Nghiên cứu công nghệ tổng hợp phức chất puerarin maltose bằng enzyme maltogenic amylase và ứng dụng sản xuất nước uống lên men chức năng từ sắn dây và dứa

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ TRẦN QUỐC BÌNH MÃ SỐ NCS: P1115001 NGHIÊN CỨU CÔNG NGHỆ TỔNG HỢP PHỨC CHẤT PUERARIN - MALTOSE BẰNG ENZYME MALTOGENIC AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG SẢN XUẤT NƯỚC UỐNG LÊN MEN TỪ SẮN DÂY VÀ DỨA LUẬN ÁN TIẾN SĨ CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM MÃ NGÀNH: 62.54.01.01 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS TS LÝ NGUYỄN BÌNH TS LÊ QUANG TRÍ NĂM 2021 LỜI CẢM TẠ Lời đầu tiên, xin gởi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến PGS TS Lý Nguyễn Bình TS Lê Quang Trí Sự hướng dẫn khoa học tận tình với góp ý chân thành quý thầy giúp tơi nhiều q trình nghiên cứu hồn thiện luận án Tơi xin gởi lời tri ân đến quý Thầy, Cô Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ cung cấp cho kiến thức vô quý báu Đây tảng kiến thức vững giúp tơi hồn thành tốt luận án nói riêng cơng việc nói chung Tôi xin gởi lời cảm ơn đến Ban Giám hiệu Trường Đại học Tiền Giang tạo điều kiện cho học tập nghiên cứu Đặc biệt xin gởi lời cảm ơn chân thành đến quý Thầy, Cô Khoa Nông nghiệp Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Tiền Giang, tạo điều kiện thuận lợi có góp ý quý báu trình hồn thành luận án Xin chân thành cảm ơn hỗ trợ giúp đỡ tận tình cán Trung tâm tư vấn kiểm định chất lượng Nông lâm thủy sản, Chi cục Quản lý chất lượng Nông lâm sản Thủy sản, Sở Nông nghiệp Phát triển Nông thôn tỉnh Tiền Giang giúp đỡ tơi nhiều q trình thực phân tích tiêu nghiên cứu Xin cảm ơn anh, chị, bạn bè bạn nghiên cứu sinh khóa Khoa Nơng nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ ln động viên, khuyến khích tơi suốt trình học tập nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin gởi lời biết ơn đến gia đình - chỗ dựa vững để tơi hồn thành tốt việc học tập nghiên cứu Chân thành cảm ơn Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2021 Nghiên cứu sinh Trần Quốc Bình i TĨM TẮT Hợp chất puerarin isoflavone có củ sắn dây tốt cho sức khỏe Tuy nhiên, thành phần puerarin tự nhiên có độ tan nước thấp nên làm giảm tác dụng tinh bột sắn dây Để tăng độ tan hợp chất này, enzyme Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase (BSMA) sử dụng để biến tính tạo dẫn xuất puerarin tan tốt nước Q trình biến tính hợp chất puerarin thực qua hai bước tác dụng enzyme β-amylase BSMA Ở bước, ảnh hưởng nồng độ chất, pH, nhiệt độ thủy phân, thời gian thủy phân nồng độ enzyme lên hiệu biến tính khảo sát Hiệu đánh giá thông qua hàm lượng đường khử hàm lượng puerarin tổng hợp Luận án bao gồm nội dung chính: (i) Tối ưu hóa q trình thủy phân tinh bột sắn dây tác dụng enzyme β-amylase thông qua yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính xúc tác enzyme; (ii) Tối ưu hóa q trình tổng hợp phức chất puerarin-maltose tác dụng enzyme BSMA thông qua yếu tố ảnh hưởng đến khả xúc tác enzyme; (iii) Tối ưu hóa q trình lên men nước dứa-sắn dây thông qua việc khảo sát ảnh hưởng pH, Brix, tỷ lệ nấm men điều kiện lên men nhiệt độ thường Nghiên cứu bố trí thí nghiệm theo mơ hình Box-Behnken phương pháp bề mặt đáp ứng để tối ưu hóa điều kiện q trình biến tính Kết nghiên cứu cho thấy, bột sắn dây thủy phân enzyme βamylase tốt điều kiện tối ưu