Công nghệ tổng hợp lysine

Mục lục Danh mục hình iv Danh mục bảng vi Danh mục đồ thị .viii CHƯƠNG I : TỔNG QUAN 1 1.Giới thiệu lysine 1.1.1 Khái niệm 1.1.2 Cấu tạo 1.1.3 Vai trò ứng dụng 1.1.4 Các dạng tồn lysine 1.2 Các phương pháp thu nhận lysine 1.2.1 Phương pháp thủy phân 1.2.2 Phương pháp tổng hợp hóa học 1.2.3 Phương pháp lên men 1.2.4 Phương pháp kết hợp 1.3 Cơ chế sản xuất L-lysine từ tế bào vi sinh vật 11 1.3.1 Sơ đồ chuyển hóa 11 1.3.2 Thuyết minh giai đoạn chuyển hóa 13 1.5 Tổng hợp lysine từ Corynebacterium glutamicum 19 1.5.1 Đặc điểm hình thái Corynebacterium glutamicum 19 1.5.2 Bộ gen Corynebacterium glutamicum 20 1.5.3 Lịch sử sử dụng Corynebacteria glutamicum 24 1.5.4 Sản xuất lysine theo quy mô công nghiệp 24 1.6 Cải tạo giống Corynebacterium glutamicum 25 1.6.1 Khái niệm 25 1.6.2 Một số phương pháp dùng để cải tạo giống Corynebacterium glutamicum 26 1.6.3 Các plasmid nội sinh Corynebacteria glutamicum sử dụng việc thiết kế vector: 28 1.6.4 Việc biểu gen Corynebacterium glutamicum 30 1.6.5 Phương pháp cải tạo giống Corynebacterium glutamicum để thu dư lysine từ aspertate 30 1.7 Cố định tế bào vi sinh vật 37 1.7.1 Định nghĩa cố định tế bào 37 1.7.2 Phương pháp cố định tế bào 38 1.7.3 Chất mang cố định tế bào vi sinh vật: 38 ii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 1.7.4 Chỉ tiêu đánh giá hiệu cố định tế bào 39 1.8 Công nghệ lên men L-Lysine 39 1.8.1 Các vi khuẩn lên men L-lysine 39 1.8.2 Môi trường lên men 40 1.8.3 Các phương pháp lên men 44 1.8.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men 46 1.8.5 Qui trình lên men 48 1.8.6 Thu nhận tinh sản phẩm 55 1.8.7 Phân tích chất lượng số lượng L-lysine 57 CHƯƠNG 2: CÁC HƯỚNG NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN 58 2.1 Nghiên cứu đối tượng sản xuất lysine 58 2.1.1 Sử dụng dịch cỏ gradient sản xuất lysine 58 2.1.2 Đặc điểm đường tổng hợp sinh học lysine Obligate Methylotroph Methylophilus methylotrophus 58 2.1.3 Các nghiên cứu đối tượng sản xuất lysine Corynebacterium glutamicum 59 2.2 Công nghệ lên men L-lysine 78 2.2.1 Nghiên cứu công nghệ sản xuất acid amin L-lysine 78 2.2.2 Khảo sát trình lên men Corynebacterium glutamicum tự chế phẩm cố định để ứng dụng thu nhận L-lysine 85 2.2.3 Nghiên cứu trình lên men thu nhận L-lysine chế độ lên men khác 88 2.2.4 Nghiên cứu trình lên men liên tục L-lysine 90 2.2.5 Nghiên cứu tổng hợp lysine tế bào cố định 96 CHƯƠNG 3: KẾT LUẬN 100 Tài liệu tham khảo 101 iii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Danh mục hình Hình 1 Hai dạng đồng phân quang học lysine Hình Cấu trúc khơng gian L-lysine Hình Nhu cầu lysine, threonine methionine thức ăn heo thành phần amino acid chứa sẵn thưc vật Hình Sản xuất lysine lên men (tấn/năm) suốt thập kỉ qua Hình L-lysine sulphate Hình L-lysine HCl Hình Sản phẩm thương mại L-lysine với B6 Hình Sản phẩm thương Hình Sản phẩm thương Hình 10 Sản phẩm thương mại Hình 11 Sản phẩm thương mại Lysine-1000 90ct Hình 12 Sản phẩm thương mại Lysine Powder Hình 13 Sơ đồ tổng qt chuyển hóa tứ glucose lysine amino acid khác Hình 14 Con đường tổng hợp lysine từ glucose 13 Hình 15 Sự chuyển hóa tạo thành Oxaloacetate Malate 14 Hình 16 Con đường tổng hợp lysine 16 Hình 17 Sơ đồ diều hịa dị lập thể 18 Hình 18 Corynebacterium glutamicum 20 Hình 19 Hệ gen Corynebacterium glutamicum 23 Hình 20 Bản đồ cắt giới hạn plasmid pHM1519 pBL1 Corynebacterium glutamicum 29 Hình 21 Con đường tổng hợp phân nhánh L-lysine giống Corynebacteria glutamicum hoang dại 32 Hình 22 Cấu trúc Aspartate kinase 33 Hình 23 Trình tự DNA vùng promoter dapA 36 Hình 24 Sơ đồ phương pháp cố định tế bào 38 Hình 25 Mơ hình sản xuất amino acid 50 iv LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Hình 26 Mơ hình lên men thu L-lysine 51 Hình Cô lập gen ddh C glutamicum cấu trúc plasmid tổ hợp C glutamicum - E.coli 68 Hình 2 Nhuộm họat tính DDH sau polyacrylamide gel Electrophoresis 69 Hình Sơ đồ vật lý, phân tích đánh dấu trình tự DNA 70 v LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Danh mục bảng Bảng 1 So sánh phương pháp thu nhận lysine Bảng Đặc điểm hình thái C glutamicum 19 Bảng Thống kê lượng amino acid sản xuất 24 Bảng Các plasmid nội sinh Corynebacterium sử dụng việc thiết kế vector 28 Bảng Ảnh hưởng số lượng dapA khác tốc độ tăng trưởng, tiết L-lysine 35 Bảng Các chủng vi khuẩn sản xuất acid L-glutamic hoang dại theo báo cáo chủng bố mẹ để sản xuất amino acid gen chủ cho nhân dòng 60 Bảng 2 Kết thu từ sáu chủng đột biến điều kiện lên men thu 61 Bảng Hiệu gen ddh C glutamicum 70 Bảng Cách sử dụng codon gen ddh 71 Bảng Giống C glutamicum dùng nghiên cứu 73 Bảng Vị trí chuỗi primer đặc biệt sử dụng phổ biến để thay G glutamicum phương pháp PCR chuỗi DNA sau 73 Bảng Sản lượng đặc trưng sản xuất lysine 75 Bảng Sinh khối chất chuyển hóa C glutamicum ATCC 13032 lysCfbr 77 Bảng Nhu cầu đồng hóa C glutamicum ATCC 13032 lysCfbr PEFTUfbp 78 Bảng 10 Khả lên men chủng CM24 loại môi trường 79 Bảng 11 Ảnh hưởng pH lên sản lượng L-lysine qui mơ 50 lít 80 Bảng 12 Ảnh hưởng oxy hịa tan lên sản lượng L-lysine qui mơ 50 lít 81 Bảng 13 Ảnh hưởng oxy hịa tan lên sản lượng L-lysine qui mơ 150 lít 82 Bảng 14 Ảnh hưởng oxy hòa tan lên sản lượng L-lysine qui mơ 1500 lít 83 Bảng 15 Hiệu suất thu hồi L-lysine 83 Bảng 16 Tỷ lệ rửa trôi tế bào sau tái sử dụng lên men chế phẩm tế bào cố định (%) 87 vi LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Bảng 17 Sản lượng L-lysine thu phương pháp lên men khác 89 Bảng 18 Ảnh hưởng hàm lượng đường giới hạn lên suất sản lượng Llysine 89 Bảng 19 Năng suất sản lượng L-Lysine lên men repeat fed batch liên tục 89 Bảng 20 Ảnh hưởng nồng độ CaCl2 lên sinh khối nồng độ L-Lysine 97 Bảng 21 Ảnh hưởng lượng tế bào ban đầu thời gian lên men lên tổng hợp 97 vii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Danh mục đồ thị Đồ thị So sánh sản lượng L-lysine tạo C glutamicum từ sáu chủng đột biến môi trường lên men theo phương pháp Fed-batch 62 Đồ thị 2 Hoạt động invivo fructose 1,6-biphosphatase chủng C glutamicum khác 75 Đồ thị Ảnh hưởng thời gian lên men lên sinh khối sản lượng L-lysine qui mơ 50 lít 79 Đồ thị Ảnh hưởng nhiệt độ lên sản lượng L-lysine qui mô 50 lít 80 Đồ thị Ảnh hưởng thời gian lên men lên sinh khối sản lượng L-lysine qui mơ 150 lít 81 Đồ thị Ảnh hưởng thời gian lên men lên sinh khối sản lượng 82 Đồ thị Sản lượng L-lysine lần tái sử dụng lên men chế phẩm 87 Đồ thị Thời gian nuôi cấy liên tục 91 Đồ thị Ảnh hưởng tỉ lệ pha lỗng lên thơng số trạng thái ổn định 92 Đồ thị 10 Ảnh hưởng tỉ lệ đường bổ sung lên suất 93 Đồ thị 11 Ảnh hưởng khuấy đảo lên thông số trạng thái ổn định 94 Đồ thị 12 Ảnh hưởng khí giàu oxy lên thông số trạng thái ổn định 95 Đồ thị 13 Ảnh hưởng lượng tế bào ban đầu lên tổng hợp L-lysine tế bào C.glutamicum cố định 98 viii LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu CHƯƠNG I : TỔNG QUAN 1.Giới thiệu lysine: 1.1.1 Khái niệm: Lysine α-amino acid thiết yếu người tổng hợp Lysine chứa hai nhóm (-NH2) nhóm (-COOH) Trong cấu tạo phân tử lysine có carbon bất đối xứng nên chúng có hai dạng đồng phân quang học: D-lysine L-lysine Hai đồng phân quang học có tính chất hóa lý giống nhau, khác khả làm quay mặt phẳng phân cực ánh sáng, sang phải sang trái làm tính chất sinh học chúng hoàn toàn khác thể sinh vật sống hấp thu lysine dạng L Lysine tồn dạng rắn tinh thể điều kiện bình thường, bị phân hủy nhiệt độ 