR 13 3.2.5 Các chủng vi khuẩn Aeromonas hydrophila 13 3.3 Phương pháp nghiên cứu 13 3.3.1 Định danh vi khuẩn Aeromonas hydrophila phương pháp truyền thống 14 3.3.2 Định danh vi khuẩn kít API 20E 14 3.3.3 Phát vi khuẩn phương pháp PCR 16 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 19 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4.1 Kết 19 4.1.1 Đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hóa chủng vi khuẩn A hydrophila xác định phương pháp sinh hóa truyền thống 19 4.1.2 Kiểm tra kết định danh vi khuẩn A hydrophila theo kít API 20E 23 4.1.3 Kết kiểm tra phương pháp PCR 25 4.2 Thảo luận 26 PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 29 5.1 Kết luận 29 5.2 Đề xuất 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 PHỤ LỤC 35 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 3.1: Các nguồn vi khuẩn .13 Bảng 3.2: Bảng đọc kết kít API 20E 16 Bảng 3.3: Thành phần tham gia phản ứng PCR .17 Bảng 4.1: Đặc điểm hình thái, sinh lý sinh hoá chủng vi khuẩn chuẩn chủng tham khảo 19 Bảng 4.2: Kết kiểm tra kít API 20E chủng vi khuẩn chuẩn chủng tham khảo .24 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 3.1 Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR theo quy trình Panangala et al (2007) có chỉnh sửa 18 Hình 4.1 Hình dạng A hydrophila (100X) 21 Hình 4.2 A hydrophila môi trường TSA 21 Hình 4.3 A hydrophila môi trường Aeromonas agar 22 Hình 4.4 Phản ứng citrate (+) 22 Hình 4.5 Phản ứng VP (+) 23 Hình 4.6 Phản ứng indole (+) 23 Hình 4.7 Kết định danh API 20E dịng CAF2 (a) dịng CAF25 (b) 25 Hình 4.8 Kết điện di chủng A hydrophila 26 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHẦN GIỚI THIỆU Nghề nuôi thủy sản giới nói chung Việt Nam nói riêng phát triển nhanh Ở Việt Nam báo cáo tháng 12 năm 2007 Bộ nông nghiệp phát triển nơng thơn sản lượng ni thủy sản đạt 2.085 nghìn tăng 23% so với năm 2006 Tuy nhiên, lợi nhuận cao nên diện tích ni trồng thủy sản tăng nhanh mật độ nuôi tăng dẫn đến tình trạng nhiễm mơi trường, dịch bệnh xảy tràn lan mầm bệnh ngày đa dạng bệnh vi khuẩn Trong số mầm bệnh vi khuẩn thủy sản vi khuẩn Aeromonas hydrophila tác nhân gây bệnh bật Chúng xuất gây chết nhiều đối tượng thủy sản khác Trung Hiện có nhiều phương pháp khác sử dụng để định danh vi khuẩn A hydrophila Các phương pháp phổ biến phương pháp sinh hóa truyền thống kít API 20E để kiểm tra đặc tính sinh lý sinh hóa vi khuẩn tâm Học liệuđặc ĐH Cần học tậpthường nghiên Tuy nhiên, điểm sinhThơ lý @ sinhTài hóa liệu vi khuẩn biến đổi cứu tùy thuộc vào điều kiện phịng thí nghiệm, loại hóa chất sử dụng, hãng cung cấp chủng vi khuẩn chuẩn hay chủng tham khảo sử dụng Hiện tại, kỹ thuật phân tử PCR (phản ứng trùng hợp), RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) sử dụng để định danh A hydrophila nhằm khẳng định kết định danh phương pháp sinh hóa Đề tài “Tiêu chuẩn hóa phương pháp xác định tiêu sinh lý sinh hóa vi khuẩn Aeromonas hydrophila” thực Khoa Thủy sản nhằm mục đích tìm hiểu tiêu sinh lý sinh hóa sai khác từ phương pháp truyền thống sử dụng kít API 20E Đồng thời so sánh với kết định danh nghiên cứu trước mơn Mục đích cuối đề tài đề xuất chủng vi khuẩn A hydrophila tham khảo với phương pháp xác định tiêu sinh lý sinh hóa dùng định danh vi khuẩn điều kiện phịng thí