CÁC kỹ THUẬT ELISA

TIỂU LUẬN CÁC KỸ THUẬT ELISA LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Đặt vấn đề: Trong nghiên cứu thí nghiệm, thực nghiệm thực tế phát điều trị bệnh lý người, động vật thực vật, lĩnh vực chẩn đoán ln đóng vai trị thiết yếu Trong số kỹ thuật quan trọng chẩn đốn, khơng thể khơng kể đến ELISA ELISA kỹ thuật sử dụng rộng rãi y dược, thú y bệnh lý thực vật, phương pháp chẩn đoán quan trọng miễn dịch học số lĩnh vực khác Qua trình phát triển, nghiên cứu ứng dụng thực nghiệm, ELISA có nhiều cải tiến biến đổi, phân thành nhiều kỹ thuật nhỏ nhằm phù hợp cho trường hợp, điều kiện, đối tượng cụ thể Sự đa dạng ELISA dẫn đến cần thiết phải có nhìn tổng thể, bao quát so sánh cụ thể biến thể ELISA nhằm lựa chọn sử dụng kỹ thuật cách phù hợp cho hoàn cảnh Đó mục đích viết Tổng quan: Enzyme-linked immunosorbent assay, hay gọi ELISA, enzyme immunoassay hay EIA kỹ thuật chẩn đoán dựa miễn dịch học phổ biến nhiều lĩnh vực, từ y học, y dược, thú y, sinh học, kiểm định thực phẩm, môi trường v.v… ELISA phổ biến rộng rãi nhờ vào đặc tính có lợi cho thực nghiệm nó: dễ thực hiện, tốc độ nhanh, chi phí thấp, dễ sản xuất, an tồn với độ nhạy độ đặc hiệu chấp nhận Tiền thân ELISA kỹ thuật miễn dịch học phóng xạ (radioimmunoassay – RIA), phát triển Rosalyn Sussman Yalow Solomon Aaron Berson (xuất lần năm 1960; Nobel y học cho Rosalyn S Yalow năm 1977) Mặc dù phương pháp có độ nhạy độ đặc hiệu cao, nhiên việc đánh đấu phóng xạ yêu cầu kỹ thuật cao, phức tạp, tốn kém, việc sử dụng phải vô cẩn thận khả gây nguy hiểm phóng xạ đưa đến nhu cầu tìm kiếm phương pháp cải tiến thay Để thay cho việc sử dụng chất đánh dấu phóng xạ, người ta sử dụng kỹ thuật liên kết kháng nguyên kháng thể với enzyme (enzyme-linked) có khả thực phản ứng nhận biết (ví dụ gây đổi màu chất) Quy trình liên kết enzyme phát triển độc lập Stratis Avrameas G.B Pierce Bên cạnh đó, việc cần phải loại bỏ kháng nguyên/kháng thể thứ cấp không gắn dẫn tới kỹ thuật cố định kháng nguyên/kháng thể sơ cấp (immunosorbent) công bố Wide Jerker Porath năm 1966 Năm 1971, hai nhóm nghiên cứu Peter Perlmann Eva Engvall với Anton Schuurs Bauke van Weemen độc lập công bố báo tổng hợp kỹ thuật thành ELISA ELISA – nguyên lý biến thể: 3.1 Nguyên lý bản: Theo nguyên lý miễn dịch học, kháng nguyên (antigen) có nhiều yếu tố kháng nguyên (epitope), epitope có khả kết hợp với kháng thể (antibody) tương ứng với Hầu hết kháng nguyên có vài epitope đặc trưng cho nó, dựa mà người ta xác định kháng nguyên Bên cạnh đó, xuất kháng nguyên thể số trường hợp có khả kích thích thể tạo kháng thể đơn dòng đặc hiệu để chống lại kháng ngun Thơng qua việc xác định kháng thể người ta gián tiếp xác định kháng nguyên thể LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Dựa sở đó, kỹ thuật ELISA thiết lập nhằm chẩn đoán diện kháng nguyên hay kháng thể Để xác định yếu tố cần chẩn đoán (kháng nguyên/kháng thể) người ta sử dụng nhiều yếu tố phát (kháng thể/kháng nguyên/bổ thể) có phản ứng miễn dịch đặc hiệu với yếu tố cần chẩn đoán Các yếu tố phát đánh dấu enzyme cho phản ứng miễn dịch với yếu tố cần chẩn đoán tạo nên thay đổi nhận biết mắt thường hay chí định lượng công cụ so màu khác cho chất enzyme đánh dấu vào 3.2 Các biến thể ELISA: Mặc dù nguyên tắc ELISA đơn giản, qua trình thực nghiệm sử dụng vấp phải nhiều vấn đề, từ vấn đề hiệu phương pháp độ nhạy, độ đặc hiệu, giới hạn phát vấn đề thực nghiệm thời gian thực hiện, độ phức tạp, chi phí khả hệ thống hóa thành dụng cụ (KIT) để sản xuất cơng nghiệp Chính vậy, người ta khơng ngừng cải tiến phương pháp này, đưa nhiều phương pháp phù hợp với điều kiện, đối tượng khác Cho đến nay, có nhiều biến thể đa dạng ELISA Tuy nhiên nhìn chung, tất biến thể phân loại sau: • ELISA dị pha (heterogeneous), hay cịn gọi ELISA pha rắn (solid phase), gồm phương pháp: - ELISA trực tiếp (direct ELISA) - ELISA gián tiếp (indirect ELISA) - ELISA sandwich - ELISA cạnh tranh (competitive ELISA) • ELISA đồng pha (homogeneous), gồm phương pháp ELISA đồng pha cạnh tranh (competitive) không cạnh tranh (non-competitive) Trong giới hạn viết này, khái quát phương pháp chung cho loại biến thể Trong thực nghiệm chẩn đốn, cần có điều chỉnh thích hợp quy trình cụ thể cho đối tượng khác Các ký hiệu quy ước phần sau: ] Bề mặt rắn Ag Kháng nguyên mẫu Ở quy ước yếu tố cần xác định mẫu có mang yếu tố kháng nguyên (epitope) loại kháng thể Agc Kháng nguyên cạnh tranh Ab Kháng thể E Enzyme AAb Kháng kháng thể Liên kết chất cần đánh dấu chất đánh dấu = Liên kết với bề mặt rắn – Liên kết miễn dịch 3.2.1 ELISA dị pha: Trong ELISA dị pha, yếu tố cần chẩn đoán tách khỏi hỗn hợp dung dịch mẫu cách cố định lên bề mặt rắn (có thể nhựa, thủy tinh, giấy, màng nitrocellulose, agarose, polyacrylamide gel hay chí vi khuẩn cố định) tạo thành hai pha cố định tự do, theo sau môt bước loại bỏ pha tự Yếu tố phát thêm vào sau để phát diện yếu tố cần chẩn đốn cịn lại pha cố định thơng qua hoạt tính enzyme Các phương pháp cố định yếu tố lên bề mặt rắn loại bỏ pha tự đề cập đến phần 4.1 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 3.2.1.1 ELISA trực tiếp: Phương pháp sử dụng ELISA định lượng mà thường sử dụng cho ELISA định tính Yếu tố cần chẩn đốn (ví dụ kháng nguyên) cố định trực tiếp lên bề mặt rắn sau xác định diện yếu tố phát Phương pháp mô tả tổng quát qua sơ đồ sau: ] = Ag + Ab E → ] = Ag – Ab E Phương pháp có ưu điểm cần lần ủ tiết kiệm thời gian tối thiểu việc kiểm soát điều kiện trình thực (thay đổi nhiệt độ buffer cho lần ủ, tính thời gian…) Tuy nhiên, nhược điểm nhuộm màu (background staining) cao liên kết không đặc hiệu kháng thể với bề mặt rắn protein cố định bề mặt rắn Việc đánh dấu loại kháng thể sử dụng cho kháng nguyên tốn kém, phải chẩn đoán số lượng lớn loại kháng nguyên khác Ngồi ra, phương pháp có giới hạn phát cao, cần lượng lớn yếu tố cần chẩn đoán liên kết hiệu yếu tố lên bề mặt rắn cạnh tranh protein khác trình phản ứng miễn dịch 3.2.1.2 ELISA gián tiếp: Phương pháp ELISA gián tiếp tương tự ELISA trực tiếp, người ta sử dụng tới hai lớp yếu tố phát hiện, có lớp yếu tố phát cuối mang enzyme Sơ đồ phương pháp gồm bước sau: ] = Ag + Ab + AAb E → ] = Ag – Ab – AAb E Ưu điểm phương pháp cần tạo loại kháng kháng thể mang enzyme để nhận biết cho nhiều kháng nguyên khác Kháng thể sơ cấp protein, mang epitope riêng Nếu nhiều loại kháng thể khác sản xuất từ loài sinh vật, tất loại kháng thể mang epitope chung đặc trưng cho lồi Việc sản xuất kháng kháng thể có khả liên kết với epitope hồn tồn có thể, thơng qua việc tiêm kháng thể vào loài sinh vật khác Phương pháp cho giới hạn phát thấp khoảng 10 lần so với ELISA trực tiếp, khả liên kết nhiều kháng kháng thể lên phân tử kháng thể sơ cấp, làm tăng số lượng enzyme cố định Tuy nhiên nhược điểm tăng số bước thực làm tăng việc kiểm sốt điều kiện q trình kéo dài thời gian chẩn đốn Nhằm tăng khả phát hiện, người ta sử dụng kỹ thuật nối cầu (brigde) bổ trợ cho ELISA gián tiếp Về nguyên tắc, kỹ thuật brigde tương tự ELISA gián tiếp, sử dụng nhiều lớp yếu tố phát (trên hai lớp) Qua lớp yếu tố phát hiện, tín hiệu lại khuếch đại lên vài lần Tuy nhiên cần lưu ý nhiều lớp yếu tố phát hiện, số bước thực nhiều kéo dài thời gian, tăng thêm việc kiểm soát điều kiện cho trình, tăng khả liên kết chéo yếu tố phát với Các kỹ thuật brigde liệt kê phần 4.2 3.2.1.3 ELISA sandwich: Tương tự ELISA trực tiếp gián tiếp, phương pháp yếu tố cần chẩn đoán cố định lên bề mặt rắn Tuy nhiên việc cố định không thực trực tiếp mà thông LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com qua liên kết miễn dịch với yếu tố phát (thường kháng thể) gắn cố định sẵn bề mặt rắn Sơ đồ tổng quát sau: → ] = Ab1 + Ag + Ab2 E ] = Ab1 – Ag – Ab2 E Sau bắt giữ yếu tố cần chẩn đoán, lúc phương pháp quay lại tương tự ELISA trực tiếp gián tiếp sau cố định yếu tố cần chẩn đốn Người ta sử dụng kháng thể liên kết enzyme để xác định trực tiếp yếu tố (như ELISA trực tiếp), dùng số phương pháp brigde ELISA gián tiếp Bên cạnh kháng thể người ta cố định số yếu tố khác lên mặt rắn Clq, receptor, lectin… Phương pháp có nhiều ưu điểm vượt trội, thứ giảm nhuộm màu phản ứng không đặc hiệu loại bỏ hầu hết thành phần tạp, phản ứng thực dễ dàng hơn, Ab1 gắn sẵn bề mặt rắn tạo thành KIT thực chẩn đốn mà kháng ngun khơng thể gắn lên mặt rắn Bên cạnh có nhược điểm riêng, quan trọng làm tăng phản ứng chéo liên kết không đặc hiệu lớp yếu tố phát thứ cấp với Ab1 Nhược điểm nghiên cứu khắc phục cách cố định phần đoạn nhánh (Fab) kháng thể Tuy nhiên việc làm làm giảm độ đặc hiệu kháng thể xét nghiệm kháng thể loại virus có quan hệ huyết học (Koenig, 1981; Rybycki von Wechmar, 1981; Koenig Paul, 1982) 3.2.1.4 ELISA cạnh tranh: ELISA cạnh tranh phương pháp ELISA hiệu cho định lượng yếu tố diện mẫu với lượng nhỏ ELISA cạnh tranh sử dụng lượng kháng nguyên loại với kháng nguyên mà ta muốn định lượng mẫu (kháng nguyên cạnh tranh) cho phản ứng miễn dịch với loại kháng thể đặc hiệu cố định mặt rắn, sau đo lượng kháng ngun cạnh tranh thơng qua hoạt tính enzyme liên kết với Kháng nguyên cạnh tranh diện nhiều cho biết loại kháng nguyên mẫu ngược lại Có ba biến thể phương pháp này: - Phương pháp bão hịa cân tương đối (quasi-equilibrium saturarion): ] = Ab – Ag ] = Ab + Ag + Agc E → ] = Ab – Agc E Trong phương pháp kháng nguyên mẫu (Ag) kháng nguyên cạnh tranh (Agc) cho phản ứng lúc với kháng thể cố định Hai loại kháng nguyên phản ứng miễn dịch với Ab theo tỉ lệ tương ứng với tỉ lệ nồng độ hai loại kháng nguyên, từ xác định nồng độ Ag đo tỉ lệ Agc lại sau phản ứng với lượng Agc sử dụng ban đầu Cần lưu ý lượng kháng nguyên cạnh tranh phải biết trước phải dư để bão hịa hết lượng kháng thể - Phương pháp bão hòa thứ tự (sequential saturation): ] = Ab – Ag ] = Ab + Ag → ] = Ab – Ag + Agc E ] = Ab → ] = Ab – Agc E LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phương pháp thường sử dụng bão hòa cân tương đối Khác với phương pháp trên, với bão hòa thứ tự kháng nguyên mẫu cho phản ứng trước Sau đó, lượng dư kháng nguyên cạnh tranh thêm vào để bão hòa lượng kháng thể cịn trống Hoạt tính enzyme đo cho biết lượng Agc phản ứng với kháng thể cịn trống, từ tính lượng Ag chiếm chỗ kháng thể Trong phương pháp này, lượng Agc ban đầu không cần phải biết trước, nhiên cần phải dư để bão hòa lượng kháng thể lại Một biến thể phương pháp kháng thể Ab không cố định trước, mà sau phản ứng với kháng nguyên mẫu Ag kháng nguyên cạnh tranh Agc cố định lại cách phản ứng với kháng kháng nguyên AAb cố định mặt rắn Ab – Ag Ab + Ag → Ab – Ag + Agc E → Ab + ] = AAb Ab – Agc E ] = AAb – Ab – Ag → ] = AAb – Ab – Agc.E - Phương pháp ức chế kháng thể (antibodies inhibition): Thay cố định kháng thể lên mặt rắn, người ta cố định kháng nguyên cạnh tranh Đầu tiên, người ta cho kháng nguyên mẫu phản ứng với lượng kháng thể biết trước Sau đó, lượng kháng thể cịn lại chưa phản ứng phản ứng với kháng nguyên cạnh tranh, cố định lại Sau bước rửa ta đo lượng kháng thể cịn cố định lại suy lượng kháng thể phản ứng với kháng nguyên mẫu Ag – Ab E Ag + Ab E → Ag – Ab E + Ab E ] = Agc → ] = Agc – Ag E Bên cạnh việc định lượng kháng ngun, phương pháp cịn sử dụng để so sánh kháng nguyên với nhau, Altschuh van Regenmortel (1982) dùng để nghiên cứu epitope khác protein vỏ virus khảm thuốc 3.2.2 ELISA đồng pha: Phương pháp thường sử dụng để định lượng phân tử nhỏ Khác với RIA ELISA dị pha, phương pháp không cần bước tách biệt yếu tố gắn kết tự do, dựa thay đổi hoạt tính enzyme thông qua phản ứng liên kết miễn dịch Ưu điểm lớn phương pháp giảm mức độ phức tạp phản ứng