200-300°C, có màu tím xanh tương tác với ninhydrin [38] Lysine amino acid không thay tổng số 20 amino acid, tìm thấy cấu trúc phân tử protein tự nhiên tất sinh vật sống tổng hợp từ vi sinh vật Lysine thuộc họ aspartate, tổng hợp qua đường phân nhánh Lysine acid amin cần thiết cho hoạt động sống người động vật Nhu cầu lysine giới năm 2006 950,000-1000,000 1.1.2 Cấu tạo: Công thức phân tử: C6H14N2O2, khối lượng phân tử 146,188 g/mol, điểm đẳng điện pH = 9.59, Codon lysine AAA AAG [38] Công thức cấu tạo: NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH(NH2)-COOH LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu L-Llysine D-lysine Hình 1 Hai dạng đồng phân quang học lysine [38] Hình Cấu trúc khơng gian L-lysine [38] Tên gọi: Lysine cịn có tên gọi khác axit α-e-diaminocaproic 2,6diaminohexanoic acid 1.1.3 Vai trò ứng dụng: Lysine giữ vai trò sống tổng hợp protein, chìa khóa sản xuất enzyme, hoocmon kháng thể giúp thể tăng cường sức đề kháng, chống bệnh tật đặc biệt ngăn cản phát triển vi khuẩn gây bệnh mụn gộp môi hay mụn gộp sinh dục Cơ thể người động vật thiếu lysine thể không hoạt động bình thường, đặc biệt động vật cịn non trẻ em xảy tượng chậm lớn, trí tuệ phát triển Chính lysine thường đưa vào phần ăn trẻ gia súc L-lysine amino acid cần thiết đòi hỏi phải ln có sẵn thức ăn để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng động vật, đặc biệt thức ăn từ ngũ cốc, lúa mì lúa mạch nghèo lysine Do bổ sung nguồn giàu lysine vào LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu cần thiết để tăng hiệu thức ăn Ta bổ sung bột đậu nành (chứa nhiều lysine) thêm trực tiếp lysine vào thức ăn Ưu điểm việc bổ sung trực tiếp lysine amino acid không thay khác không thêm vào nên thành phần chúng thể khơng bị thay đổi Ví dụ thêm 0.5% lysine tăng chất lượng đạm thức ăn hiệu bổ sung 20% đậu nành Từ đó, nitơ amino acid khơng giới hạn thêm vào thừa chế độ ăn có hàm lượng đạm cao bị chuyển hóa thành amoni động vật tiết ngoài, với việc bổ sung lysine làm giảm lượng đạm bổ sung từ làm giảm nhiễm mơi trường từ phân Hình Nhu cầu lysine, threonine methionine thức ăn heo thành phần amino acid chứa sẵn thưc vật [34] Trong năm 2000, việc sản xuất L-lysine khắp nơi giới sử dụng nguồn chất bổ sung vào thức ăn đạt sấp xỉ 550.000 thị trường cho thấy tăng trưởng tiềm từ 7-10% năm [34] Vì có L-lysine có hiệu nguồn chất bổ sung tất quy trình sản xuất sử dụng phương pháp lên men quen thuộc LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan Bảng 19 Năng suất sản lượng L-lysine lên men repeat fed batch liên tục [25] Phương pháp lên men Năng suất L-lysine (g/l.h) Sản lượng L-lysine (%) Repeat fed batch 3,9 41 Liên tục 3,5 35 Các kết cho thấy: So với trình lên men batch, trình lên men fed batch mức 5g/l suất sản lượng cao hẳn Nguyên nhân nồng độ đường cao môi trường làm ức chế phát triển vi sinh vật giảm sản lượng sản phẩm, với tạo thành sản phẩm phụ acetate lactate Bằng cách hạ thấp nồng độ đường ban đầu thấp bổ sung sau đó, tổng thời gian ni cấy, đặc biệt phage lag, rút ngắn sản lượng tăng lên [22] Bên cạnh đó, q trình lên men liên tục thu suất cao, giá thành giảm sản xuất cơng nghiệp So với trình fed batch lên men liên tục, trình repeat fed batch thu suất sản lượng cao hẳn Nguyên nhân fed batch, nồng độ sản phẩm tăng làm tăng áp suất thẩm thấu, tác động xấu lên sinh trưởng, chuyển hóa suất thu L-lysine Bằng kĩ thuật repeat fed batch khắc phục tượng cách rút lượng canh trường định, suất sản lượng cải thiện [25] 2.2.4 Nghiên cứu trình lên men liên tục L-lysine: Năm 1989, Toshihiko Hirao cs khảo sát q trình ni cấy liên tục chủng Corynebacterium gutamicum đột biến Nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát