Nghiên cứu công nghệ tổng hợp phức chất puerarin maltose bằng enzyme maltogenic amylase và ứng dụng sản xuất nước uống lên men chức năng từ sắn dây và dứa TT

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TĨM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chun ngành: CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM Mã ngành: 62.54.01.01 TRẦN QUỐC BÌNH NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ TỔNG HỢP PHỨC CHẤT PUERARIN - MALTOSE BẰNG ENZYME MALTOGENIC AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT NƯỚC UỐNG LÊN MEN TỪ SẮN DÂY VÀ DỨA Cần Thơ, 2021 CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Người hướng dẫn: PGS TS LÝ NGUYỄN BÌNH TS LÊ QUANG TRÍ Luận án bảo vệ trước hội đồng chấm luận án tiến sĩ cấp trường Họp tại: Phòng Bảo vệ Luận án Tiến sĩ, Lầu II, Nhà Điều hành, Trường Đại học Cần Thơ Vào lúc: … … ngày … tháng … năm … , ngày 17 tháng 11 năm 2018 Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Có thể tìm hiểu luận án thư viện: Trung tâm Học liệu, Trường Đại học Cần Thơ Thư viện Quốc gia Việt Nam DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH ĐÃ CƠNG BỐ (1) Lê Quang Trí Trần Quốc Bình, 2014 Nghiên cứu qui trình sản xuất rượu chức từ củ sắn dây Tạp chí khoa học đào tạo, ISSN: 2354 – 0567, số 01 năm 2014, trang: 175 – 183 (2) Lê Quang Trí Trần Quốc Bình, 2014 Nghiên cứu sản xuất tinh bột gạo chậm tiêu hóa enzyme Maltogenic Amylase Bài báo cáo hội thảo ICSAF 2014 Bangkok Thailand, 16 – 18 tháng 07 năm 2014 (3) Tran Quoc Binh, Le Quang Tri, Doan Nguyen Thuy Quynh and Pham Thi Minh Hoang, 2017 Modifying tapioca starch by αamylase and Maltogenic amylase Food Science and Technology: integration for ASEAN Economic Community Sustainable Development Proceedings of the 15th ASEAN Conference on Food Science and Technology November 1417, 2017 Ho Chi Minh City, Viet Nam Volume 2: 10-17 ISBN: 978 604 67 1006-6 (4) Trần Quốc Bình, Phạm Thị Minh Hồng, Lý Nguyễn Bình, Lê Quang Trí, 2020 Tối ưu hóa q trình biến tính hợp chất chức puerarin sắn dây enzyme maltogenic amylase Tạp chí NN&PTNT, kỳ 2, tháng 6/2020, mã số ISSN 1859-4581 (5) Trần Quốc Bình, Phạm Thị Minh Hồng, Lý Nguyễn Bình, Lê Quang Trí, Nguyễn Phú Thương Nhân, 2021 Tối ưu hóa q trình lên men nước dứa-sắn dây bổ sung phức chất puerarinmaltose Tạp chí Cơng thương, số 2, tháng 01/2021, mã số ISSN 0866-7756 (6) Tran Quoc Binh, Pham Thi Minh Hoang, Le Quang Tri, Ly Nguyen Binh, 2021 Identifying consumers’ drivers for acceptance of fermented misture of pineapple and kudzu Tạp chí Cơng thương, số 2, tháng 01/2021, mã số ISSN 0866-7756 Chương MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết luận án Dứa loại trái xuất tiêu dùng nội địa chủ lực tỉnh Tiền Giang Để tạo nên giá trị gia tăng cho loại sản phẩm này, cần phải có đầu tư, nghiên cứu sâu khâu chế biến; tạo nên khác biệt giá trị gia tăng cao, từ hình thành sản phẩm chủ lực tỉnh Dứa