nghiệm Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ Trang LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Đề tài thực với nội dung sau: - Kiểm tra tiêu sinh lý sinh hóa vi khuẩn A hydrophila phương pháp truyền thống; - Kiểm tra tiêu sinh lý sinh hóa vi khuẩn A hydrophila sử dụng kít API 20E; - Dùng phương pháp PCR phát chủng vi khuẩn A hydrophila định danh phương pháp sinh hóa Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Trang LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Bệnh động vật thủy sản Khác với hình thức ni thu hoạch khác trồng vật ni nhìn thấy được, động vật thủy sản cần ý nhiều để theo dõi sức khỏe chúng Chúng không dễ quan sát thấy được, trừ nuôi bể, chúng lại sống môi trường phức tạp biến động Ngoài ra, việc tiêu thụ thức ăn tử vong ẩn náu kỹ nước Mặt khác, ni trồng thủy sản có lượng lồi ni môi trường nuôi đa dạng Hiện bệnh cho thách thức quan trọng mà ngành nuôi trồng thủy sản phải đối mặt Số lượng bệnh tìm thấy ni trồng thủy sản thay đổi, số đặc điểm bệnh vật chủ khó nhận khơng nhận ra, nhiều bệnh lại có triệu chứng khơng đặc trưng Điều tác nhân gây bệnh động vật thủy sản khơng mà có nhiều tác nhân (mơi trường, tác nhân chính, tác nhân hội,…) tác động Theo Từ Thanh Dung ctv (2005) tác nhân gây bệnh động vật thủy sản chủ yếu vi khuẩn, virút, nấm nguyên sinh động vật Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Ở Đài Loan 80% sản lượng tôm quốc gia bị thất thoát vào năm 1987-1988, gần vào năm 1990-1991 dịch bệnh liên tiếp gây thiệt hại cho nghề nuôi tôm Philippin, cụ thể với sản lượng tôm nuôi giảm từ 90.000 năm 1994 xuống 340.527 năm 1999 Thái Lan việc xuất thủy sản gặp khó khăn dịch bệnh đốm trắng làm giảm sản lượng tôm nuôi từ 225.000 năm 1995 xuống 16.000 năm 1996 làm thiệt hại khoảng 500 triệu USD đến năm 1997 tình trạng chưa cải thiện (trích dẫn Triệu Thanh Tuấn, 2006) Gần đây, Việt Nam vào khoảng tháng tháng năm 2007 có tượng tơm chết rải rác bệnh đốm trắng phân trắng Bên cạnh đó, từ đầu năm 2007 xuất bệnh lạ “bệnh sữa” tôm hùm, đến đầu quý 2/2007 dịch bệnh bùng phát, gây chết hàng loạt tôm nuôi tỉnh miền Trung (đặc biệt Phú Yên, Khánh Hoà) gây thiệt hại 161 tỷ đồng cho người nuôi (http://www.fistenet.gov.vn) Trong đó, khảo sát Nguyễn Chính (2005) vùng nuôi cá tra thâm canh An Giang Cần Thơ cá tra bị mắc nhiều loại bệnh với tần suất bắt gặp khác Bệnh thường gặp gây thiệt hại lớn bệnh gan thận có mủ, xuất 82% ao 100% bè ni cá, đồng thời tỉ lệ cá chết lên Trang LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com nhận phương pháp khác số tiêu phản ứng decarboxylase Chỉ tiêu khác biệt hầu hết dòng vi khuẩn ornithin arginine, phương pháp truyền thống cho kết dương tính (+), cịn phương pháp API 20E lại cho kết âm tính (-) (Hình 4.2a) Tuy nhiên, kết ornithin từ API 20E kết arginine từ phương pháp truyền thống lại giống với kết Abbott et al (2003) Điều giải thích, tiêu cho phản ứng phương pháp truyền thống tự pha chế, cịn API 20E kít có sẵn nghiên cứu điều kiện thích hợp cho phản ứng mà nhà sản xuất yêu cầu 30-370C thực phịng thí nghiệm 280C, khác chấp nhận (Popovic et al, 2007) Như sử dụng hai phương pháp truyền thống API 20E điều kiện phịng thí nghiệm nghiên cứu so sánh tiêu giống thể kết gần giống Chỉ có khác hai tiêu arginine ornithine phản ứng decarboxylase Mặc dù vài tiêu chưa với đặc tính A hydrophila khác hẳn với nhiều nghiên cứu trước kết hai phương pháp thể kết Điều cho thấy có sai khác hai phương pháp Trung tâm Học liệu Cần liệu tập Sau kiểm tra ĐH kết địnhThơ danh @ bằngTài PCR, kếthọc khơng có nghiên sản phẩm cứu đặc hiệu vạch 209bp Mặc dù kết chưa rõ ràng khơng thể nói chủng nghiên cứu khơng phải A hydrophila Có thể điều kiện cho phản ứng PCR chưa phù hợp việc phát A hydrophila điều kiện phòng thí nghiệm yếu tố khác nhiệt độ gắn mồi, thành phần phản ứng PCR chưa phù hợp,… Ngoài ra, nghiên cứu Nielsen et al (2001) xác định loài A hydrophila phân lập cá chình bệnh Trung Quốc có xảy tượng số dịng vi khuẩn có tiêu cellobiose dương tính lại khơng cho kết PCR dương tính Trang 28 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com PHẦN KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận - Đã kiểm tra tiêu hình thái, sinh lý sinh hoá chủng A hydrophila phương pháp truyền thống sử dụng kít API 20E Hai phương pháp thể kết giống hầu hết tiêu trừ tiêu arginine ornithine - Các chủng nghiên cứu qua kiểm tra phương pháp PCR chưa cho sản phẩm đặc hiệu - Các chủng tham khảo có số tiêu khác với chủng chuẩn (CAF 2) sử dụng làm chủng tham khảo, bao gồm chủng CAF 23, CAF 131, CAF 132, CAF 133, CAF 134 CAF 135 5.2 Đề xuất Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu - Cần so sánh thêm nhiều chủng chuẩn chủng tham khảo A hydrophila để có kết xác - Tối ưu phương pháp PCR để có sản phẩm PCR đặc hiệu với mồi Trang 29 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com TÀI LIỆU THAM KHẢO Abbott, S.L., W.K.W Cheung and J.M Janda 2003 The Genus Aeromonas: Biochemical Characteristics, Atypical Reactions, and Phenotypic Identification Schemes Journal of Clinical Microbiology, p 2348-2357, Vol 41, No Austin, B and D.A Austin 1993 Bacterial fish pathogens: Disease in farmed and wild fish, 2nd edn Ellis Horwood Ltd., Chichester 384 pp Bartie, K., Đ T H Oanh, G Huy, C Dickson, M Cnockaert, J Swings, N T Phương, A Teale 2006 Ứng dụng REP-PCR PFGE để định dạng vi khuẩn kháng chloramphenicol Tạp chí Cơng nghệ sinh học (1): p3140 Bộ môn Sinh học Bệnh Thủy sản - Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ, 2007 Tài liệu hướng dẫn thực tập giáo trình chun mơn bệnh học thủy sản 63 trang Trung tâm5 Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Bùi Quang Tề Phạm Thị Yên 2002 Báo cáo bệnh cá sông nuôi lồng Vịnh Hạ Long Bùi Quang Tề 2003 Bệnh tôm nuôi biện pháp phịng trị Nhà xuất Nơng nghiệp Hà Nội 112 trang Barrow, G I and R K A Feltham 1993 Cowan and Steel ‘s manual for the indentification of medical bacteria, 3rd edn Cambridge Univesity Press, Cambridge 262 pp Baumann, P A L Furnss and J V Lee 1984 Genus Vibrio pacini 1854, 411 al 518-538 pp In: Krieig, N R and J G Holt (eds) Bergeyf’s manual of systematic bacteriology, Volume1 William and Wilkin Baltimore Buller, N B .2004 Bacteria from fish and other aquatic animal: A practical indentification manual CABI publishing 353 pp 10 Chowdhury, Md.B.R, 1998 Bacteria in fish disease in Bangladesh department of aquaculture, Facculy of Fisheries Bangladesh Agriculture Trang 30 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com University, Mymensingh, 2002, Bangladesh 247 pp 11 Chu, W H and C-P Lu 2005 Multiplex PCR assay for the