Chuẩn đoán phân biệt các tybe virus PMWS

Trường đại học nông lâm tp.HCM Bộ môn CNSH Tiểu luận: SV: Vũ Thị Nguyệt MSSV: 06126097 Lớp: DH06SH 0    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com MỤC LỤC I Đặt vấn đề II Tổng quan tài liệu Định nghĩa bệnh PMWS Tác nhân gây bệnh Nguyên nhân lây nhiễm Phương pháp PCR a Định nghĩa b Thiết kế primer cho phản ứng PCR c Thành phần phản ứng d Quy trình e Đọc kết III Vật liệu phương pháp IV Kết luận V Tài liệu tham khảo 1    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com NỘI DUNG I Đặt vấn đề Hội chứng còi cọc heo cai sữa phát năm 1991 Cananda, đàn heo số heo cai sữa có biểu cịi cọc hiệu điều trị Bệnh gây thiệt hại nhiều cho ngành chăn nuôi bắc Mỹ, nhiều nước châu Âu số nước châu Á Tại Việt Nam, nghiên cứu Lâm Thị Thu Hương công tác viên (2004), thực trang trại chăn nuôi heo Thành phố HCM tỉnh phụ cận cho thấy: khảo sát 25 mẫu hạch heo còi cọc sau cai sữa để xét nghiệm, tỷ lệ dương tính với virus chiếm 36% (9 mẫu) Điều làm cần phải quan tâm đặc biệt đến bệnh Mặc dù bệnh diễn biến chậm tăng dần lên với mức độ nguy hại cao Sau đàn heo nhiễm bệnh tỷ lệ chết có lên đến 90 % Đây bệnh truyền nhiễm virus gây Virus PMWS DNA virus chuỗi đơn, thuộc họ Circoviridae, thường gọi là porcine circovirus (PCV) Khi nghiên cứu Circovirus, người ta nhận thấy có đến loại PCV: PCV1 PCV2 Do PCV1 PCV2 heo chúng có tương đồng định gen nên dịch tễ học phân tử cần phải phân biệt chúng với để có đánh giá xác tình hình dịch tễ PMWS Trong đề cập đến việc sử dụng kĩ thuật PCR việc sử dụng cặp mồi đặc hiệu tương ứng vùng gen bảo tồn PCV1, PCV2 Kỹ thuật cho phép lúc phân biệt PCV1 PCV2 II Tổng quan tài liệu Định nghĩa bệnh PMWS Bệnh xảy heo cai sữa, heo từ 6- 14 tuần tuổi, đơi xảy heo tuần tuổi Sau thời gian cai sữa heo bị èo uột, thở khó, tiêu chảy, gầy cịm, ni khơng lớn, da có màu trắng đơi vàng nhạt Tử số trung bình từ 4% đến 10%, xảy dạng cấp tính số heo chết lên đến 38% Ở dạng mãn tính xảy heo tơ vỗ béo, tử số heo khơng tăng trọng đạt trọng lượng khoảng 30 kg, heo bình thường đạt 100kg Người ta gọi hội chứng còi cọc heo sau cai sữa (PMWS) 2    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình ảnh heo bị mắc hội chứng PMWS Tác nhân gây bệnh • • • • • Circovirus thuộc họ virus có DNA mạch vịng, khơng có vỏ bao chứa gen vòng đơn Là loại virus nhỏ biết đến có khả sống sót cao mơi trường Gồm có type tìm thấy heo, bao gồm type (PVC1) type (PVC2) Qua nghiên cứu gen loại virus khác mặt di truyền với nhiễm sắc thể tương đồng khoảng 68-76% PCV có cấu trúc gen đơn giản, gồm hai khung mở đọc, rep cap, nhìn thấy hình Gen cap nằm sợi ngược PCV mã hóa protein cấu trúc vi rút gen rep đạo tổng hợp protein Rep 3    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com a Circovirus type (PVC-1): Porcine circovirus loại (PCV1) chứa khung đọc mở mã hóa protein q trình phiên mã, Rep Cap vị trí cắt vị trí hình vẽ 4    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com • Năm 1974, nhà khoa học phân lập Circovirus type từ tế bào thận heo Hiện nay, chúng không gây bệnh cho heo b •Circovirus type (PVC-2): • Được ghi nhận