cung cấp vitamin A, C, canxi, mangan giúp mơ tránh khỏi tác hại q trình oxy hóa Nước ép dứa giúp giảm stress làm việc hiệu Đặc biệt, dứa có chứa nhiều bromelain nên có tác dụng thủy phân protein thành acid amin, giúp tiêu hóa tốt tăng sức đề kháng Củ sắn dây chứa hàm lượng tinh bột, có khả thủy phân lên men rượu, chứa hợp chất có giá trị puerarin Tuy nhiên, sắn dây nguyên liệu chưa nghiên cứu ứng dụng nhiều nước,…Puerarin có tác dụng tốt ngăn ngừa ung thư bệnh có liên quan tới tim mạch cao huyết áp, rối loạn nhịp tim, co thắt động mạch, chứng xơ vữa động mạch Tuy nhiên, độ tan nước thấp ngăn cản ứng dụng sản phẩm dược phẩm thực phẩm chức (Liu et al., 2012) Một ứng dụng quan trọng puerarin hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường tăng cường hấp thu glucose vào insulin (Kato &Kawabata, 2010) Để cải thiện khả hồ tan nâng cao tính ứng dụng sắn dây, “Nghiên cứu công nghệ tổng hợp phức chất puerarin–maltose enzyme maltogenic amylase ứng dụng sản xuất nước uống lên men từ sắn dây dứa” tạo loại nước uống lên men từ dứa làm giàu thêm puerarin sản phẩm mang lại nhiều giá trị, phù hợp với định hướng tỉnh góp phần quan trọng hình thành chuỗi giá trị sản phẩm nông sản 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Nâng cao giá trị sử dụng hiệu nguồn sắn dây nguyên liệu dứa sẵn có Tiền Giang, nghiên cứu kết hợp hợp chất puerarin sắn dây vào nước ép từ dứa qua q trình chuyển hóa nấm men enzyme 1.3 Nội dung nghiên cứu Nội dung 1: Tối ưu hóa q trình thủy phân tinh bột sắn dây tác dụng enzyme β-amylase thông qua việc khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất, pH, nhiệt độ, thời gian nồng độ enzyme β-amylase Nội dung 2: Tối ưu hóa q trình tổng hợp phức chất puerarin-maltose tác dụng enzyme BSMA thông qua việc khảo sát ảnh hưởng pH, nhiệt độ, thời gian nồng độ enzyme BSMA Nội dung 3: Tối ưu hóa q trình lên men nước dứa-sắn dây thơng qua việc khảo sát ảnh hưởng pH, Bx, tỷ lệ nấm men điều kiện lên men nhiệt độ thường 1.4 Ý nghĩa khoa học ý nghĩa thực tiễn - Ý nghĩa khoa học: Sắn dây loại ngun liệu có giá trị kinh tế khơng cao, lại chứa hợp chất chức puerarin - có giá trị sức khỏe người Trải qua q trình biến tính việc kết hợp hai loại enzyme β-amylase enzyme maltogenic amylase, cấu trúc puerarin từ dạng khơng tan chuyển thành dạng hịa tan nước thơng qua việc biến tính để hình thành phức puerarin-maltose, từ ứng dụng tạo nhiều hướng nghiên cứu khoa học puerarin có sắn dây nói riêng thực vật nói chung - Ý nghĩa thực tiễn: Thành công nghiên cứu mang lại nhiều lợi ích cho ngành sản xuất nông sản, làm gia tăng chất lượng cho khâu chế biến trái cây, góp phần cải thiện khó khăn cho nơng dân tham gia sản xuất Kết đề tài quy trình chế biến trái cây, tạo sản phẩm có giá trị, góp phần tạo nên mạnh cạnh tranh sản phẩm từ trái tỉnh, khu vực nước 1.5 Điểm luận án Đề xuất phương pháp nghiên cứu xây dựng thành cơng quy trình sản xuất nước uống lên