detection of pathogenic Aeromonas hydrophila Journal of Fish Diseases Volume 28 Issue 7: 437-441 12 Cipriano, R C., G L Bullock and S W Pyle 2001 Aeromonas hydrophila and motile Aeromonad septicemias of fish Revision of Fish Disease Leaflet 68 (1984) 13 Đặng Thị Hồng Oanh 2006 Đặc điểm sinh hóa kiểu ARN ribosom vi khuẩn Aeromonas phân lập từ bệnh phẩm thủy sản nuôi Đồng sông Cửu Long Tạp chí khoa học 2006: 85-94 14 Đặng Thị Hồng Oanh, Đoàn Nhật Phương, Nguyễn Thị Thu Hằng Nguyễn Thanh Phương 2006 Xác định vị trí phân loại khả kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn Vibrio phát sáng phân lập từ hậu ấu trùng tôm sú (Penaeus monodon) Tạp chí khoa học 4/2006: 42-52 300 trang Trung 15 Đặng Thị Hoàng Oanh, Nguyễn Thị Thu Hằng Nguyễn Thanh Phương 2006.liệu Sưu ĐH tập vàCần phânThơ lập vi@ khuẩn mẫuhọc thủy tập sản nuôi Đồng tâm Học Tàitừliệu nghiên cứu sông Cửu Long Tạp chí khoa học 4/2006 (2): 53-61 300 trang 16 Đồn Nhật Phương 2001 Xác định LD50 thử nghiệm vaccine phòng bệnh vi khuẩn (Aeromonas hydrophila) cá chép (Cyprinus carpio) (LVTN) Khoa Thuỷ sản – Trường Đại học Cần Thơ 29 trang 17 Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng Nguyễn Thị Muội 2004 Bệnh học thủy sản Nha Trang 423 trang 18 Ferguson, H.W, J F Turnbull, A Shinn, K.Thomson, T T Dung and M.Crumlish 2001 Bacillary necrosis in farmed Pangasius hypophthalmus (Sauvage) from the Mekong delta, VietNam Journal of fish disease 2001, 24: 509-513pp 19 Frerichs, G N and S D Millar 1993 Mannual for the isolate and indentification of fish bacterial pathogens Institute of aquaculture, University of Stirling, Scotland 107pp 20 Inglis, V., R J Roberts and N R Bromage 1993 Bacterial diseases of fish Institute of aquaculture, Univesity Press, Cambridge 312 pp Trang 31 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 21 Kozinska, A., M J Figueras, M R Chacon and L Soler 2002 Phenotypic characteristics and pathogenicity of Aeromonas genomospecies isolate from common carp In: Journal of applied microbiology 2002, 93: 1034-1041 pp 22 Nielsen, M E., L Høi, A S Schmidt, D Qian, T Shimada, J Y Shen, J L Larsen 2001 Is Aeromonas hydrophila the dominant motile Aeromonas species that causes disease outbreaks in aquaculture production in the Zhejiang Province of China? Diseases of aquatic oraganism Vol.46: 2329 23 Ngô Minh Dung 2007 Nghiên cứu khả gây bệnh vi khuẩn Edwardsiella ictaluri Aeromonas hydrophila cá tra (LVTN) Khoa Thuỷ Sản-Trường Đại học Cần Thơ 47 trang 24 Nguyễn Chính 2005 Đánh giá tình hình sử dụng thuốc thú y thủy sản nuôi cá tra (Pangasius hypophthalmus Sauvage, 1878) thâm canh An Giang Cần Thơ (LVCH) Khoa Thuỷ sản – Trường Đại học Cần Thơ 80 trang Trung tâm25.Học liệuTấnĐH học tập nghiên cứu Nguyễn Đạt.Cần 2002.Thơ Khảo @ sát Tài bệnh liệu ký sinh trùng và vi khuẩn tôm xanh nuôi ao ruộng lúa mật độ thấp (LVTN) Khoa Thuỷ sản – Trường Đại học Cần Thơ 24 trang 26 Nguyễn Thành Tâm 2006 Khảo sát mầm bệnh cá rô đồng (Anabas rtestudineus) bị bệnh xù vảy (LVTN) Khoa Thuỷ sản – Trường Đại học Cần Thơ 39 trang 27 Nguyễn Thị Như Ngọc 1997 Xác định tác nhân vi khuẩn gây bệnh tuột nhớt cá bống tượng (LVTN) Khoa Thuỷ sản – Trường Đại học Cần Thơ 54 trang 28 Nguyễn Thị Thu Hằng 2005 Sưu tầm thiết lập hệ thống lưu trữ lồi vi khuẩn phân lập tơm cá Khoa Thuỷ sản – Trường Đại học Cần Thơ Báo cáo khoa học (đề tài cấp trường) Trường Đại học Cần Thơ 24 trang 29 Panangala, V.S., C.A Shoemaker, V.L Van Santan, K Dybvig., P H Klesius 2007 Multiplex-PCR for simultaneous detection of three fishpathogenic bacteria, Edwardsiella ictaluri, Flavobacterium columnare and Trang 32 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Aeromonas hydrophila Diseases of aquatic organisms 74: 199-208 30 Popovic, N T., R.Coz-Rakovac and I Strunjak-Perovic 2007 Commercial phenotypic tests (API 20E) in diagnosis of fish bacteria: a review Veterinarni medicina, 52, 2007 (2): 49–53 31 Sở Thủy sản An Giang Báo cáo dịch bệnh tháng đầu năm 2007 32 Trần Thị Tuyết Hoa, Nguyễn Thị Thu Hằng, Đặng Thị Hoàng Oanh Nguyễn Thanh Phương 2004 Thành phần loài khả gây bệnh nhóm vi khuẩn Vibrio phân lập từ hệ thống ương tơm xanh (Macrobranchium rosenbergii) Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ, 2004: p153-164 373 trang 33 Triệu Thanh Tuấn 2006 Khảo sát mối quan hệ kiểu gen White spots syndrome (WSSV) với bệnh đốm trắng tôm Sú (Penaeus monodon) nuôi Bạc Liêu Cà Mau (LVTN) Khoa Thuỷ sản – Trường Đại học Cần Thơ 45 trang Trung 34 Từ Thanh Dung, M.Crumlish, Nguyễn Thị Như Ngọc, Nguyễn Quốc Thịnhliệu Đặng Thy Xác định khuẩn bệnh trắng tâm Học ĐH Thụy Cần Mai Thơ @2004 Tài liệu họcvitập vàgây nghiên cứu gan cá tra (Pangasius hypophthalmus) Tạp chí khoa học Đại học Cần Thơ, 2004: 137-142 373 trang 35 Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh Trần Thị Tuyết Hoa 2005 Giáo trình Bệnh học thủy sản.151 trang 36 Từ Thanh Dung 2006 Bài giảng Bệnh vi khuẩn động vật thủy sản 37 trang 37 Vila, J, F Marco, L Soler, M Chacon and M J Figuera 2002 In vitro antimicrobial susceptibility of clinical isolate of Aeromonas caviae, A hydrophila and Aeromonas veronii biotype sorbia Journal of Antimicrobial Chemmotherapy 49: 697-702 38 Wang, G., C G Clark, C Liu, C Pucknell, C K Munro, T M A C Kruk, R C D L Woodward, and F G Rodgers 2003 Detection and characterization of the hemolysin genes in Aeromonas hydrophila and Aeromonas sobria by Multiplex PCR Journal of Clinical Microbiology, Vol 41, No 3: 1048-1054pp Trang 33 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 39 West, P A and R R Colwell 1984 Indentification and classification of Vibrionaceae- an overview Pp 285-363 in: R R Colwell (edn) Vibrio in environment Jonh Wiley and Sons, New York 40 Horneman, A and J G Morris 2007 Up to date Aeromonas infections Cập nhật http://www.google.com.vn ngày 28/12/2007 41 Kim ngạch xuất thủy sản năm 2007 đạt 3,75 tỉ USD Trích báo cáo Bộ nông nghiệp phát triển nông thôn http://www.fistenet.gov.vn Cập nhật: 02/01/2008 42 Phan Anh 75 cá chết tỉnh Đồng Tháp http://vnexpress.net ngày 09/01/2006 Cập nhật ngày 22/01/2008 Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Trang 34 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phụ lục: Các tiêu test sinh lý sinh hóa Quan sát tính di động Sự di động vi khuẩn quan sát phương pháp giọt treo vật kính 40X Các bước thực sau: - Cho vaseline lên góc lamelle đặt ngửa lame bàn - Dùng que cấy tiệt trùng lấy nước muối sinh lý cho lên lamelle - Tiệt trùng que cấy, lấy vi khuẩn cho lên lame hịa vào nước muối sinh lý - Dùng lame đặt nhẹ nhàng lên lamelle cho lame không chạm vào