vào 1991 Tây Canada, phát vết thương heo • Bao gồm nhiều chủng khác (kiểu sinh học kiểu gen Kháng thể PVC-2 phát huyết heo ni Bỉ năm 1985 • Từ kinh nghiệm nghiên cứu ban đầu cho thấy, gây nhiễm virus type lên heo, heo biểu tổn thương đặc trưng bệnh Tuy nhiên, loại virus khác Parvovirus heo (PPV) hay PRRSV tiêm vào lúc heo mang biểu tương tự Những nguyên nhân gây bệnh thường nhiễm PCV type hay vài loại virus khác tất heo bị nhiễm PCV PPRS khơng có biểu bệnh lý PMWS Những nghiên cứu huyết Châu Âu Bắc Mỹ cho thấy, lây nhiễm lan rộng đàn heo phần nhỏ đàn có huyết dương tính biểu bệnh lý Điều hầu hết ca lây nhiễm có biểu ngầm với bệnh Heo bị nhiễm trước cai sữa c Sự nhân rộng Circovirus • Virus xâm nhập vào tế bào chủ • Bám phát hành gen ssDNA virus vào hạt nhân • Các ssDNA chuyển thành dsDNA • mRND virus phiên mã dịch mã để sản xuất protein virus • Nhân rộng Rep sản xuất vịng trịn ssDNA • Sự tổng hợp vịng trịn ssDNA có thể: Được chuyển đổi sang dsDNA làm khuôn mẫu để nhân đôi Nguyên nhân lây nhiễm • Nhiễm từ tinh dịch heo bệnh, phân, phương tiện, vật dụng (quần áo, xe đẩy,…) hay từ lồi khác (Chuột, Chim,…) • Tiếp xúc heo bệnh với heo khỏe mạnh • Do Stress (trong q trình vận chuyển, thay đổi mơi trường, thay đổi chuồng trại,… 5    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com • Do nhập nhiều heo với độ tuổi khác chăn nuôi với mật độ dày đặc • Do thú sản xuất liên tục • Khi heo mẹ bị nhiễm virus PCV2, chúng truyền sang heo gây hội chứng còi sau cai sữa(PMWS) Bên cạnh hội chứng PMWS, heo mắc thêm số bệnh khác nhiễm trung đường hô hấp (PRRV) Phương pháp PCR a Định nghĩa PCR chữ viết tắt cụm từ Polymerase Chain Reaction, dịch vài sách Phản ứng chuỗi trùng hợpcũng có sách gọi "phản ứng khuếch đại gen" PCR kỹ thuật phổ biến sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo 6    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com nhiều sao) đoạn DNA mà không cần sử dụng sinh vật sống E coli hay nấm men PCR sử dụng nghiên cứu sinh học y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, phát bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, xác định huyết thống b Thiết kế primer cho phản ứng PCR Đoạn DNA cần khuếch đại xác định primer chọn lọc Primer đoạn ngắn, sợi DNA nhân tạo – khơng q 50 (thường 18-25) nucleotides (vì DNA thường sợi đơi, chiều dài xác định số lượng cặp base (bp); chiều dài sợi đơn DNA đo base hay nucleotides) phù hợp cách xác điểm bắt đầu kết thúc DNA cần khuếch đại Nó gắn chặt với DNA mẫu điểm khởi đầu kết thúc, nơi mà DNA-polymerase nối bắt đầu trình tổng hợp sợi DNA Sự lựa chọn chiều dài primer nhiệt độ biến tính nó, nhiệt độ biến tính primer định nghĩa nhiệt độ lúc mồi bám vào DNA mẫu nhiệt độ lúc primer tách khỏi DNA mẫu Nhiệt độ biến tính tỉ lệ thuận với chiều dài primer Primer ngắn bám nhiều vị trí DNA mẫu dài cho kết không rõ ràng Mặt khác chiều dài DNA bị giới hạn nhiệt độ cần biến tính Nhiệt độ biến tính cao, ví dụ 80°C gây nhiều vấn đề DNA-polymerase hoạt động nhiệt độ Chiều dài tốt primer từ 20-40 nucleotide với nhiệt độ biến tính khoảng từ 60 – 75°C Hàm lượng GC nên primer khoảng 40-60% c