trình lên men liên tục cấp chủng B-6, tạo từ Corynebacterium gutamicum ATCC13032 cách lựa chọn chủng kháng S(2-aminoethyl)-L-cysteine, rifampicin, streptomycin 6-azauracil sau gây đột biến N-nitro-N'-nitro-N-nitrosoguanidine Môi trường lên men ban đầu chứa 3% mật rỉ đường Mơi trường bổ sung có hàm lượng mật rỉ đường thay đổi từ 12% đến 18% Q trình ni cấy thực fermentor 5lít chứa 1.3 lít môi trường ban đầu Khi lượng đường ban đầu tiêu thụ, môi trường bổ sung 90 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan cung cấp với tỉ lệ định Sau thể tích canh trường ni cấy 2.51ít, q trình ni cấy liên tục bắt đầu cách bổ sung liên tục môi trường bổ sung đồng thời lấy canh trường chứa tế bào sản phẩm Thể tích làm việc trì mức 2.5 1ít Q trình ni cấy thực tốc độ khuấy 600 rpm, thổi khí 1ít/ phút 32°C pH chỉnh tự động NH4OH 10 N Các kết thu sau: Đồ thị 2.8 thể thời gian nuôi cấy liên tục chủng B-6 ảnh hưởng tỉ lệ bổ sung đến suất (g/1.h) nồng độ đường bổ sung 20% Mặc dù nuôi cấy liên tục 500h, khơng thực 400 h để tránh tượng giống bị đột biến gây ảnh hưởng đến suất Với việc tăng tỉ lệ bổ sung vượt 90 ml/h, nồng độ L-lysine giảm Mặc khác, suất tăng sinh Năng suất (g/l.h) khối không thay đổi rõ ràng Tỉ lệ bổ sung sung sung Sinh khối Đường sót (%) Tỉ lệ bổ sung Thời gian ni cấy (h) Thời gian nuôi cấy (h) Đồ thị Thời gian nuôi cấy liên tục [16] Ảnh hưởng tỉ lệ pha lỗng đến thơng số trạng thái ổn định khảo sát nhiều nồng độ đường bổ sung khác thể đồ thị 2.8 Với việc tăng tỉ lệ pha loãng, suất tăng thể giá trị lớn nồng độ đường bổ sung Tuy nhiên, hiệu suất L-lysine tính khối lượng đường (%), Yp/s, giảm dần tỉ lệ pha loãng cao Sinh khối giảm mạnh tỉ 91 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan lệ pha lỗng cao Nồng độ L-lysine lớn đạt là105 g/l với Yp/s 38.5%, đạt nồng độ đường bổ sung 28% Năng suất sinh khối lớn tính khối lượng đường (%), Yx/s, 5.6 g/1.h 14.7%, nồng Năng suất (g/l.h) độ đường bổ sung 12% Tỉ lệ pha loãng (h -1) Đồ thị Ảnh hưởng tỉ lệ pha lỗng lên thơng số trạng thái ổn định [16] Nồng độ đường bổ sung: , 12%; , 20%; ,28% Yx/s= hiệu suất sinh khối tính khối lượng đường Yp/s=hiệu suất thu sản phẩm tính khối lượng đường Q trình ni cấy thực tốc độ khuấy 600 rpm, sục khí 3lít/phút Trong đồ thị 2.9, thông số trạng thái ổn định vẽ dựa vào tỉ lệ pha lỗng Tuy nhiên, khó để phân tích tỉ lệ - yếu tố giới hạn ảnh hưởng đến suất trường hợp nồng độ đường khác Do đó, suất vẽ lại dựa theo tỉ lệ đường bổ sung, song song với thông số trạng thái ổn định 92 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan khác, bao gồm ORP lượng L-lactic acid (lactate) tích tụ, dấu hiệu lượng oxy cung cấp Kết thể đồ thị 2.10 Điểm lớn suất trùng khớp với điểm mà lactate bắt đầu tích tụ nồng độ đường bổ sung Bởi tích tụ đường cụ thể không phát điểm, ngoại trừ điểm tỉ lệ đường bổ sung cao nhất, điều tỉ lệ đường bổ sung với tỉ lệ đường tiêu thụ tích tụ lactate chủ yếu thiếu oxy ORP tới hạn thay đổi nằm khoảng từ -100 mV nồng độ đường bổ sung 28% đến -140 mV 12% Những kết cho thấy thiếu oxy ảnh hưởng đến suất Năng suất (g/l.h) tỉ lệ bổ sung đường cao Tỉ lệ đường bổ sung (g/l/h) Đồ thị 10 Ảnh hưởng tỉ lệ đường bổ sung lên suất, oxy hóa ban đầu, lactate sinh [16] Nồng độ đường bổ sung: , 12%; , 20%; ,28% ORP = oxy hóa ban đầu Bên cạnh đó, ảnh hưởng lượng oxy cung cấp giới hạn lên thông số khác nghiên cứu Oxy cung cấp thay đổi tốc độ khuấy từ 450 rpm đến 700 rpm nồng độ đường bổ sung 25% thổi khí lít/phút Trong đồ thị 2.10, suất lớn tăng với việc tăng tốc độ khuấy Mặc 93 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan khác, nồng độ L-lysine Yp/s giảm với việc tăng tỉ lệ pha loãng, tốc Năng suất (g/l.h) độ khuấy thấp