men từ dứa làm giàu thêm puerarin với nguồn puerarin chủ động ổn định thông qua tổng hợp puerarin-maltose theo phương pháp enzyme Xác định thơng số tối ưu hóa q trình biến tính hợp chất puerarin thực qua hai bước (1) thủy phân tinh bột sắn dây tác dụng enzyme β-amylase để tạo dịch thủy phân giàu puerarin; (2) quy trình tổng hợp phức chất puerarin-maltose tác dụng enzyme BSMA Thiết lập quy trình cơng nghệ lên men nước dứa có bổ sung phức chất puerarin-maltose từ sắn dây quy mơ phịng thí nghiệm với tiêu chất lượng đáp ứng tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) cho nước uống có cồn Từ làm sở khoa học cho việc phát triển đa dạng hoá sản phẩm giàu dinh dưỡng từ nông sản ĐBSCL (dứa) Việt Nam (sắn dây) nói chung 1.6 Kết cấu luận án Luận án bao gồm chương với 103 trang: Chương 1- Giới thiệu (trang 1÷3); Chương 2- Tổng quan tài liệu (trang 4÷44); Chương 3- Nguyên liệu phương pháp nghiên cứu (trang 45÷63 với thí nghiệm); Chương 4- Kết thảo luận (trang 64÷101); Chương 5- Kết luận đề xuất (trang 102÷103) Trong nội dung có 36 bảng 59 hình Bài viết sử dụng 184 tài liệu tham khảo, bao gồm 171 tài liệu tiếng Anh 13 tài liệu tiếng Việt Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu nguyên liệu sắn dây Sắn dây, chi Pueraria DC, thuộc họ Đậu (Fabaceae) trồng nhiều Châu Á, Úc, Mỹ số nước khác có Việt Nam Trong đó, củ sắn dây có nhiều chất dinh dưỡng tốt cho sức khỏe có tác dụng chữa bệnh Củ sắn dây (Radix puerariae, RP) có chứa số hoạt chất sinh học isoflavones daidzein, daidzin puerarin (Chen et al., 2001; Hirakura et al., 1997; Jiang et al., 2005; Miyazawa et al., 2001) Những hoạt chất có hoạt tính sinh lý quan trọng chống lại bệnh ung thư sử dụng điều trị bệnh nghiện rượu cách an toàn hiệu 2.2 Hợp chất puerarin Puerarin hợp chất isoflavone C-glucoside, xem thành phần isoflavone sắn dây Puerarin hịa tan nước (11 mM 25°C) (Wang & Cheng, 2005), điều ngăn cản ứng dụng puerarin dược phẩm thực phẩm Một số cách cải thiện độ hịa tan puerarin: phương pháp hóa học enzyme (Bertrand et al., 2006; Jiang et al., 2008); dùng vi màng bao từ polyme tự nhiên tổng hợp (Sansone et al., 2001; Oidtmann et al., 2012 ); tạo nhũ tương (Quan et al., 2007); điều chế dẫn xuất (Li et al., 2004; Ye et al., 2007, Jiang et al., 2008) 2.3 Nguyên liệu dứa Dứa hay cịn gọi khóm, có tên khoa học Ananas comosus, tên tiếng Anh Pineapple Ở Việt Nam, dứa trồng nhiều loại đất khác nhiều tỉnh Tiền Giang, Long An, Kiên Giang, Bạc Liêu, Cà Mau, Quảng Nam, Thanh Hóa, … Sản lượng nước đạt 337.500 dứa tươi, chiếm khoảng 2% tổng sản lượng tồn giới, đứng vị trí thứ 11 sản lượng dứa giới (FAO, 2004) Có tác dụng hỗ trợ tiêu hố chứa enzyme bậc bromelain 2.4 Enzyme Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase (BSMA) Maltogenic amylase (EC.3.2.1.133) (MA) cịn có tên gọi khác như: 1,4-alpha-D-glucan alpha-maltohydrolase; Maltogenic α-amylase; Glucan 1,4-α-maltohydrolase Là enzyme khơng tiết ngồi tế bào mà enzyme liên kết với màng tế bào (Tang et al., 2006) MA thể tác động kép lên chất, có khả cắt liên kết α-1,4 α-1,6 glycoside; chuyển liên kết α-1,4 thành α-1,6, α-1,3 α-1,4 khác (Bae et al., 2002) MA có khả thủy phân acarbose, pseudotetrasaccharide có khả ức chế mạnh số enzyme carbohydrase loại bao gồm: α–amylase, α– glucosidase cyclodextrin glycosyltransferases (CGTase); chuyển acarviosine – glucose (sản phẩm thủy phân) đến phân tử carbohydrate tiếp nhận MA chuyển mono disaccharide đến nhiều loại phân tử tiếp nhận khác (Bae et al., 2002); hoạt động mạnh chất cyclodextrin (CD) tinh bột pullulan, enzyme phân giải chất β-CDs (7 đơn vị glucose) nhanh 100 lần so với tinh bột pullulan Ngược lại, amylase khác với đặc tính thủy phân khơng thể phân giải CDs pullulan MA cắt liên kết α-1,4 hiệu α-1,6, với nồng độ chất thấp sản phẩm tạo thành chủ yếu maltose 2.5 Các nghiên cứu có liên quan BSMA ưu tiên chuyển hóa đơn vị maltose giải phóng từ q trình thủy phân đến phân tử chất nhận cách hình thành liên kết α-(1,6)-glycoside chất cho chất nhận (Cha et al., 1998) BSMA công thủy phân chất cho (maltotriose) để tạo thành phức trung gian chất thủy phân (maltose glucose) enzyme Nước phân tử chất nhận (puerarin maltooligosaccharide) công phức hợp trung gian hỗn hợp phản ứng loại sản phẩm hình thành: sản phẩm trình thủy phân, sản phẩm maltooligosyl-transglycosylation sản phẩm chuyển hóa puerarin Li et al (2004) sử dụng tinh bột hòa tan để làm chất cho q trình chuyển hóa puerarin, hiệu suất tạo thành đạt 40,9% sử dụng 0,5% tinh bột, 1% puerarin; hiệu suất đạt 66,6% sử dụng 5% maltotriose làm chất điều kiện phản ứng 55°C, 55 phút, nồng độ BSMA U/mg Nồng độ tinh bột đến 5%, hiệu suất tăng đến 70% Li et al., (2004) nghiên cứu khả chuyển hóa enzyme để kiểm tra tính đặc hiệu chấp nhận puerarin BSMA (EC 3.2.1.133), T maritima maltosyl-transferase (TMMT; EC 3.2.1.25), T scotoductus 4-α-glucanotransferase (TS4αGTase; EC 3.2.1.25) Bacillus sp I-5 cyclodextrin glucanotransferase (BSCGTase; EC 3.2.1.19) Phản ứng thực với 1% puerarin 5% maltotriose Kết cho thấy TMMT TS4αGTase tạo thành sản phẩm chuyển hóa puerarin enzyme thủy phân chuyển hóa maltotriose TMMT TS4αGTase khơng có tính đặc hiệu chấp nhận puerarin không tạo thành liên kết Oglucoside D-glucose 7-OH-daidzein BSMA BSCGTase tạo thành lượng lớn sản phẩm chuyển hóa puerarin Park Kwan Hwa et al 2012 nghiên cứu trình biến đổi sinh học hợp chất isoflavone hoạt tính chuyển đổi enzyme MAase Các MAase xúc tác trình thủy phân chất; thực phản ứng chuyển đổi đến phân tử chất nhận khác cách tạo thành liên kết α-(1,6)-glycoside BSMA enzyme hiệu số enzyme chuyển hóa maltosyltransferase (MTase), 4-α-glucanotransferase (4-α-GTase) enzyme chuyển hóa khác MTase 4-αGtase khơng có tính đặc hiệu puerarin khơng hình thành liên kết O-glycoside D-glucose 7-OH-daidzein Hai sản phẩm glucosyl-α-(1,6)-puerarin maltosyl-α(1,6)-puerarin