Thành phần phản ứng Enzyme DNA polymerase Buffers Nồng độ dNTP Nhiệt độ primer Một số chất khác d Quy trình Quy trình PCR gồm 20 đến 30 chu kỳ Mỗi chu kỳ gồm bước (Hình 2) 7    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com • Nhiệt độ tăng lên 94-96°C để tách hai sợi DNA Bước gọi biến tính, phá vỡ cầu nối hydrogen nối sợi DNA Trước chu kỳ 1, DNA thường biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA mồi phân tách hồn tồn cịn dạng sợi đơn Thời gian: 1-2 phút • Sau sợi DNA tách ra, nhiệt độ hạ thấp xuống để mồi gắn vào sợi DNA đơn Bước gọi gắn mồi Nhiệt độ giai đoạn phụ thuộc vào đoạn mồi thường thấp nhiệt độ biến tính 50°C (45-60°C) Sử dụng sai nhiệt độ giai đoạn dẫn đến việc đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn cách tùy tiện Thời gian: 1-2 phút • Cuối cùng, DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống Nó bắt đầu bám vào hoạt động dọc theo sợi DNA Bước gọi kéo dài Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc DNA-polymerase Thời gian bước phụ thuộc vào DNApolymerase chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại Chu trình PCR dạng sơ đồ (1) Nóng chảy 96°C (2)Gắn mồi 68°C (3)Kéo dài 72°C (P=Polymerase) (4)Chu trình hồn thành Hai sợi DNA kết thành DNA mẫu cho chu trình kế tiếp, gấp đôi lượng DNA cho chu kỳ 8    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com e Đọc kết sản phẩm phản ứng PCR Sau phản ứng PCR, kết kiểm tra cách chạy điện di gel agarose Vạch đặc trưng cho DNA khuếch đại quan sát nhuộm ethidium bromide, hàm lượng DNA khuyeechs đại thấp phát phương pháp Southern Hình bên ví dụ sản phẩm PCR điện di gel agarose III Vật liệu phương pháp Phương pháp PCR nhân khuếch đại trình tự DNA virus gây hội chứng PMWS a Vật liệu: Bộ gen PCV1 nhân cách sử dụng PCR với đoạn mồi có trình tự: 5’-GGCGGCGCCATCTGTAACGGTTT-3’ Và ngược lại: 5’-GATGGCGCCGAAAGACGGGTATC-3’ (Mankertz & ctv, 2000) 9    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bộ gen PCV2 nhân phản ứng PCR cách sử dụng đoạn mồi chuyển tiếp, trình tự đoạn mồi: 5-GTGGAGCTCCTAGATCTCAGGG-3 5-TAGGAGCTCCACACTCCATCAG-3 (Mankertz et al, 2000.) Sự khuếch đại thực với: 0-1mm dNTP 2-5U Taq DNA polymerase(Boehringer) 0-4µM Primer a Phương pháp Các hạch bạch huyết, mô phổi amidan lấy từ heo mắc hội chứng PMWS Được giữ đông lạnh nhiệt độ , trước đem tách chiết DNA DNA tách ra, sau đem nhân khuếch đại gen PCV kĩ thuật PCR Phản ứng thực 35 chu kỳ: Biến tính 30s Bắt cặp Kéo dài chuỗi Sản phẩm PCR sau chuyển vào vector pPCR-Script SK cách sử dụng pPCR-Scrip Amp cloning kit(Stratagene) Việc chuyển gene giải trình tự sợi với trình tự ABI 373 cách sử dung M13 chuyển tiếp đảo ngược mồi mồi đặc hiệu cho circovirus kit giải trình tự ABI Prism Dye(PE Biosystems) 10    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nhân gen PCV Các gen mã hóa ORF1 ORF2 từ loại PCV PCR sau nhân vào vector pcDNA động vật có vú, vector pVL1393 pAcGHLT Các cặp mồi dùng cho khuếch đại PCV:PCV1,ORF1 khuếch đại với primer ORF1.1 chuyển tiếp (5’-CGGGATCCCAGTGAAAATGCCAAGCAAGAAAAG -3’) ngược lại (5’-CGGGATCCCGATGTGATAACAAAAAAGACTCAG -3’) mồi, ORF2 khuếch