hơn, giảm với tỉ lệ pha loãng thấp Tỉ lệ pha loãng (h -1) Đồ thị 11 Ảnh hưởng khuấy đảo lên thông số trạng thái ổn định [16] Tốc độ khuấy: ∆, 450 rpm, 500 rpm; , 600 rpm; , 700 rpm Nhằm xác định yếu tố giới hạn trình sản xuất L-lysine phương pháp liên tục oxy cung cấp hay khơng, khơng khí giàu oxy sử dụng q trình sục khí Việc sử dụng khơng khí chứa 29% oxy so sánh với khơng khí chứa 21% oxy (khơng khí tự nhiên) nồng độ đường bổ sung 25% tốc độ khuấy 500 rpm Kết thể đồ thị 2.11 Việc sử dụng khơng khí giàu oxy, ORP cho thấy giá trị cao tỉ lệ pha loãng suất cải thiện rõ rệt Điều cho thấy việc cung cấp đủ oxy cần thiết để trì suất cao 94 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan Năng suất (g/l.h) Tỉ lệ pha loãng (h -1) Đồ thị 12 Ảnh hưởng khí giàu oxy lên thơng số trạng thái ổn định [16] Hàm lượng oxy khơng khí : , 29%; , 21% Nghiên cứu cho thấy, thực q trình nuôi cấy liên tục cấp ổn định thành công Nghiên cứu thu suất nồng độ L-lysine cao hơn, 5.6 g/l.h 105 g/l Chủng B-6 tích tụ 100 g/1 L-lysine-HCI sau 48 h nuôi cấy fed-batch Tuy nhiên, suất nuôi cấy fed-batch không vượt 2.1 g/1.h (dữ liệu khơng thể hiện) Điều có nghĩa suất nuôi cấy liên tục cao gấp 2.5 lần so với nuôi cấy fed-batch Nuôi cấy liên tục mô tả nghiên cứu tạo điều kiện phân tích yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men liên tục L-lysine Trong ni cấy liên tục, vấn đề quan trọng khơng ổn định giống Trong nghiên cứu này, không ổn định giống B-6 khơng xảy trình lên men L- 95 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan lysine 400 h Điều cho thấy ổn định giống chủ yếu phụ thuộc vào đặc tính vốn có Một lý cho ổn định giống B-6 sản xuất Llysine giải phóng hồn tồn từ điều hịa trao đổi chất L-lysine (dữ liệu hiện) Kết nghiên cứu cho thấy nuôi cấy liên tục không q trình hiệu cho phân tích trạng thái ổn định phịng thí nghiệm, mà cịn trình thực tiễn nhà máy suất cao đơn giản trình nuôi cấy [16] 2.2.5 Nghiên cứu tổng hợp lysine tế bào cố định: Năm 1989, Moncef Nari cs nghiên cứu sản xuất lysine chủng C.glutamicum cố định Giống Corynebacterium sp thử nghiệm sản xuất Lysine nuôi cấy theo mẻ với tế bào tự cố định với lượng vi sinh vật ban đầu 5x107 tế bào /ml, môi trường chứa 200 g/lít glucose Một số kết thu sau: Khi giống nuôi cấy cấy dạng tự do, tích tụ lysine đạt 42 46 g/lít L-lysine sau 72 96h Trái lại, giống nuôi cấy dạng cố định tạo 60g/lít L-lysine sau 120h ni cấy Hiệu suất sản xuất lysine, glucose thêm vào môi trường tiêu thụ hoàn toàn, 23 30% nuôi cấy dạng tự cố định Kết cho thấy trình cố định cải thiện trình sản xuất lysine Số lượng tế bào gel tương ứng với số tế bào tự Nguyên nhân cho sinh trưởng chậm Corynebacterium sp gel alginate hạn chế oxy Đối với tế bào cố định, môi trường nuôi cấy cần bổ sung sung CaC12 để đảm bảo ổn định học hạt gel CaC12 ảnh hưởng đến phát triển Các kết thể bảng 2.15, cho thấy giống tích tụ 45 g/lít lysine khơng có CaC12, mơi trường chứa 140 g/lít glucose, tích tụ giảm nhẹ việc thêm vào CaC12 Trong hầu hết trường hợp, sinh khối cuối môi trường giống Như nồng độ CaC1 nằm khoảng từ 50 đến 200 mM bổ sung vào chế độ cố định mà không ảnh hưởng đến suất phát triển tế bào cố định 96 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan Bảng 20 Ảnh hưởng nồng độ CaCl2 lên sinh khối nồng độ L-lysine [24] CaCl2 Glucose Sinh khối (10 8) L-lysine Hiệu suất (mM) tiêu thụ t=72h HCl(g/l) (%) 133 99 45 33.83 62.5 134 93 43 32.08 125 135 95 43 31.85 187.5 135 97 43 31.85 250 132 60 41 31.06 Lượng vi sinh vật ban đầu ảnh hưởng đến suất tạo L-lysine Các lần nuôi cấy thực với nhiều nồng độ khác từ 10 đến 20.107 tế bào/ml môi trường chứa 200 g/1 glucose Các kết thể đồ thị 2.12 cho thấy, sau 72h nuôi