Zhong et al (2012) nghiên cứu “Tính chất hóa lý, cấu trúc vi mô khả kháng khuẩn màng hỗn hợp βchitosan tinh bột sắn dây” Bổ sung 0%, 20%, 60% 100% tinh bột sắn dây dung dịch chitosan 1% Khi thêm 60% tinh bột làm giảm tính thấm nước độ hịa tan 15% 20% so với màng β-chitosan tinh khiết, độ bền học tính linh hoạt màng β-chitosan tăng khoảng 50% 25% tương ứng Wu et al (2013) nghiên cứu điều kiện tối ưu để trích ly puerarin từ Radix Pueraria kỹ thuật vi sóng Sử dụng ethanol làm dung mơi trích ly: nồng độ ethanol 52,36%, thời gian chiếu vi sóng 60 giây, lượng vi sóng 184,8 W, tỷ lệ dung môi:nguyên liệu 25:1 (mL/g) tương ứng với hàm lượng puerarin 11,97 mg/g Chương NGUYÊN LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Phương tiện nghiên cứu - Thời gian nghiên cứu: 6/2015-6/2019 - Địa điểm nghiên cứu: Các phịng thí nghiệm Khoa Nơng nghiệp Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Tiền Giang; Trung tâm Kỹ thuật Công nghệ sinh học, Sở Khoa học Công nghệ tỉnh Tiền Giang; Trung tâm tư vấn kiểm định chất lượng nông lâm thủy sản, Sở NN&PTNT tỉnh Tiền Giang; Công ty Rau Tiền Giang, Doanh nghiệp tư nhân Long Thuận (Tiền Giang) 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Nguyên vật liệu Sắn dây (Pueraria thomsonii Benth) trồng xã Hoành Sơn, huyện Kinh Môn, tỉnh Hải Dương, thu hoạch sau năm trồng sau đợt lấy mẫu Sắn dây cắt lát sấy khô đến khối lượng không đổi 70oC, bảo quản tủ mát (5oC), sử dụng tối đa năm, định kỳ đợt lấy mẫu, tiến hành phân tích đo đạc để đồng chất lượng mẫu Dứa (Ananas comosus) giống dứa Queen, trồng xã Thạnh Mỹ, huyện Tân Phước, tỉnh Tiền Giang Dứa dùng trình nghiên cứu loại dứa chín, khối lượng trung bình 0,5 kg/trái Bột maltodextrin cơng nghiệp cung cấp cơng ty hóa chất Hóa Nam, 239/4 Lý Thường Kiệt, Phường 15, Quận 11, Thành phố Hồ Chí Minh Chế phẩm enzyme β-amylase cung cấp công ty Novozymes, dạng lỏng, nhiệt độ tối ưu 50oC pH Chế phẩm enzyme BSMA cung cấp công ty DMS (Singapore), dạng rắn, nhiệt độ 60oC pH tối ưu 5,5 Giống nấm men Saccharomyces oviformis từ Phịng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Trường Đại học Công nghệ Sài Gòn, 180 Cao Lỗ, Phường 4, Quận 8, TP.HCM 3.2.2 Phương pháp phân tích - Tổng hàm lượng chất khơ hòa tan : Dùng chiết quang kế Atago 0-32 - Độ ẩm (%): xác định theo AOAC 934.06 - pH: xác định máy đo pH - Hàm lượng đường tổng (%): xác định theo TCVN 4594-88 - Hàm lượng đường khử (mg/g): Theo phương pháp Miller, 1959 - Hàm lượng amylose: Theo phương pháp Juliano, 1971 - Hàm lượng amylopectin: Theo phương pháp Juliano, 1971 - Hàm lượng tinh bột (%): TCVN 4594-88 - Hàm lượng ethanol: TCVN 5562-2009 - Số tế bào nấm men (cfu/mL): Đếm buồng đếm hồng cầu - Hàm lượng puerarin: Phân tích HPLC 3.3 Bố trí thí nghiệm 3.3.1 Phân tích thành phần hóa học ngun liệu sắn dây Mục đích: Xây dđíchân tích thành phần hóa học nguyên liệu sắn dây959 Các tiêu phân tích  Bố trí thí nghiệm: Bảng 