việc cố định yếu tố lên bề mặt rắn, thời gian thực nhanh giảm lượng kháng thể cần dùng khơng phải tráng bề mặt rắn lớn Tuy nhiên có nhược điểm hầu hết LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com phương pháp làm thay đổi hoạt tính enzyme dựa thay đổi cấu trúc không gian yếu tố gắn kết với enzyme (phần 4.3) Hướng cần có thiết kế xác cấu trúc khơng gian thành phần, yêu cầu phức tạp, tốn kém, hầu hết áp dụng với kháng nguyên nhỏ gây nhiều hạn chế việc sản xuất thành phần phản ứng ELISA Đây yếu tố giới hạn lớn kỹ thuật ELISA đồng pha Ngoài ra, kết bị ảnh hưởng số yếu tố khác mẫu có khả làm biến đổi hoạt tính enzyme 3.2.2.1 ELISA đồng pha khơng cạnh tranh: Phương pháp đơn giản sử dụng enzyme liên kết với kháng thể cho phản ứng miễn dịch kháng nguyên kháng thể thay đổi hoạt tính enzyme (phương pháp Ngo Lenhoff, 1981 hay phương pháp Wei Reibe, 1977) 3.2.2.2 ELISA đồng pha cạnh tranh: Đây phương pháp ELISA đồng pha sử dụng nhiều Về mặt miễn dịch phương pháp tương tự ELISA dị pha cạnh tranh, với cạnh tranh kháng nguyên mẫu kháng nguyên cạnh tranh Ở kháng nguyên cạnh tranh đánh dấu với enzyme, chất enzyme, cofactor, inhibitor, v.v… Cịn mặt biến đổi hoạt tính enzyme có nhiều phương pháp khác sử dụng, điểm qua phần 4.3 Các biến thể kỹ thuật bổ trợ khác cho ELISA: Trong phần đề cập đến số kỹ thuật bổ trợ khác phương pháp kể ELISA Các kỹ thuật không thiết cố định cho loại ELISA mà kết hợp tự tùy theo nhu cầu thiết kế thí nghiệm chẩn đoán 4.1 Các kỹ thuật cố định yếu tố miễn dịch lên bề mặt rắn ELISA dị pha: Chọn lựa bề mặt rắn thích hợp nhân tố quan trọng việc cố định yếu tố miễn dịch Một bề mặt rắn cần thõa mãn yêu cầu sau: Khả gắn kết số lượng lớn yếu tố miễn dịch (tỉ lệ bề mặt/thể tích cao), khả cố định nhiều loại yếu tố khác nhau, tối thiểu phân tách ngược lại yếu tố cố định, mức độ phân hủy phân tử cố định không đáng kể, định hướng kháng thể cố định với hai đầu gắn kết quay lên phần thân gắn xuống mặt rắn Có nhiều bề mặt rắn thử nghiệm sử dụng ELISA dị pha: nhựa, thủy tinh, màng nitrocellulose giấy, agarose, cellulose, vi khuẩn cố định… Trong phần sơ lược qua loại bề mặt rắn phương pháp chung để cố định yếu tố lên bề mặt rắn 4.1.1 Nhựa: Cho đến nhựa bề mặt rắn sử dụng phổ biến nhất, nhờ vào quy trình cố định đơn giản Tuy nhiên, nhựa có số nhược điểm quan trọng: tốn lượng lớn yếu tố cố định, làm giảm lực kháng thể cố định với kháng nguyên lớn, tốc độ phản ứng miễn dịch chậm (hàng thay vài phút so với yếu tố dung dịch), lượng yếu tố gắn kết đơn vị diện tích thấp Có nhiều dạng bề mặt rắn làm từ nhựa: dạng hạt, đĩa, ống, que, dạng đầu diêm… Trong số đó, dạng phổ biến dạng chứa 12 x giếng 0,3 ml làm từ polystyrene polyvinylchloride (PVC) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình 1: Tấm nhựa chứa 12 x giếng dùng ELISA 4.1.1.1 Cố định liên kết khơng cộng hóa trị: Phương pháp cố định cách ủ bề mặt rắn với yếu tố cần cố định hịa tan dung mơi với điều kiện nhiệt độ nồng độ định Bản chất liên kết chưa hiểu rõ, nhiên liên kết bền trình thực ELISA, khơng có biện pháp thích hợp, yếu tố cố định phân tách ngược trở lại Có nhiều buffer sử dụng: 50 mM carbonate, pH 9,6; 10 mM Tris-HCl, pH 8,5 bổ sung 100 mM NaCl; PBS, chứa 10 mM sodium phosphat buffer, pH 7,2, bổ sung 100 mM NaCl hay dùng dung dịch saline hay nước khử ion Nên tránh chất không phân cực Triton X-100 hay Tween 20 chúng cạnh tranh mạnh với protein liên kết với mặt rắn Điều kiện thường sử dụng ủ qua đêm 4oC tủ giữ ẩm Tuy nhiên giảm thời gian ủ cách tăng nhiệt độ, tăng nồng độ yếu tố cần cố định thay đổi pH 4.1.1.2 Cố định liên kết cộng hóa trị: Phương pháp thuận tiện cho việc sản xuất lượng lớn bề mặt rắn tráng yếu tố miễn dịch, cần thiết để cố định yếu tố miễn dịch hấp thụ lên bề mặt rắn Một quy trình đơn giản dùng cho hầu hết yếu tố chứa nhóm amino tự oligopeptide hay hapten xử