CHẨN đoán VIRUS dại ( RABIES VIRUS)

Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM Bộ môn công nghệ sinh học Lớp DH06SH Bài tiểu luận CHẨN ĐOÁN VIRUS DẠI ( RABIES VIRUS) GVHD T.S NGUYỄN NGỌC HẢI SV Trương Thị Huyền Trang – MSSV 06126159   LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com I Đặt vấn đề Bệnh dại bệnh virus dại (rabies virus) gây lên Đây bệnh nhiễm virus cấp tính hệ thần kinh trung ương dẫn đến tử vong chắn Bệnh dại bệnh truyền nhiễm ghi nhận từ thời cổ xưa, mô tả từ cách 3000 năm bệnh truyền nhiễm đáng sợ Bệnh dại gặp tất động vật có vú xảy động vật có vú Bệnh lây truyền chủ yếu chất tiết bị nhiễm, thường vết cắn, vết liếm động vật mắc bệnh dại vào vết thương hở Khi virus vào thể, theo dây thần kinh đến não trung ương, chó, mèo, chồn bị nhiễm virus có biểu khác sợ sệt, hăng, chảy nước mũi nước dãi nhiều, nuốt vào khó khăn, choáng lên thú hoang dại mắc bệnh dại thường có biểu khác thường chúng thường thấy vào ban đêm ban ngày chúng lang thang Có dạng bệnh dại • • Bệnh dại từ động vật ni chó mèo: giới có khoảng 35.00050.000 ca bệnh dại người, chủ yếu nước phát triển, phần lớn chó dại cắn Bệnh dại tự nhiên : Là bệnh động vật hoang dại truyền Các nước Âu Mỹ có chương trình kiểm sốt bệnh dại động vật ni hiệu nên gặp bệnh dại cho cắn Lồi dơi nguy hiểm chúng mang virus dại biểu hồn tồn khỏe mạnh, tiết virus dại vào nước bọt truyền đến động vật khác người Bệnh dại loài dơi có thê gây trận dịch động vật vùng trái đất   LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Theo thống kê thành phố HCM : tỉ lệ tử vong chó dại cắn 98,2% mèo dại cắn 1,8% Lồi gặm nhấm thỏ khơng truyền bệnh dại Tỉ lệ mắc bệnh tăng cao vào mùa nắng Tóm lại bệnh vô nguy hiểm phát triển thành dịch II Rabies virus Thuộc giống lyssavirus, họ Rhabdoviridae Rabies virus có vật chất di truyền RNA Quan sát kính hiển vi điện tử có hình viên đạn dễ phân biệt với virus họ Có kích thước xấp xỉ 180 x 75nm Gồm hai cấu phần lõi virus (virus core) có cấu trúc ribonucleoprotein xoắn (RNP) lớp vỏ bao (virus envelop) Các phần cấu tạo virus •Lõi virus(ribonucleoprotein) •Chất protein •Lớp áo ngồi(envolop) •Các gai glycoprotein Phản ứng với tác nhân lý hóa Virus dại bền vững nhạy cảm với yếu tố ngoại cảnh :bị tiêu diệt nhanh chóng tia cực tím ánh sáng mặt trời, xà phịng đặc 20%, sức nóng (500C /1h),bởi dung mơi lipid,bởi trypsin,chất tẩy, chất oxy hóa pH cao thấp Virus dại sống hàng tuần lưu trữ 40C, bất hoạt CO2 Trong mô não, virus dại tồn vài tháng 400C hàng năm 700C   LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Cấu tạo virus dại Sơ đồ cắt ngang virus Bộ gene virus (khoảng 12kb) mang leader-sequence (trình tự để trắng hay trình tự; trình tự mở đầu) có kích thước khoảng 50 nucleotide gene mã hóa cho loại protein N, P, M, G L với kích thước tương ứng   LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com III Cách gây bệnh rabies virus Sau xâm nhập mô, virus nhân lên chỗ, đặt biệt Sau thời gian virus bắt đầu phát tán, chúng đến tế bào dây chằng tận thần kinh Virus nhân lên tế bào hạch thần kinh, dây thần kinh, tùng thần kinh Ngoài mô thần kinh, virus nhân lên biểu mô tuyến nước bọt, giác mô, da, dịch tiết nước bọt lưỡi… Như sau thực xâm lấn ly tâm từ hệ thần kinh, virus xâm nhiễm tất quan mơ.  Q trình công vào não nhanh hay chậm tùy thuộc vào vị trí xâm nhập virus, gần não thời gian công đến não nhanh Sự xâm nhiễm từ thú qua thú tương tự từ thú qua người Virus nhân lên bào tương, virion nẩy chồi từ màng bào tương tế bào ký sinh chủ Virus dại công vào thụ thể acethylcholin bề mặt tế bào qua gai glycoprotein Men polymerase RNA virion chép gen sợi đơn RNA thành loại RNA thông tin (mRNA) Bộ gen RNA nằm ribonucleoprotein (RNP), protein N bao quanh chứa gen chép Các mRNA mã hóa cho protein virion :nucleocapsit (N), protein men polymerase (L,P), chất đệm (M) glycoprotein (G) RNP gen làm khuôn mẫu cho RNA sợi bổ sung, tạo RNA cháu có cực tính âm Các protein virus đóng vai trị polymerase cho virus nhân lên vào chép Sự dịch mã cần thiết cho virus nhân lên, đặc biệt cho protein N P, RNA nhân lên kết hợp với men transcriptase nucleprotein virus để tạo lõi RNP bào tương.Các hạt virus có màng bao bọc lúc nẩy chồi qua màng bào tương Protein đệm virus tạo lớp mặt tạo gai virus   LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Sơ đồ cách gây bệnh Rabies virus IV Các phương pháp chẩn đoán IV.1 Phương pháp mơ bệnh học (histopathology) Một phương pháp nhanh chóng đơn giản để chẩn đoán rabies dùng loại thuốc nhuộm thích hợp phát thể Negri Kĩ thuật mơ bệnh học làm điều này, nhiên ngày hầu hết phịng thí nghiệm sử dụng phương pháp fluorescent antibody( FA), kĩ thuật Goldwasser Kissling lần năm 1958 Thuốc nhuộm huỳnh quang xuyên qua màng tế bào vào nhân nhuộm màu thể Negri   LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Thể Negri biểu bệnh lý đặc thù virus dại   Thể Negri tế bào thần kinh nhiễm virus (mũi tên chỉ) Tuy vậy, phát khoảng 70% trường hợp nhiễm virus IV.2 phương pháp Taqman PCR   LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Nguyên tắc phương pháp dựa phản ứng PCR có bổ sung tác nhân dị Taqman Phát mục tiêu thông qua cường độ phát huỳnh quang Taqman Các bước tiến hành: 2.1 Ly trích RNA tạo cDNA Ly trích RNA TRIzol, TRIzol LS với 1μl Glycoblue Reverse transcription toàn RNA thành cDNA 0.5 μl random primer cho 1μl RNA 2.2 Thiết kế mồi Taqman Đọan mồi thiết kế đặc hiệu cho vật chất di truyền virus Taqman thiết kế có mạch đơn ngắn (vài nucleotide) có trình tự bắt cặp với cDNA virus Taqman gắn huỳnh quang đầu 5’có hoạt tính, đầu 3’ gắn huỳnh quang khơng hoạt tính Huỳnh quang đầu 3’ ức chế phát huỳnh quang đầu 5’ mạch Một mạch Taqman bị enzyme polymerase phá hủy (khi phản ứng PCR xảy ra) giải phóng huỳnh quang đầu 5’ cường độ huỳnh quang dung dịch phản ứng tăng lên đo máy đo cường độ huỳnh quang Do cường độ huỳnh quang dung dịch tăng lên đồng nghĩa với phản ứng PCR xảy nghĩa có virus rabies 2.3 Tiến hành phản ứng   LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Sản phẩm PCR đem đo cường độ huỳnh quang, thơng qua xác định diện virus Phương pháp phát đựợc khoảng 95% trường hợp nhiễm virus IV.3 Phương pháp chẩn đoán huyết học: Kháng thể virus dại xuất chậm sau thể bị nhiễm thường phát bắt đầu có biểu lâm sàng Bản chất phương pháp phản ứng ELISA (phản ứng kháng nguyên kháng thể) Virus dại có type kháng nguyên Tuy nhiên, dịng virus phân lập từ lồi khác vùng địa lý khác có epitop nucleoprotein glycoprotein khác Dùng kháng thể đơn dịng trình tự nucleotide đặc hiệu để xác định epitop khác Ở Mỹ, tìm thấy biến thể kháng nguyên động vật sống cạn biến thể khác lồi dơi.Vị trí amino acid 333 glycoprotein mang tính độc đóng vai trò quan trọng sinh bệnh học bệnh dại gây hòa màng tế bào nhiễm virus Các gai virus chứa glycoprotein, tạo kháng thể trung hòa động vật Kháng huyết kháng nucleocapsit giúp chẩn đoán bệnh dại phản ứng ELISA Kháng thể kháng huyết   LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com nhuôm huỳnh quang cố định giá thể Sau cho huyết mẫu cần chẩn đốn vào để phản ứng ELISA xảy ra, rửa dung dịch phản ứng loại bỏ phần không bắt cặp soi kính hiển vi huỳnh quang phát mục tiêu thơng qua phát huỳnh quang Chẩn đốn huyết học cho có hiệu chẩn đoán bệnh dại Phương pháp phát gần 100% trường hợp nhiễm virus V.So sánh phương pháp Trong phương pháp trình bày phương pháp chẩn đoán huyết học phương pháp có hiệu phát gần 100% trường hợp nhiễm virus Tuy nhiên phương pháp có ưu nhược điểm riêng nên tùy trường hợp ta áp dụng cho phù hợp phương pháp VI Kết luận   10 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bệnh dại bệnh nguy hiểm bệnh truyền nhiễm có tốc độ lây lan cao gây tử vong chắn khơng phát kịp thời cần có biện pháp phịng bệnh, chẩn đốn bệnh điều trị cách kịp thời có hiệu VII Tài liệu tham khảo www.techmicrobio.net http://www.bing.com/search?q=detect+rabie&go=&form=QBRE3 www.beforethebite.typepad.com http://www.cdc.gov   11 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ...I Đặt vấn đề Bệnh dại bệnh virus dại (rabies virus) gây lên Đây bệnh nhiễm virus cấp tính hệ thần kinh trung ương dẫn đến tử vong chắn Bệnh dại bệnh truyền nhiễm ghi nhận từ thời... ribonucleoprotein xoắn (RNP) lớp vỏ bao (virus envelop) Các phần cấu tạo virus •Lõi virus( ribonucleoprotein) •Chất protein •Lớp áo ngồi(envolop) •Các gai glycoprotein Phản ứng với tác nhân lý hóa Virus dại bền... sốt bệnh dại động vật ni hiệu nên gặp bệnh dại cho cắn Loài dơi nguy hiểm chúng mang virus dại biểu hoàn toàn khỏe mạnh, tiết virus dại vào nước bọt truyền đến động vật khác người Bệnh dại lồi