0.2: Các nhân tố mức độ khảo sát trình xử lý enzyme BSMA Ký hiệu Nhân tố Đơn vị Mức độ o G Nhiệt độ C 45 55 65 H Thời gian Giờ I Nồng độ U/g tinh bột 10 15 20  Tiến hành thí nghiệm: Thí nghiệm tiến hành tương tự thí nghiệm Tiến hành 45 đơn vị thí nghiệm theo mơ hình Box-Behnken  Chỉ tiêu theo dõi: hàm lượng puerarin (mg/g) 3.5 Nội dung 3: Tối ưu hóa q trình lên men nước dứa có bổ sung phức chất puerarin-maltose 3.5.1 Thí nghiệm 6: Khảo sát sinh trưởng phát triển giống Saccharomyces oviformis môi trường nước dứa – sắn dây giai đoạn nhân sinh khối  Mục đích: Nhằm xác định khả phát triển nấm men Saccharomyces oviformis môi trường nước dứa-sắn dây Đồng thời qua khảo sát xác định thời gian nhân giống thích hợp số lượng tế bào nấm men cần thiết để đưa vào lên men  Bố trí thí nghiệm: Nhân tố J: tỷ lệ nước dứa-sắn dây, thay đổi mức độ J1: 2:8 J2: 4:6 J3: 5:5 J4: 6:4 J5: 8:2 Nhân tố H: thời gian nhân giống, thay đổi mức độ K1: 24h K2: 48h K3: 72h Thí nghiệm thực lần Tổng số đơn vị thí nghiệm: x x = 45  Tiến hành thí nghiệm: Nước sắn dây sau thủy phân enzyme βamylase BSMA bổ sung nước dứa với tỷ lệ thay đổi mức độ tiến hành lọc, điều chỉnh giá trị thích hợp cho q trình nhân giống: pH 4,5-5,5; Pepton: 1%; Bx: 15 Sau cân dinh dưỡng trên, tiến hành tiệt trùng môi trường nhiệt độ 121oC 30 phút làm nguội đến nhiệt độ phòng Dùng que cấy giống nấm men S oviformis từ ống thạch nghiêng vào bình tam giác 500 mL chứa môi trường Tiến hành nhân giống nhiệt độ 28-32oC máy 11 lắc ổn nhiệt Trong trình nhân giống, sau 24h lấy mẫu lần kiểm tra số lượng tế bào nấm men mL dịch nuôi cấy  Chỉ tiêu theo dõi: số lượng tế bào nấm men/mL dịch nuôi cấy theo thời gian Xác định cách đếm trực tiếp buồng đếm hồng cầu 3.5.2 Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ phối chế nước dứa-nước sắn dây đến giá trị cảm quan sản phẩm  Mục đích: Xác định tỷ lệ phối chế thích hợp để tạo sản phẩm có nồng độ cồn thích hợp có giá trị cảm quan cao  Bố trí thí nghiệm: Nhân tố L: tỷ lệ phối chế nước dứa-sắn dây, thay đổi mức độ: L1: 2:8 L2: 4:6 L3: 5:5 L4: 6:4 L5: 8:2 Thí nghiệm thực lần Tổng số đơn vị thí nghiệm: x = 15  Tiến hành thí nghiệm: Dịch sắn dây sau giai đoạn thủy phân enzyme βamylase BSMA đem gia nhiệt 100oC 15 phút để dừng phản ứng thủy phân enzyme đồng thời tiêu diệt vi sinh vật gây hại ảnh hưởng đến trình lên men Sau gia nhiệt, dịch sắn dây để nguội đến nhiệt độ phòng tiến hành phối chế với nước dứa ứng với tỷ lệ khảo sát cho thể tích cuối đạt 500 mL Bổ sung dịch nấm men ni cấy với thời gian thích hợp mơi trường dịch dứa-sắn dây (thí nghiệm 5) tỷ lệ 10% Điều chỉnh Brix, pH với giá trị tương ứng 20, 4,5 tiến hành lên men nhiệt độ thường Cứ sau ngày ghi nhận kết lần, đến đạt độ cồn mong muốn (5-6o) dừng trình lên men  Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng cồn sinh theo thời gian Sự thay đổi Brix, pH trình lên men Sự thay đổi tổng số tế bào nấm men dịch lên men