lý nhựa polystyrene với glutaraldehyde (Barrett, 1977), giảm pH xuống khoảng để hoạt hóa polystyrene kết dính với GA Sau cho yếu tố miễn dịch vào, tăng pH lên 9,5 để hoạt hóa GA tạo liên kết với yếu tố miễn dịch 4.1.1.3 Cố định kỹ thuật bridge: Người ta sử dụng số phân tử vừa có lực mạnh với nhựa vừa có khả liên kết yếu tố miễn dịch làm trung gian để liên kết yếu tố với bề mặt nhựa Skurrie Gilbert (1983) tráng bề mặt nhựa với albumin huyết bò, sử dụng lớp tráng để cố định kháng nguyên rubella Một số phân tử tích điện dương sử dụng làm cầu để cố định DNA mạch đôi Khác với DNA mạch đơn, DNA mạch đôi hấp thụ lên polystyrene Klotz (1982) dùng dung dịch protamine sulfate 1% xử lý bề mặt polystyrene Một số hợp chất tích điện dương khác sử dụng MBSA (Ferrua cộng sự, 1983) hay poly-L-lysiyne (Leipoid cộng sự, 1983) LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 4.1.2 Màng nitrocellulose giấy: Dạng màng nitrocellulose phổ biến nghiên cứu acid nucleic, nhiên trở nên thông dụng protein blotting Ưu điểm lớn loại màng cần yếu tố miễn dịch để cố định, μl dung dịch sử dụng làm khô bề mặt màng, giới hạn khu vực bám yếu tố vịng đường kính nhỏ mm Những khu vực khác khóa protein trơ hay hóa chất che phủ khác Một ưu điểm khác kháng nguyên bám loại màng dù có mặt hóa chất khơng phân cực Tripton X-100 hay Tween Hình 2: Màng nitrocellulose dùng ELISA 4.1.2.1 Dot protein lên màng: Phương pháp vô đơn giản sử dụng micropipete nhỏ dung dịch thành giọt màng, đợi cho khô tiếp tục nhỏ liên tiếp nhiều lần, sau bước hấp nóng giúp ổn định liên kết protein lên màng Thay sử dụng chất che phủ vị trí trống BSA hay gelatin, người ta thêm Tween 20 0,5% dung dịch chứa yếu tố miễn dịch để ngăn cản liên kết không đặc hiệu 4.1.2.2 Gắn kháng nguyên tan chất tẩy rửa lên đĩa nitrocellulose: Những đĩa nhỏ đường kính khoảng mm dập màng nitrocellulose thả nước cất để làm ướt Màng ướt đặt giấy thấm cho 10 – 20 μl mẫu Đĩa sau làm khơ ủ với chất che phủ để khóa vị trí trống Nếu sử dụng Triton X-100, cần cố định đĩa với GA nhằm tránh phân tách ngược lại protein 4.1.2.3 Liên kết cộng hóa trị giấy: Quy trình Ceska Lundkvist (1972) để liên kết kháng thể lên giấy sử dụng đĩa đường kính mm dập giấy cellulose Quy trình gồm hai bước: kích hoạt giấy với cyanogen bromide (CNBr) liên kết yếu tố lên giấy Để kích hoạt giấy, ngâm đĩa giấy vào nước cất phút, sau đo thêm 600 ml dung dịch cyanogen bromide (CNBr), tăng pH lên 10,5 giữ ổn định pH 30 phút Cuối rửa sấy khô nhiệt độ phòng trữ 4oC Bước liên kết thực với việc hòa tan ml yếu tố miễn dịch tinh 40 ml NaHCO3 100 mM 4oC Thêm g đĩa giấy kích hoạt vào khuấy nhẹ 4oC Rửa nhiệt độ phòng LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Phương pháp cho mức độ hấp thụ yếu tố miễn dịch gấp – 10 lần so với phương pháp liên kết khơng cộng hóa trị lên nhựa, mức độ phân tách ngược lại khoảng 13% 4.1.3 Thủy tinh: Yếu tố miễn dịch gắn lên phiến thủy tinh cách gia nhiệt, cố định với formaldehyde hay liên kết glutaraldehyde với que thủy tinh aminoalkylsilyn Theo Conway de Macario cộng (1983) để cố định kháng nguyên thành giọt, trước tiên rửa phiến kính với cồn 95o Nhỏ lượng kháng nguyên lên bề mặt phiến kính cố định theo phương pháp sau: - Với virus: làm khô bốc - Vi khuẩn Archaebacteria: hơ nhanh mặt phiến kính đèn cồn ba lần - Tế bào động vật có vú: Sấy khơ nhỏ giọt acetone lạnh - Kháng nguyên không cụ thể: để khô bốc ủ 30 phút với phosphat buffer saline Để liên kết yếu tố miễn dịch với que thủy tinh aminoalkylsilyn, sử dụng quy trình Robinson cộng (1971), Hamaguchi cộng (1976) Đun nóng que thủy tinh đường kính mm, dài mm 500oC Sau ngâm 24 dung dịch 3aminopropyltriethoxysilan 2% 45oC Rửa lại với acetone làm khô Ngâm glutaraldehyde 1%, rửa lại với 250 mM sodium phosphat buffer, pH 7,5 Sau ngâm dung dịch yếu tố miễn dịch cần cố định 30 phút rửa lại với dung