đại với ORF2.1 chuyển tiếp (5’-CGGGATCCCTTTTTTGTTATCACATCGTAATGG -3’) ngược (5’-CGGGATCCTCTTTCACTTTTATAGGATGACGTG-3’) Đối với khuếch đại gen PCV2, ORF1.2 chuyển tiếp (5’-ATGGATCCAGCAGACACATGCCCAGCAAG -3’) ngược lại (5’-GGGGATCCGAAGTGATAAAAAAGACTCAG-3’) mồi sử dụng để tạo gen ORF1 ORF2 khuếch đại cách sử dụng ORF2.2 chuyển tiếp (5’-CCGGATCCTCCATTAAGGGTTAAGTGGG-3’) ngược lại (5’-CCGGATCCTCAGATATGACGTATCCAAG-3’) Tất mồi bao gồm BamHI định vị đuôi 5’của chúng Sự khuếch đại biến tính , thời gian kéo dài rút ngắn đến 45s 11    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Sản phẩm PCR gen PCV2 clone pPCR-Scrip SK plasmid nói phần plasmid tái tổ hợp sau phân cắt với BamHI Các plasmid tái tổ hợp sau phân cắt BamHI b Đọc kết Đọc kết bảng điện di gel Sự khác biệt PCV1 PCV2 thể là: ORF1.PCV1(ở giếng số 1-4) mang lại đoạn khuếch đại có kích thước nhỏ đoạn khuếch đại ORF2.PCV2 IV Kết luận Có thể sử dụng kĩ thuật PCR để phân biệt type PMWS, chưa cho phép phân biệt PCV2 tư vùng địa lí khác Đó vấn đề khó khăn khía cạnh dịch tễ, việc kiểm sốt lan nhanh PCV2 toàn giới Việc gia trình tự gen phân lập PCV2 cho thất chúng cung thuộc kiểu gen Điều có ý nghĩa quan trọng việc tìm kiếm vaccine nhằm kiểm sốt PMWS Sự khác biệt di truyền phân lập PCV2 lớn việ sản xuất loại vaccine hiệu phong chốn chúng khó khăn Hiện nay, người ta phát triển kĩ thuật PCR-RFLP ,sử dụng cặp mồi đặc hieeujtuwowng ứng vùng gen bảo tồn PCV1, PCV2 enzyme cắt tương ứng với vị trí cắt có PCV2 Kĩ thuật cho phép lúc 12    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com phân biệt PCV1 PCV2 phân biệt nguồn gốc địa lí PCV2 phân lập • • • • • • • • • • • V Tài liệu tham khảo http://www.repbiotech.com/home.php?lg=vn&mod=sach&go=1&ls=Phong Benh&loai=3&id=108 http://www.khoahoc.net/baivo/nguyenthuongchanh/160807-circovirus.htm http://www.aasv.org/shap/issues/v10n6/v10n6p277.html http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S010209352003000500002 Ellis, J., Hassard, L., Clark, E., Harding, J., Allan, G., Willson, P., Strokappe, J., Martin, K., McNeilly, F., Meehan, B., Todd, D & Haines, D (1998) Isolation of circovirus from lesions of pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome Canadian Veterinary Journal Nguyễn Ngọc Hải(2007) Công nghệ sinh học thú y http://vi.wikipedia.org/wiki/PCR http://thuvienkhoahoc.com/tusach/S%C3%A1ch:C%E1%BA%A9m_nang_ SHPT/Ch%C6%B0%C6%A1ng_18._K%E1%BB%B9_thu%E1%BA%ADt _PCR_c%C4%83n_b%E1%BA%A3n 13    LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... lên đến 90 % Đây bệnh truyền nhiễm virus gây Virus PMWS DNA virus chuỗi đơn, thuộc họ Circoviridae, thường gọi là porcine circovirus (PCV) Khi nghiên cứu Circovirus, người ta nhận thấy có đến loại... nhân rộng Circovirus • Virus xâm nhập vào tế bào chủ • Bám phát hành gen ssDNA virus vào hạt nhân • Các ssDNA chuyển thành dsDNA • mRND virus phiên mã dịch mã để sản xuất protein virus • Nhân rộng... thuật PCR để phân biệt type PMWS, chưa cho phép phân biệt PCV2 tư vùng địa lí khác Đó vấn đề khó khăn khía cạnh dịch tễ, việc kiểm sốt lan nhanh PCV2 tồn giới Việc gia trình tự gen phân lập PCV2