cấy, tổng hợp L-lysine tăng theo lượng vi sinh vật cho vào ban đầu Sau 120h, glucose thêm vào mơi trường tiêu thụ hồn tồn, tổng hợp L-lysine trì khơng đổi tăng lượng tế bào Hiệu suất sản xuất Llysine (khoảng 33%) giống lượng tế bào sống từ 2,5 đến 20x107 tế bào bào/ml (Bảng 2.20 ) Bảng 21 Ảnh hưởng lượng tế bào ban đầu thời gian lên men lên tổng hợp L-lysine tế bào C glutamicum cố định [24] Mật độ tế Glucose L- bào x tiêu thụ lysine suất tiêu thụ lysine suất (g/l) (g/l) (%) (g/l) (g/l) (%) 10 /ml Hiệu Glucose 72h 2.5 20 111 115 148 147 L- Hiệu Glucose L- Hiệu tiêu thụ lysine suất (g/l) (g/l) (%) 96h 17 15.3 138 33 25 21.75 167 43 32.5 21.95 183 49.5 35 23.8 190 49.5 120h 23.3 25.75 27 26 187 38 20.3 200 58.5 29.25 200 60 30 200 59.5 29.75 97 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan Đồ thị 13 Ảnh hưởng lượng tế bào ban đầu lên tổng hợp L-lysine tế bào C.Glutamicum cố định [24] Các kết thể bảng 2.16 đồ thị 2.12 cho thấy tổng hợp L-lysine hiệu suất tăng tăng thời gian nuôi cấy Chẳng hạn như, với mật độ ban đầu 2,5x10 tế bào/ml, khoảng 25 g/lít L-lysine tạo (hiệu suất 21,73%) Sau 96h đạt tới 43 g/lít, sau 120h 58,5 g/lít L-lysine ( hiệu suất 29,25% ) glucose thêm vào môi trường tiêu thụ hoàn toàn.Với tế bào tự do, glucose tiêu thụ hoàn toàn sau 96h, tế bào bòa cố định 120h Hai điều lý giải cho việc tăng thời gian ni cấy là: khuếch tán hạn chế oxy chất dinh dưỡng vào bên hạt gel [29]; gradient tốc độ phát triển (gradient số lượng tế bào sống cố định) gây hạn chế khuếch tán Thật sự, việc cung cấp đầy đủ oxy để thỏa mãn nhu cầu oxy tế bào cần thiết để trình sản xuất L-lysine [14] Sau kéo dài thời gian nuôi cấy hạt gel bền học hình dạng đường kính hạt gel bị biến đổi Sự ổn định hạt gel cải thiện cách tăng nồng độ gel ion canxi [12] Nồng độ ion canxi trì 100 mM, tăng nồng độ alginate làm giảm hàm lượng L-lysine thất thoát tế bào Những kết giải thích nồng độ gel thấp làm giảm tối thiểu giới hạn vận chuyển vật chất tối đa cho tạo thành sinh khối Tốc độ tiêu thụ oxy vi sinh vật cố định giảm tăng nồng độ gel alginate [14] 98 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chương 2: Các hướng nghiên cứu có liên quan Những kết đạt cho thấy L-lysine sản xuất hiệu tế bào Corynebacterium sp cố định Bằng cách so sánh với kết đạt với tế bào tự cho thấy có cải thiện nhỏ tạo thành L-lysine tế bào cố định Những ưu điểm đạt sử dụng phương pháp cố định tế bào là: sử dụng lượng tế bào ban đầu nhỏ (so sánh với tế bào tự do); giảm tạp nhiễm Tế bào cố định phát triển gần bề mặt hạt gel, nơi chúng tạo khuẩn lạc [14,31] Bởi tính chất học hạt gel, cho phép lượng giới hạn phân chia tế bào lỗ trống [26], tế bào Corynebacterium bảo vệ phần khỏi cạnh tranh với tế bào tạp nhiễm rửa trôi tế bào tế bào bẫy không thừa Hơn nữa, phương pháp cho thấy để tăng tính ổn định plasmid cách đáng kể cho khoảng thời gian ni cấy dài [26, 27], tượng biến động thay đổi di truyền, xảy sau q trình ni cấy kéo dài vi khuẩn nuôi cấy liên tục sử dụng tế bào tự tránh thơng việc cố định tế bào Tuy nhiên, giới hạn truyền khối, việc cung cấp oxy chất dinh dưỡng cho tế bào hiếu khí cố định (như Brevibacterium flavum) với tế bào bào hiếu khí khơng bắt buộc (Corynebacterium glutamicum) thường trở thành hạn chế việc sử dụng hiệu suất tế bào Để giải vấn đề này, cần thiết để xác định ảnh hưởng kích thước hạt cung cấp oxy lên tốc độ phản ứng Việc làm hạt nhỏ hơn, làm giảm đến mức thấp hạn chế truyền khối [24] 99 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chương 3:Kết luận CHƯƠNG 3: KẾT LUẬN Trên giới, với tốc độ tăng trưởng thị trường dự báo nhu cầu sử dụng L-lysine tiếp tục tăng, cạnh tranh ngày mạnh mẽ để chia thị trường Sự phát triển giống