giọt nước muối sinh lý chứa vi khuẩn - Cẩn thận lật thật nhanh lame để giọt nước treo ngược lamelle - Đặt lame lên kính hiển vi quan sát tính di động vi khuẩn vật kính 40X Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Nhuộm Gram Chuẩn bị tiêu bản: Nhỏ giọt nước cất lên lame, dùng que cấy nhặt vi khuẩn trải lên giọt nước cất Để khơ nhiệt độ phịng sau hơ lướt lame lửa đèn cồn để cố định vi khuẩn lame Các bước nhuộm Gram - Nhỏ dung dịch crystal violet lên lame Để phút - Rửa nước cho hết màu tím lame (khoảng giây), để khơ nhiệt độ phịng - Nhỏ dung dịch iodine lên lame, để khoảng phút - Lật nghiêng lame kính cho hết dung dịch iodine lame - Dùng dung dịch 95% cồn: 5% aceton để tẩy màu cách nghiêng lame nhỏ từ từ dung dịch giọt nước cuối lam khơng cịn màu tím Rửa để khơ nhiệt độ phòng - Nhỏ dung dịch safranin lên lame, để khoảng phút Rửa để khô nhiệt độ Trang 35 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com phịng Quan sát vật kính 100X Đọc kết - Vi khuẩn Gram dương (G+) có màu tím xanh - Vi khuẩn Gram âm (G-) có màu hồng đỏ Phản ứng catalase - Dùng dung dịch 3% H2O2 (3ml H2O2 100ml nước cất) - Dùng que cấy nhặt vi khuẩn để lên lame, sau nhỏ lên vi khuẩn giọt 3% H2O2 - Vi khuẩn cho phản ứng Catalase (+) gây tượng sủi bọt dung dịch 3% H2O2 ngược lại Phản ứng oxidase - Dùng que cấy phết vi khuẩn lên que tẩm dung dịch oxidase - ViHọc khuẩnliệu cho ĐH phản Cần ứng Oxidase (+) Tài làm giấyhọc lọc tập chuyển màu xanh Trung tâm Thơ @ liệu vàsang nghiên cứu vòng 60 giây ngược lại Phản ứng decarboxylase - Môi trường decarboxylase (xem công thức pha chế nhãn) + 0,5% yeast extract - Thêm 1% amino acid (arginine, lysine ornithine) cho phản ứng - Môi trường làm đối chứng khơng có amino acid - Cho 3ml mơi trường vào ống nghiệm - Thanh trùng 1200C 15 phút - Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm sau phủ lên ống 0.5ml parafin tiệt trùng, để tủ ấm 280C - Đọc kết từ 1-4 ngày Phản ứng (+) ống nghiệm có amino acid chuyển màu khác với màu ống đối chứng ngược lại Trang 36 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Khả phát triển vi khuẩn nồng độ muối khác - Môi trường 1% tryptone (1g tryptone 100ml nước cất) Thêm NaCl ứng với nồng độ 0, 3, 6, 7, 10% NaCl - Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm - Thanh trùng 1210C 15 phút - Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm Để tủ ấm 280C - Sau 2-4 ngày, môi trường đục cho kết (+) ngược lại Khả lên men oxy hóa đường glucose (Fermentation/oxidation: O/F) - Môi trường O/F (xem công thức pha chế nhãn) - Đun khấy cho tan hoàn toàn - Tiệt trùng 1210C 15 phút, để nguội 450C Trung tâm Học ĐHtiệtCần - Thêm 1%liệu glucose trùng.Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu - Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm - Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm có chứa mơi trường OF Sau phủ 0.5-1ml dầu parafin tiệt trùng vào ống nghiệm để tạo điều kiện yếm khí ống nghiệm Để tủ ấm 280C - Đọc kết sau 24h- ngày - Lên men (F) ống có phủ parafin chuyển sang màu vàng - Oxidation (O) ống khơng có phủ parafin chuyển sang màu vàng - Khơng đổi (N) hai ống có màu xanh xanh lơ Khả sinh indole - Môi trường nutrient broth - Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm Trang 37 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com - Thanh trùng 1210C 15 phút Để nguội - Thuốc thử Kovac’s (bảo quản 40C) - Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm Để tủ ấm 280C - Sau 48 nhỏ vài giọt thuốc thử Kovac’s vào ống nghiệm Vi khuẩn sinh indole cho phản ứng (+) với vòng màu hồng đến đỏ sậm bề mặt môi trường ngược lại Phản ứng Voges- Proskauer (VP) - MR – VP broth (xem nhãn) - Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm - Thanh trùng 1210C 15 phút, để nguội Thuốc thử: A : Hòa tan 5g alpha naphthol (Merck) 100ml ethyl alcohol (Merck) Hòa tan 40g KOH (Prolabor) 100ml nước cất Trung tâmB:Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu - Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm Ủ 28 0C - Sau 48 nhỏ 0.6ml thuốc thử A 0.2ml thuốc thử B vào ống nghiệm, lắc để nghiêng ống nghiệm 30 phút - Sự chuyển màu hồng đỏ môi trường cho phản ứng (+) ngược lại Khả sử dụng citrate - Môi trường Simmon’s Citrate agar (xem nhãn) - Đun sôi khuấy cho tan - Cho 5ml môi trường vào ống nghiệm - Thanh trùng 1210C 15 phút - Để nghiêng để tạo mặt phẳng nghiêng ống nghiệm để nguội - Cấy vi khuẩn mặt đứng (dùng que cấy thẳng cắm thẳng xuống mặt đứng) bề mặt nghiêng (dùng que cấy thường) ống nghiệm Ủ 280C Trang 38 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com - Sau 2-7 ngày, vi khuẩn sử dụng citrate tạo màu xanh lơ môi trường Simmon’s Citrate agar cho kết (+) ngược lại Starch hydrolysis (khả thủy phân starch) - Nutrient agar (xem công thức pha chế nhãn) + 0,5% starch - Thanh trùng 1210C 15 phút - Để nguội khoảng 450C, đổ môi trường đĩa petri - Thuốc thử Lugol’s Iodine:  5g Iodine (Merck),10g Potassium iodine (KI; Merck),100ml nước cất  Hòa tan KI Iodine 10ml nước cất thêm tiếp cho đủ 100ml - Cấy vi khuẩn đĩa petri ủ 280C - Sau 48 nhỏ thuốc thử Lugol’s Iodine bề mặt vi khuẩn Trong vòng 30 phút, xuất vịng trịn lan rộng xung quanh chỗ có khuẩn liệu phát triển phản ứng (+) ngược tâmvi Học ĐHcho Cần Thơ @vàTài liệulại.học tập nghiên cứu - Trung Khả sử dụng urea - 0,1% pepton + 0,2% KH2PO4 + 0,0012% phenol red + 0,1 % glucose - Thêm 2% urea cho phản ứng Môi trường làm đối chứng khơng có urea - Cho 3ml mơi trường vào ống nghiệm - Thanh trùng 1210C 15 phút - Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm Để tủ ấm 280C - Đọc kết vòng ngày Phản ứng dương ống nghiệm có urea chuyển sang màu hồng Khả sử dụng nguồn carbohydrate - Nutrient broth (xem công thức pha chế nhãn) Trang 39 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com - 0,4% Bromothymol blue (1,6%) (Merck) - 1% đường (glucose, arabinose, cellobinose,…) Chỉnh pH 6.8 - Cho 3ml môi trường vào ống nghiệm - Thanh trùng 1210C 15 phút Để nguội - Dùng môi trường đường tương ứng - Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm Ủ 280C - Đọc kết vịng 2-7 ngày - Nếu mơi trường chuyển sang màu vàng cho phản ứng (+) ngược lại Khả sinh gas từ glucose - Nutrient broth (xem công thức pha chế nhãn) - 0,4% Bromothymol blue (1,6%) - 1% đường glucose Chỉnh pH 6.8 Trung tâm Học ĐH Cần Thơnghiệm @ Tài liệutrùng họccótập cứu - Cho 3ml liệu môi trường vào ống tiệt chứavà sẵnnghiên chuông (tiệt trùng) - Thanh trùng 1210C 15 phút Để nguội - Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm Ủ 280C - Đọc kết vịng 2-7 ngày - Nếu mơi trường chuyển sang màu vàng chuông mặt môi trường cho