môi dùng cho ELISA 4.1.4 Các bề mặt rắn khác: 4.1.4.1 Các cấu trúc ma trận: Các cấu trúc ma trận có đồng phân không gian agarose, dextran, allyl dextrose hay cellulose kích hoạt chất oxy hóa CNBr hay NaIO4, tạo gốc aldehyde tạo liên kết Schiff base với nhóm animo tự protein Agarose dạng hạt (Sepharose) có ưu điểm yếu tố miễn dịch giữ dạng treo, cấu trúc xốp giúp hấp thu kháng nguyên nhiều (10 μl sepharose hấp thu lượng kháng nguyên gấp – 40 lần so với đĩa giấy đường kính mm gấp 100 lần so với giếng nhựa), mức độ hấp thu không đặc hiệu Các loại bề mặt rắn khác dextran, allyl dextrose hay cellulose cịn có mức độ hấp thu yếu tố miễn dịch cao agarose Tuy nhiên dextran dễ bị phân hủy tác dụng chất oxy hóa mạnh NaIO4 4.1.4.2 Vi khuẩn chứa protein A (SpA): Protein A phân lập từ vách Staphylococcus aureus có lực với phần thân (Fc) nhiều kháng thể S.aureus cố định trichloroacetic acid (TCA) formalin để dùng cho ELISA Quy trình Lindmark (1982) cố định Staphylococci cách đun nước sơi phút, sau cho lượng tương đương TCA 10% nóng khuấy Đun tiếp 90oC phút làm lạnh nhanh, sau ly tâm với potassium phosphat buffer, pH 7,4 để thu vi khuẩn cố định 4.1.5 Phân tách pha cố định pha tự do: Với bề mặt rắn lớn (nhựa, thủy tinh, màng nitrocellulose giấy), phương pháp phân tách đơn giản hút rửa với dung mơi rửa thích hợp giúp phân tách liên kết không đặc hiệu giữ ổn định liên kết đặc hiệu Bước phân tách đơn giản nguyên nhân khiến bề mặt rắn phổ biến rộng rãi, dù mức độ hấp thụ yếu tố miễn dịch chúng thấp 10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Các loại bề mặt rắn khác (hạt agarose, sephacryl, cellulose vi khuẩn) có bề mặt hấp phụ lớn, cho phản ứng miễn dịch nhanh hơn, nhiên cần phải sử dụng số phương pháp phức tạp để phân tách hai pha: ly tâm, lọc, dùng từ trường… 4.2 Các kỹ thuật brigde ELISA gián tiếp: Kỹ thuật brigde hiểu đơn giản kỹ thuật liên kết yếu tố cần chẩn đoán yếu tố phát mang enzyme thông qua nhiều lớp yếu tố phát trung gian Các kỹ thuật brigde không giới hạn ELISA gián tiếp mà dùng cho phương pháp khác ELISA sandwich hay ELISA cạnh tranh Có ba phương pháp brigde thường sử dụng ELISA: 4.2.1 Brigde enzyme liên kết miễn dịch (immunologically linked enzyme), hay gọi ELISA khuếch đại (amplified ELISA): ] = Ag + Ab1 + AAb + Ab2 E → ] = Ag – Ab1 – AAb – Ab2 E Phương pháp có ưu điểm đơn giản dễ sản xuất thành phần, chí sử dụng enzyme thơ Độ nhạy tăng cao, nhiên có nhược điểm AAb cần phải dư không hai tâm phản ứng gắn kết với Ab1 khơng thể phản ứng với Ab2 4.2.2 Brigde phức hợp biotin – avidin: Avidin protein bốn nhân có lịng trắng trứng lồi chim, bị sát lưỡng cư Mỗi nhân avidin có khả liên kết đặc hiệu với biotin (vitamin H/vitamin B7) Người ta sử dụng đặc điểm để thực phương pháp brigde: ] = Ag + Ab + AAb biotin + avidin + biotin E → ] = Ag – Ab – AAb biotin – avidin – biotin E Phương pháp sử dụng nhiều phương pháp enzyme liên kết miễn dịch, ưu điểm vượt trội không bị giới hạn lồi, nhạy AAb liên kết biotin khơng cần phải lượng dư việc liên kết với biotin ảnh hưởng tới hoạt tính khả hòa tan AAb enzyme Tuy nhiên phương pháp có vài giới hạn, avidin glycoprotein, có khả phản ứng với oligosaccharide, nhiễm sắc thể cô đặc hay protein chứa biotin khác có mẫu cố định mặt rắn với kháng nguyên, gây sai lệch kết 4.2.3 Brigde lectin: Tương tự avidin biotin, lectin sử dụng phương pháp brigde Concanavalin A biết có lực mạnh với POase (hydrogen-peroxide oxidoreductase) Sử dụng Con A làm cầu nối theo sơ đồ sau: ] = Ag + Ab Con A + POase → ] = Ag – Ab Con A – POase Tuy nhiên cần lưu ý lectin có lực với số đường cần ủ phức hợp Ab đánh dấu lectin với lượng dư đường đặc hiệu với lectin để tránh việc liên kết không đặc hiệu với đường mặt rắn Sau phản ứng miễn dịch với kháng nguyên, đường nên rửa 11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com khỏi lectin trước