Đánh giá cảm quan sản phẩm 12 3.5.3 Thí nghiệm 8: Tối ưu hóa q trình lên men nước dứasắn dây (khảo sát ảnh hưởng pH, Bx, tỷ lệ nấm men) điều kiện lên men nhiệt độ thường  Mục đích: Tìm thông số tối ưu cho nấm men phát triển giúp thu hàm lượng cồn thích hợp chất lượng cảm quan sản phẩm tốt  Bố trí thí nghiệm: Bảng 0.3: Các nhân tố mức độ khảo sát Ký hiệu Nhân tố Đơn vị Mức độ M pH 3,5 4,5 5,5 N Bx 20 22 24 O Tỷ lệ nấm men % 10 15  Tiến hành thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với nhân tố khảo sát (pH, Brix, tỷ lệ nấm men), nhân tố cịn lại cố định Thí nghiệm tiến hành tương tự thí nghiệm Thí nghiệm thực lần Tống số đơn vị thí nghiệm: 30  Chỉ tiêu theo dõi: Hàm lượng cồn sinh theo thời gian Sự thay đổi Brix, pH trình lên men Sự thay đổi tổng số tế bào nấm men dịch lên men Đánh giá cảm quan sản phẩm Đánh giá chất lượng sản phẩm nước uống lên men từ sắn dây dứa Xác định hàm lượng puerarin sản phẩm nước uống lên men Phân tích tiêu sản phẩm nước uống lên men (theo TCVN) Đánh giá cảm quan chất lượng sản phẩm nước uống lên men 13 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thành phần hóa học nguyên liệu sắn dây Kết thể Bảng 0.4.Nguyên liệu sắn dây tươi có độ ẩm tương đối cao (52,15%), sau sấy khô nghiền thành bột lại 6,5% Hàm lượng amylose bột sắn dây (30,19%) Kết phân tích HPLC cho thấy hàm lượng puerarin chiếm 0,96% (9,6 mg/g) Bảng 0.4: Kết phân tích thành phần hóa học bột sắn dây STT Chỉ tiêu Phương pháp Kết Độ ẩm AOAC 934.06 6,5% Hàm lượng đường tổng TCVN 4594-88 10,77% Hàm lượng tinh bột TCVN 4594-88 56,46% Hàm lượng amylose TCVN 5716 30,19% Hàm lượng amylopectin TCVN 5716 69,81% 4.2 Tối ưu hóa trình thủy phân tinh bột sắn dây tác dụng enzyme β-amylase 4.2.1 Ảnh hưởng nồng độ chất đến trình thủy phân tinh bột sắn dây tác dụng enzyme β-amylase Hàm lượng đường khử tạo cao (141,68 mg/g) ứng với nồng độ chất 10% thấp (94,79 mg/g) nồng độ 16% Các mẫu bột sắn dây nồng độ 8, 10, 12 14% tạo lượng đường khử có khác biệt ý nghĩa so với mẫu nồng độ 16% Khi nồng độ chất tăng từ lên 10%, hàm lượng đường khử tăng giảm xuống tăng nồng độ chất đến 16% Bảng 0.5: Ảnh hưởng nồng độ chất đến hàm lượng đường khử Mẫu Nồng độ chất (%) Đường khử (mg/g) 119,56±6,4c 10 141,68±4,44d 12 116,99±7,86bc 14 108,04±3,98b 16 94,79±4,89a Tỷ số F 27,4 Giá trị P 0,0000 14 4.2.2 Ảnh hưởng pH đến trình thủy phân tinh bột sắn dây tác dụng enzyme β-amylase Bảng 0.6: Ảnh hưởng pH đến hàm lượng đường khử tạo thành STT pH Hàm lượng đường khử (mg/g) 131,33±3,01b 5,5 149,24±5,88c 160,01±1,86c 6,5 137,74±5,81b 104,76±10,54a Kết phân tích cho thấy hoạt tính enzyme β-amylase thể tốt khoảng giá trị pH từ đến đạt cao pH 6, thích hợp cho enzyme hoạt động Mẫu thủy phân giá trị pH 5,5 có lượng đường khử tạo 149,24 mg/g khác biệt khơng có ý nghĩa so với mẫu pH có lượng đường khử tạo 160,01 mg/g 4.2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ, thời gian nồng độ enzyme