nhiệt độ 54,34°C, thời gian 4,24 giờ, nồng độ β-amylase 41,46 U/g bột có hàm lượng đường khử thu 161,07±2,96 mg/g Về ảnh hưởng BSMA đến khả tổng hợp puerarin, kết cho thấy điều kiện tối ưu cho chất tinh bột sắn dây 57,47°C; 4,05 giờ; BSMA 15,45 U/g bột Dưới điều kiện tối ưu này, hàm lượng puerarin tổng hợp (khi phân tích sắc ký lỏng cao áp) 7,51±0,02 mg/g Trong bước tiếp theo, trình lên men nước dứa-sắn dây nhiệt độ thường thử nghiệm tối ưu hóa phương pháp đáp ứng bề mặt kết hợp với thiết kế Box-Behnken với yếu tố pH, Brix tỷ lệ nấm men Kết thực nghiệm mơ hình đa thức bậc hai sử dụng để tối ưu hóa q trình lên men để thu hàm lượng puerarin cao Puerarin tối ưu hóa (7,4 mg/g) đạt đến hàm lượng dự đoán mơ hình điều kiện pH 5,21; 22,12 Brix tỷ lệ nấm men 11,16%, ngụ ý mô hình phù hợp để dự đốn cho q trình lên men với độ cồn thu tương ứng 6,02 Điểm trọng số đánh giá cảm quan quy định mức độ quan trọng yếu tố cấu thành màu sắc, mùi, vị Kết thống kê cho thấy rằng, với tỷ lệ phối trộn nước dứa sắn dây 6:4, mẫu lên men đạt điểm cảm quan tổng 17 điểm (lần lượt 3,47±0,62; 5,07±0,70; 8,15±0,78 tương ứng cho màu sắc, mùi, vị,) Khi tỷ lệ áp dụng cho trình lên men điều kiện pH 4,5, sản phẩm cuối đạt mức điểm cảm quan cao 16,09, tương đồng với sản phẩm thương mại Từ khóa: Bột sắn dây, BSMA, đường khử, puerarin, tối ưu hóa ii MỤC LỤC Trang LỜI CẢM TẠ i TÓM TẮT ii ABSTRACT iii LỜI CAM KẾT v MỤC LỤC vi DANH SÁCH BẢNG ix DANH SÁCH HÌNH xi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xiv CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu chung 1.2.2 Mục tiêu cụ thể 1.3 Nội dung nghiên cứu 1.4 Ý nghĩa nghiên cứu 1.4.1 Ý nghĩa khoa học 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 1.5 Tính luận án CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Nguyên liệu sắn dây 2.1.1 Nguồn gốc nơi trồng 2.1.2 Đặc tính 2.1.3 Một số lồi chi sắn dây 2.1.4 Thành phần hóa học 2.1.5 Hợp chất puerarin 12 2.2 Nguyên liệu dứa 14 2.2.1 Giới thiệu 14 2.2.2 Phân loại 15 vi 2.2.3 Thành phần hóa học 16 2.2.4 Công dụng 16 2.3 Maltodextrin 17 2.4 Hệ enzyme amylase 18 2.4.1 Enzyme β-amylase (EC 3.2.1.2) 18 2.4.2 Enzyme Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase (BSMA) 19 2.5 Quá trình tổng hợp phức chất puerarin-maltose enzyme maltogenic amylase 22 2.5.1 Hoạt tính chuyển hóa enzyme 22 2.5.2 Quá trình tổng hợp phức puerarin-maltose 24 2.5.3 Các ứng dụng hoạt tính chuyển hóa enzyme 27 2.6 Nấm men lên men nước 30 2.7 Cơ sở khoa học trình lên men 32 2.7.1 Quá trình lên men 32 2.7.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men 34 2.8 Một số nghiên cứu nước 36 2.8.1 Tình hình nghiên cứu nước 36 2.8.2 Tình hình nghiên cứu giới 37 2.9 Các nghiên cứu có liên quan 38 2.9.1 Quá trình tách chiết isoflavones 38 2.9.2 Hoạt tính chống oxy hóa 43 CHƯƠNG 3: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 45 3.1 Phương tiện nghiên cứu 45 3.1.