thêm enzyme Phương pháp có độ nhạy khơng có ưu điểm vượt trội so với phương pháp brigde khác 4.3 Kỹ thuật biến đổi hoạt tính enzyme ELISA đồng pha: Nguyên tắc ELISA đồng pha dựa thay đổi hoạt tính enzyme đánh dấu sau có liên kết miễn dịch kháng nguyên kháng thể Để tạo biến đổi này, có số phương pháp nghiên cứu nhiều tác giả khác Ngo Lenhoff (1981) sử dụng hai kháng thể đặc hiệu với hai epitope khác kháng nguyên, kháng thể đánh dấu loại enzyme cho sản phẩm enzyme tạo chất enzyme (ví dụ glucose oxidase GOase peroxidase POase) Phản ứng liên kết miễn dịch mang hai enzyme lại gần nhau, từ tăng hoạt tính tương đối enzyme Phương pháp sử dụng cho ELISA đồng pha không cạnh tranh, nhiên cịn cần nhiều cải tiến để tín hiệu thể rõ + Ag Ag Hình 3: Phương pháp Ngo Lenhoff (1981) Một phương pháp khác Wei Reibe (1977) gắn trực tiếp enzyme với kháng thể Khi kháng nguyên liên kết miễn dịch với kháng thể che lấp tâm hoạt động enzyme, khiến enzyme tiếp xúc chất làm giảm hoạt tính enzyme Về mặt lý thuyết, phương pháp có lợi điểm sử dụng cho kháng ngun có kích thước lớn, nhiên cần thiết phải có thiết kế xác mặt cấu trúc không gian kháng nguyên, kháng thể, enzyme chất Thiết kế khơng thích hợp làm cho kháng nguyên không che lấp hết tâm hoạt động enzyme, hoạt tính enzyme khơng giảm rõ rệt, enzyme lớn che lấp ngược lại kháng thể ngăn cản kháng nguyên liên kết với kháng thể + Ag Ag X Hình 4: Phương pháp Wei Reibe Đối với ELISA đồng pha cạnh tranh, phổ biến phương pháp Rubenstein cộng (1972), thương mại hóa tên EMIT (cơng ty Syva) Kháng ngun cạnh tranh gắn với enzyme cho liên kết miễn dịch với kháng thể làm che lấp tâm hoạt động enzyme, 12 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com làm giảm hoạt tính Khi có kháng nguyên mẫu, kháng thể phản ứng với kháng nguyên mẫu tâm hoạt động enzyme giải phóng tự do, tăng hoạt tính Agc X + Ag Agc Ag Hình 5: Phương pháp Rubenstein cộng (1972) Phương pháp Burd cộng (1977) sử dụng kháng nguyên cạnh tranh gắn với chất enzyme Việc liên kết miễn dịch với kháng thể ngăn cản không cho chất gắn vào enzyme Kháng nguyên mẫu cạnh tranh kháng thể giải phóng chất X + Ag Agc Agc Ag Hình 6: Phương pháp Burd cộng (1977) 13 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Carrico cộng (1976) đề xuất phương pháp gắn kháng nguyên cạnh tranh với cofactor inhibitor enzyme Tương tự trên, việc liên kết với kháng thể ngăn cản cofactor inhibitor gắn với enzyme Sự ngăn cản giảm kháng nguyên mẫu giành lấy kháng thể, làm tăng giảm hoạt tính enzyme tùy theo chất liên kết cofactor hay inhibitor Cofactor X Agc + Ag Agc Ag Hình 7: Phương pháp Carrico cộng (1976) Một biến thể tương tự phương pháp Carrico phương pháp đề xuất Bacquet Twumasi (1984), gắn kháng nguyên cạnh tranh với advidin Lúc advidin đóng vai trò tương tự inhibitor phương pháp enzyme chứa biotin X Biotin Avidin Agc X Agc + Ag Ag Hình 8: Phương pháp Bacquet Twumasi (1984) 14 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Lựa chọn phương pháp ELISA thích hợp: Việc lựa chọn ELISA số nhiều kỹ thuật chẩn đoán việc lựa chọn phương pháp thích hợp ELISA để dùng vào xét nghiệm phụ thuộc vào nhiều yếu tố, quan trọng khả tìm kháng thể đặc hiệu, thời gian thực xét nghiệm, giới hạn phát yêu cầu độ nhạy độ đặc hiệu Nền tảng kỹ thuật ELISA dựa liên kết miễn dịch đặc hiệu, việc có kháng thể đặc hiệu với yếu tố điều tiên ELISA Đây nguyên nhân yếu quan trọng khiến ELISA hay số phương pháp ELISA sử dụng số trường hợp, ví dụ phân biệt subtype số vi khuẩn virus Thời gian thực xét nghiệm yếu tố quan trọng thực tiễn Mặc dù ELISA kỹ thuật có thời gian thực nhanh, tùy theo xét nghiệm từ khoảng tiếng vài ngày sử dụng KIT ELISA chuẩn bị sẵn, nhiên yêu cầu thực tế, thời gian xét nghiệm chưa thích hợp, buộc người ta phải lựa chọn kỹ thuật khác nhanh dù tốn Giới hạn phát phương pháp cho biết lượng yếu tố