phản ứng (+) ngược lại Khả sinh H2S - Môi trường TSI (60g/1000ml nước cất) - Đun khuấy cho tan hoàn toàn - Tiệt trùng 1210C 15 phút Để nguội 450C - Cho 5ml môi trường vào ống nghiệm Trang 40 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com - Để nghiêng ống nghiệm tạo mặt phẳng nghiêng chừa lại khoảng 12cm thạch đứng ống nghiệm để nguội - Cấy vi khuẩn mặt đứng (dùng que cấy thẳng cắm thẳng xuống mặt đứng) bề mặt nghiêng (dùng que cấy thường) ống nghiệm Ủ 280C - Đọc kết sau 14-28 - Vi khuẩn sinh H2S cho màu đen ống nghiệm - Vi khuẩn lên men đường glucose cho màu đỏ phần thạch nghiêng màu vàng phần thạch đứng (K (alkaline)/A (acid)) - Vi khuẩn lên men đường glucose lactose sucrose cho màu vàng phần thạch nghiêng màu vàng phần thạch đứng (A (acid)/ A (acid)) - Vi khuẩn lên men đường lactose sucrose cho màu vàng phần thạch nghiêng màu đỏ phần thạch đứng (A (acid)/K(alkaline)) - Vi khuẩn không lên men đường glucose, không lên men đường lactose sucrose cho màu đỏ phần thạch nghiêng màu đỏ phần thạch đứng (K (alkaline)/ K (alkaline)) Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Tính mẫn với hợp chất 2,4-diamino-6,7-diisopropyl pteridine (O/129) - Giúp phân biệt nhóm vi khuẩn Aeromonas Vibrio Vi khuẩn Aeromonas kháng với O/129 Vibrio mẫn cảm với hợp chất - Phải thao tác bước sau điều kiện vô trùng - Sử dụng môi trường muller hinton agar (MHA), giấy tẩm O/129 ống nghiệm chứa 5ml 0,9% NaCl tiệt trùng - Dùng que cấy tiệt trùng nhặt vi khuẩn ròng cho vào ống nghiệm chứa 5ml 0,9% NaCl tiệt trùng lắc - So sánh màu dung dịch vi khuẩn tiêu chuẩn McFarland 0,5 - Dùng pipet tiệt trùng hút dung dịch vi khuẩn cho lên đĩa MHA - Nghiêng nhẹ để trãi dung dịch khắp bề mặt agar rối rút bỏ lượng dung dịch thừa - Dùng kẹp đặt giấy tẩm O/129 lên mặt đĩa agar Để đĩa tủ ấm 280C Trang 41 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com - Đọc kết sau 24 Vi khuẩn mẫn cảm với O/129 tạo nên vịng trịn vơ trùng ≥15mm xung quanh đĩa tẩm O/129 Khả lên men β-galactosidase (ONPG, Ortho-nitrophenyl galactosidase) - Đĩa nuôi vi khuẩn kiểm tra tính rịng - Dùng que cấy tiệt trùng nhặt vi khuẩn rịng cho vào ống nghiệm chứa 0,2 ml 0,9% NaCl tiệt trùng lắc - So sánh màu dung dịch vi khuẩn tiêu chuẩn McFarland 0,5 - Dùng kẹp đặt đĩa ONPG vào ống nghiệm chứa dung dịch vi khuẩn - Nếu dung dịch chuyển sang vàng sau 20 phút đọc kết dương tính (+) - Nếu sau từ 20 phút đến dung dịch không chuyển màu đọc kết âm tính (-) Trung tâm Học liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập nghiên cứu Các hóa chất mơi trường dùng cho test tiêu sinh lý sinh hóa phải chuẩn bị trước test 24 Trang 42 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... để định danh A hydrophila nhằm khẳng định kết định danh phương pháp sinh hóa Đề tài ? ?Tiêu chuẩn hóa phương pháp xác định tiêu sinh lý sinh hóa vi khuẩn Aeromonas hydrophila? ?? thực Khoa Thủy sản. .. vi khuẩn Các tiêu sinh lý - Phản ứng oxidase - Phản ứng catalase - Khả phát triển Thơ vi @ khuẩn 6% ,tập 7% NaCl cứu Trung tâm Học liệu ĐH Cần Tài? ?? 0%, liệu3 %, học và1 0% nghiên Các tiêu sinh hóa. .. tâm liệuv? ?ĐH Thơ @cũng Tàităng liệulênhọc tập? ?? ?và nghiên cứu CFU/ml 2.4 Phương pháp định danh vi khuẩn Aeromonas hydrophila Mỗi lồi vi khuẩn có nhiều đặc tính sinh lý, sinh hóa khác Có nhiều phương