β-amylase đến trình thủy phân tinh bột sắn dây Hiệu thủy phân tinh bột enzyme phụ thuộc vào nhiều điều kiện, đặc biệt nhiệt độ, nồng độ sử dụng thời gian thủy phân với hàm mục tiêu hàm lượng đường khử Mơ hình tương quan có ý nghĩa thống kê cao, giá trị cho hệ số R2 = 0,988 Giá trị F p mơ hình 288,72 0,0000, điều có nghĩa mơ hình chấp nhận Phương trình dự đốn hàm lượng đường khử thu sau: Y = - 520,813 + 21,5708X1 + 16,9202X2 + 2,8513X3 – 0,205667X12 + 0,00129995X1X2 + 0,0187132X1X3 – 1,74789X22 – 0,052651X2X3 – 0,0439538X32 (1) Các hệ số mơ hình bao gồm hệ số bậc một, hệ số bậc hai, hệ số tương tác có ý nghĩa (p 0,05), hệ số lược bỏ nhằm rút gọn phương trình, phương trình (1) trở thành: Y = - 521,099 + 21,576X1 + 2,8513X3 + 16,9917X2 – 0,205667X12 – 0,0439538X32 – 1,74789X22 + 0,0187132X1X3 – 0,052651X2X3 (2) 15 (A) (B) (C) Hình 0.1: Đồ thị bề mặt đáp ứng biểu diễn ảnh hưởng số yếu tố đến hàm lượng đường khử tạo thành thủy phân tinh bột sắn dây β-amylase (mg/g) A: ảnh hưởng thời gian nhiệt độ (ở nồng độ 40U/g bột) B: ảnh hưởng thời gian nồng độ (ở nhiệt độ 55oC) C: ảnh hưởng nhiệt độ nồng độ (ở thời gian giờ) Phương trình (3) diễn tả tương thích hàm lượng đường khử theo thực nghiệm theo mơ hình Hệ số R2 = 0,9989 khẳng định liệu dự đốn có độ tương thích cao y = 0,9989 x + 0,1478 (3) 16 Dữ liệu thu cho thấy giá trị p = 0,4278>0,05 Lack of fit khơng có ý nghĩa thống kê nên khả phù hợp mơ hình cao Điều kiện thủy phân tối ưu: nhiệt độ 54,34oC, thời gian 4,24 nồng độ enzyme 41,46 U/g tinh bột Giá trị thực nghiệm: hàm lượng đường khử 161,07±2,96 mg/g, khơng khác biệt có ý nghĩa so với kết dự đốn từ mơ hình 160,225 mg/g độ tin cậy 95% 4.3 Tối ưu hóa q trình tổng hợp phức chất puerarinmaltose tác dụng enzyme BSMA 4.3.1 Ảnh hưởng pH đến q trình biến tính hợp chất puerarin tác dụng enzyme BSMA Bảng 0.7: Sự thay đổi hàm lượng puerarin ảnh hưởng pH STT pH Hàm lượng puerarin (mg/g) 4,5 6,84±0,22b 7,75±0,16c 5,5 7,10±0,22b 6,31±0,29a 6,5 6,31±0,27a Kết phân tích cho thấy pH thay đổi từ 4,5 đến 6,5 hàm lượng puerarin thay đổi Ở giá trị pH 4,5; 5,5 hàm lượng puerarin tổng hợp có khác biệt ý nghĩa so với pH 6,5, mẫu ứng với pH cao (7,75 mg/g) khác biệt có ý nghĩa so với hàm lượng puerarin mẫu cịn lại Hoạt tính BSMA khoảng pH acid yếu (từ 4,5 đến 5,5) cao pH Giá trị pH chọn thơng số thích hợp cho q trình biến tính hợp chất puerarin tác dụng enzyme BSMA 4.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ, thời gian nồng độ enzyme BSMA đến q trình biến tính hợp chất puerarin Giá trị cho hệ số R2 0,96 Giá trị F p mơ hình 90,54 0,00; điều có nghĩa mơ hình chấp nhận Mơ hình tương quan hàm lượng puerarin yếu tố xây dựng phương trình Z = 1,59074 + 0,129549X4 + 0,32109X5 + 0,197767X6 – 0,00116001X42 – 0,000426667X4X5 + 0,000357167X4X6 – 0,0483066X52 + 0,00614X5X6 – 0,00786672X62 (4) 17 Các hệ số mơ hình bao gồm hệ số bậc một, hệ số bậc hai, hệ số tương tác có ý nghĩa (p