tối thiểu mà phương pháp phát Mặc dù có nhiều phương pháp giúp làm giảm giới hạn phát hiện, nhiên phương diện ELISA xa so với phương pháp dựa phân tử sắc ký khối phổ, lai protein, lai nucleic acid, PCR… Độ nhạy độ đặc hiệu phương pháp phải tính đến Độ nhạy (sensitivity) cho biết tỉ lệ mẫu thực dương số mẫu chẩn đoán dương ngược lại, độ đặc hiệu (specificity) cho biết tỉ lệ mẫu thực âm số mẫu chẩn đoán âm Trên lý thuyết thống kê xác suất, việc tăng độ nhạy làm giảm độ đặc hiệu ngược lại Do tùy theo yêu cầu thực tế xét nghiệm, cần xác định độ nhạy độ đặc hiệu thích hợp Ví dụ xét nghiệm vi sinh vật nguy hiểm, cần thiết phải tăng độ nhạy để khơng bỏ sót trường hợp dương tính Cũng nên tính đến tỉ lệ dương tính số mẫu Ví dụ hai loại bệnh có mức độ nguy hiểm nhau, nhiên loại bệnh có tỉ lệ mắc dân cư thấp, yêu cầu phải tăng độ đặc hiệu nhằm giảm số lượng ca chẩn đoán nhầm Sau xác định độ nhạy độ đặc hiệu cần thiết, việc lựa chọn kỹ thuật hay phương pháp có thơng số tương thích vấn đề không dễ dàng Độ nhạy độ đặc hiệu kỹ thuật hay phương pháp biến thiên tùy theo thân kỹ thuật hay phương pháp (ví dụ ELISA gián tiếp có độ nhạy cao độ đặc hiệu so với ELISA trực tiếp), khả đáp ứng phương pháp loại mẫu (ví dụ mẫu nhiều chất tạp huyết làm giảm độ đặc hiệu phương pháp ELISA trực tiếp gián tiếp nhuộm màu cao), đặc tính kháng thể enzyme, điều kiện thí nghiệm (nhiệt độ, pH, thiết bị…) Người thực xét nghiệm cần linh hoạt, lựa chọn kết hợp phương pháp khác tùy theo điều kiện thực tế để đạt độ nhạy độ đặc hiệu cần thiết Ngoài yếu tố tiên trên, cần tính đến yếu tố tùy chọn khác mức độ phức tạp, độ an toàn, khả hệ thống hóa chi phí cho xét nghiệm Về phương diện này, ELISA có ưu điểm đa dạng phương pháp, cho phép nhiều lựa chọn thực tiễn Kết luận: Mặc dù có xuất nhiều phương pháp mới, ELISA kỹ thuật quan trọng miễn dịch học nhiều lĩnh vực khác, nhờ vào tính đơn giản, nhanh chóng, đặc hiệu giá thành thấp Chính vậy, ELISA không ngừng cải tiến nhiều phương pháp khác tiếp tục đời nhằm hoàn thiện tối ưu hóa kỹ thuật trường hợp cụ thể Qua phương pháp kỹ thuật tổng quát thảo luận đây, 15 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com thấy phần đa dạng kỹ thuật ELISA Sự đa dạng cho phép có nhiều lựa chọn sử dụng ELISA, nhiên yêu cầu người thực cần phải nắm rõ tất biến thể nhằm lựa chọn phương pháp tối ưu nhất, đồng thời cần có linh động cần thiết để kết hợp thay đổi cách hiệu để tạo quy trình cụ thể cho thí nghiệm, xét nghiệm chẩn đốn Nếu thực điều này, ELISA trở thành công cụ mạnh nghiên cứu lẫn thực tiễn Tài liệu tham khảo: R.H Burdon, P.H van Knippenberg, 1985, Laboratory Techniques In Biochemistry And Biology, volume 15, P Tijssen, Practice And Theory Of Enzyme Immunoassays, Elsevier, Amsterdam, Netherlands John M Walker, 2008, Methods In Molecular Biology, volume 516, John A Crowther, The ELISA Guide Book, 2nd edition, Humana Press, Springer, New York, USA John M Walker, 1995, Methods In Molecular Biology, volume 42, John A Crowther, ELISA: Theory And Practice, Humana Press, Springer, New York, USA IDEXX Laboratories, Inc., 2007, ELISA Technical Guide http://en.wikipedia.org http://www.docjax.com http://www.ncbi.nlm.ni.gov 16 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... điểm qua phần 4.3 Các biến thể kỹ thuật bổ trợ khác cho ELISA: Trong phần đề cập đến số kỹ thuật bổ trợ khác phương pháp kể ELISA Các kỹ thuật không thiết cố định cho loại ELISA mà kết hợp tự... trường… 4.2 Các kỹ thuật brigde ELISA gián tiếp: Kỹ thuật brigde hiểu đơn giản kỹ thuật liên kết yếu tố cần chẩn đốn yếu tố phát mang enzyme thơng qua nhiều lớp yếu tố phát trung gian Các kỹ thuật. .. thể biến thể ELISA nhằm lựa chọn sử dụng kỹ thuật cách phù hợp cho hồn cảnh Đó mục đích viết Tổng quan: Enzyme-linked immunosorbent assay, hay gọi ELISA, enzyme immunoassay hay EIA kỹ thuật chẩn