sản xuất công nghiệp, bao gồm kĩ thuật q trình chuyển hóa, kĩ thuật gen tiếp tục chìa khóa để phát triển cạnh tranh, kĩ thuật đột biến gen phát triển từ đột biến ngẫu nhiên sang đột biến xác định Hiện nay, nghiên cứu cải thiện giống đạt kết mong muốn, tạo giống siêu sản xuất L-lysine Bên cạnh nghiên cứu theo hướng phát triển tối ưu hóa qui trình cơng nghệ tiếp tục thực tác động chặt chẽ việc cải thiện giống kĩ thuật nuôi cấy việc nâng cao quy mô sản xuất Tuy nhiên, Việt Nam chưa có sở sản xuất L-lysine mà phải nhập Llysine từ nước ngòai dạng thuốc uống dạng tồn lysine Đây nói bỏ phí tiếc phát triển Việt Nam đường ứng dụng thành tựu khoa học vào sản xuất Ta mua giống cải tạo để ứng dụng lên men thu nhận lysine tự xây dựng giống Corynebacterium glutamicum siêu tổng hợp lysine từ chủng hoang dại hay cải tạo giống khác sở kiến thức cơng bố tìm hiểu sâu sắc Bên cạnh nghiên cứu nâng cao hiệu thu nhận lysine cần tập trung nghiên cứu hồn thiện quy trình sản xuất L-lysine, để triển khai xây dựng nhà máy sản xuất L-lysine với chất lượng cao, giá thành hạ Mặc dù có nhiều cố gắng việc thực Đề tài thời gian có hạn hiểu biết cịn hạn chế nên nội dung Đồ án số thiếu sót Với ý nghĩa khoa học kinh tế Đề tài hy vọng Đề tài tiếp tục tìm hiểu phân tích sâu Luận Văn Tốt Nghiệp 100 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Tài liệu tham khảo Tài liệu nước Hồ Huỳnh Thùy Dương (2005) Sinh học phân tử Nhà xuất giáo dục Nguyễn Đức Lượng (2006) Công nghệ vi sinh, Tập 2-Vi sinh vật học công nghiệp Nhà xuất Đại học quốc gia TP.Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Lượng cs.( 2006) Thí nghiệm cơng nghệ sinh học tập 2, NXB Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh Nguyễn Đức Lượng (2007) Công nghệ gen Nhà xuất Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh Nguyễn Tiến Thắng, Nguyễn Đình Hun (1998) Giáo trình sinh hóa đại Nhà xuất giáo dục Nguyễn Thùy Châu, Nghiên cứu áp dụng công nghệ vi sinh sản xuất chế phẩm acid amin enzyme từ nguồn thứ phẩm nông nghiệp hải sản quy mô bán công nghiệp, Đề tài KHCN cấp nhà nước, Hà nội, (2006): 154 -165 Nguyễn Thuý Hương (2008), Một số ứng dụng cellulose vi khuẩn lĩnh vực thực phẩm, Tạp chí sinh học, 30 (1): 62 -69 Nguyễn Thuý Hương, Trần Thị Minh Tâm (2009), “Ứng dụng vi khuẩn Corynebacterium sp cố định lên men thu nhận L-lysine”, Tạp chí khoa học cơng nghệ trường đại học kỹ thuật, Số 70, trang 96 -100 Trần Quốc Dung, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ (2006) Công nghệ chuyển gen (Động vật Thực vật) Nhà xuất Huế Tài liệu nước 10 A.A.de Graaf, L.Eggeling, H.Sahm (2001) Metabolic Engineering for Llysine Production by Corynebacterium glutamicum Biotechnology, vol.73, 10-29 11 Akashi, K., Shibai, H and Hirose, Y (1979), Agric Biol Chem., 43, 20872092 12 Cheetham, P.S.J., Blunt, K.W and Bucke, C (1979), Biotechnoi Bioeng., 21, 2155-2168 101 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 13 De Hollander JJ, Eswilder R, and Noordover JAC (1998) Amino Acid Fermentation Process U.S Patent No 5,763,230 14 Eikmeier H., Westmeier F and Rehm H.J (1984), Appl Microbiol Biotechnol., 19, 53-57 15 Gordon F Bickertaff, (1997) Immobilization of enzymes and cells, Humana Press Inc, New Jersey 16 Hirao T, Nakano T, Azuma T, Sugimoto M, and Nakanishi T (1989) Llysine production in continuous culture of an L-lysine hyperproducing mutant of Corynebacterium glutamicum Appl Microbiol Biotechnol 32:269–273 17 Junko Ohnishi and Masato Ikeda (2006) Comparisons of Potential for LLysine Production among Different Corynebacterium glutamicum strains Biosci.Biotechnol Biochem.,70 (4), 1017-1020 18 Judith Becker, Corinna Klopprogge, Oskar Zelder, Elmar Heimzle and Christoph Wittmann (2005) Amplified Expression of Fructose 1,6- Biophosphatase in Corynebacterium Glutamicum Increase In Vivo Flux through the Pentose phosphate Pathway and Lysine Production on Different Carbon Sources American Society for Microbiology 71:8587-8596 19 Kawahara Y, Yoshihara Y, Ikeda S, Yoshii H, and Hirose Y (1990) Stimulatory effect of glycine betaine on L-lysine fermentation Appl Microbiol Biotechnol 34:87–90 20 Liaw, H.J., Eddington, J., Yang, Y., Dancey, R., Swisher, S., Mao,W.: (2006) US20066984512 21 Lothar Eggeling and Michael Bott (2005) Handbook of Corynebacterium glutamicum, CRC Press, the United States of America 22 Masato Ikeda (2003) ,amino acid production process Advances in Biochemical Engineering, Biotechnology,Vol 79 23 Mikiro Hayashi, et al (2006) Transcription anlysis Reveals Global Expression Changes in an Industrial L-lysine Producer of Corynebacterium glutamicum Biosci Biotechnol Biochem.,70 (2), 546-550 24 Moncef nasri, Abdelhafidh dhouib, Fathi zorguani, Habib kriaa,Radouan ellouz.( 1989) Production of lysine by using immobilized living Corynebacterium sp cells Biotechnology Letters 11: 865-870 102 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 25 Nakamura T, Nakayama T, Koyama Y, Shimazaki K, Miwa H, Tsuruta M, TamuraY, and Tosaka O (2000) Process for production of lysine by fermentation U.S Patent No 6,025,169 26 Nasri, M., Sayadi, S., Barbotin, J.N and Thomas, D (1987b) J Biotechnol 6, 147-157 27 Nasri, M., Sayadi, S., Barbotin, J.N., Dhulster, P and Thomas, D (1987a) Appl Environ Microbiol 53,740-744 28 Oh, J W., Kim, S.J., Cho, Y.J., Park, N H., Lee, J.H.: US5268293(1993) 29 Rodovich, J.M (1985) Biotech Advs 3, 1-12 30 Savas Anastassiadis (2007) L-Lysine Fermentation Biotechnology, 1, 1124 31 Shinmyo, A., Kimura, H and Okada, H (1982) Eur J Appl Microbiol Biotechnol., 14, 7-12 32 Shuichi Ishino, et al (1984) Involvement of meso-a,e- Diaminopimelate DDehydrogenase in Lysine Biosynthesis in Corynebacterium glutamicum Agric Biol Chem, 48 (10), 2557-2560 33 Shuichi Ishino, et al (1988) Cloningand Sequencing of the mesoDiaminopimelate-D-dehydrogenase (ddh) Gene of Corynebacterium glutamicum Agric Biol Chem, 52 (11), 2903-2909 34 Walter Pfefferle, et al (2003) Biotechnological Manufacture of Lysine Biotechnology, Vol 79, 60-112 35 Yoshiya Gunji, et al (2004) Characterization of the L-lysine Biosynthetic Pathway in the Obligate Methylotroph Methylophilus methylotrophus Biosci Biotechnol Biochem., 68 (7), 1449-1460 36 Yoshiya Gunji, et al (2006) Characterization of a Unique Murant lysE Genne, Originating from Corynebacterium glutamicum, Encoding a Product That Induces L-lysine Production in Methylophilus methylotrophus Biosci Biotechnol Biochem.,70 (12), 2927-2934 Địa trang web 37 www.anabol.com 38 www.baigiang.bachkim.vn 103 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com 39 www.lakewoodconferences.com 40 www.wellbasics.com 41 www.wikipatents.com/US-Patent-4123329 104 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com ... luanvanchat@agmail.com Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu Giai đọan tổng hợp lysine từ aspartate: Hình 16 Con đường tổng hợp lysine [34] Trong chế sinh tổng hợp lysine vi khuẩn lysine tổng hợp lúc với methionie,... raxemic pháp hóa tổng hợp nên lysine - Dễ thực (hỗn hợpL -lysine - Sản phẩm tạp chất D -lysine) _tốn học tách - Giá thành cao Phương Nhờ khả tổng - Thu lysine dạng L - Thời gian lên men pháp hợp thừa số... lysine tiết ngồi (Hình 1.16) 17 LUAN VAN CHAT LUONG download : add luanvanchat@agmail.com Chương 1: Tổng hợp quan tài liệu 1.4 Điểu kiện tổng hợp dư L -lysine: Sơ đồ điều hòa dị lập thể tổng hợp