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 45 3.1.2 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 45 3.2 Phương pháp nghiên cứu 46 3.2.1 Nguyên liệu 46 3.2.2 Các tiêu, phương pháp phân tích đo đạc 46 3.3 Nội dung nghiên cứu 47 3.3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 47 3.3.2 Bố trí thí nghiệm 50 vii CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 64 4.1 Thành phần hóa học nguyên liệu sắn dây 64 4.2 Tối ưu hóa q trình thủy phân tinh bột sắn dây tác dụng enzyme β-amylase 67 4.2.1 Ảnh hưởng nồng độ chất đến trình thủy phân tinh bột sắn dây tác dụng enzyme β-amylase 67 4.2.2 Ảnh hưởng pH đến trình thủy phân tinh bột sắn dây tác dụng enzyme β-amylase 68 4.2.3 Ảnh hưởng nhiệt độ, thời gian nồng độ enzyme β-amylase đến trình thủy phân tinh bột sắn dây 70 4.3 Tối ưu hóa q trình tổng hợp phức chất puerarin-maltose tác dụng enzyme BSMA 76 4.3.1 Ảnh hưởng pH đến q trình biến tính hợp chất puerarin tác dụng enzyme BSMA 76 4.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ, thời gian nồng độ enzyme BSMA đến q trình biến tính hợp chất puerarin 77 4.4 Quy trình biến tính hợp chất puerarin đề nghị 83 4.5 Tối ưu hóa q trình lên men nước dứa có bổ sung phức chất puerarin-maltose 85 4.5.1 Sự sinh trưởng phát triển giống Saccharomyces oviformis môi trường nước dứa-sắn dây giai đoạn nhân sinh khối 85 4.5.2 Ảnh hưởng tỷ lệ phối chế nước dứa-nước sắn dây đến giá trị cảm quan sản phẩm 87 4.5.3 Tối ưu hóa q trình lên men nước dứa-sắn dây (khảo sát ảnh hưởng pH, Bx, tỷ lệ nấm men) điều kiện lên men nhiệt độ thường đến hàm lượng Puerarin 89 4.5.4 Đánh giá chất lượng sản phẩm nước uống lên men từ sắn dây – dứa 100 CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 102 5.1 Kết luận 102 5.2 Kiến nghị 103 TÀI LIỆU THAM KHẢO 104 PHỤ LỤC Phụ lục 1: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PHỤ LỤC 1: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH PL-1 PHỤ LỤC 2: CÁC BẢNG SỐ LIỆU THỐNG KÊ PL-12 viii CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Hằng năm, nông sản Việt Nam cung cấp cho thị trường tiêu dùng với số lượng lớn chất lượng tốt Tuy nhiên, đầu chủ yếu xuất tiêu dùng không qua chế biến (hoặc sơ chế) nên giá trị giá không cao, khó khăn cho đời sống nơng dân, tác động lớn đến việc giữ vững phát triển vùng trồng bền vững Được biết, củ sắn dây chứa hợp chất có giá trị puerarin Nhiều nghiên cứu nhà khoa học giới cho thấy puerarin có tác dụng tốt việc ngăn ngừa ung thư bệnh có liên quan tới tim mạch cao huyết áp, rối loạn nhịp tim, co thắt động mạch, chứng xơ vữa động mạch Sắn dây có chứa hàm lượng tinh bột, có khả thủy phân lên men rượu Tuy nhiên, sắn dây nguyên liệu chưa nghiên cứu ứng dụng nhiều nước ta, chủ yếu xuất sang nước Nhật, Hàn Quốc với giá tương đối rẻ Cho đến puerarin sắn dây xem hợp chất chiếm tỷ lệ cao so với loại thực vật khác Tuy nhiên, độ tan nước thấp ngăn cản ứng dụng puerarin sản phẩm dược phẩm thực phẩm chức (Liu et al., 2012) Để tăng độ tan puerarin, Choi et al., 2010 tổng hợp phức chất puerarin-cycloamylose từ Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase (BSMA) 4-alphaglucanotransferase Liu et al., 2012 nghiên cứu tổng hợp phức chất puerarin glucosyl-β-cyclodextrin để cải thiện độ hòa tan nước puerarin Một ứng dụng quan trọng puerarin hỗ trợ điều trị bệnh đái tháo đường puerarin giúp tăng cường hấp thu glucose vào insulin (Kato and Kawabata, 2010) Mặt khác, Nhà nước chủ trương tạo điều kiện thuận lợi cho việc đẩy mạnh chuỗi giá trị gia tăng sản phẩm trái đồng sông Cửu Long, qua tạo nên mạnh việc phát triển kinh tế vùng trọng điểm UBND tỉnh Tiền Giang có Quyết định 1512/QĐ-UBND ngày 26/06/2013 việc phê duyệt Danh mục nhiệm vụ khoa học công nghệ triển khai năm 2014; tập trung ngân sách cao cho chương trình chế biến nơng sản gắn với thị trường tiêu thụ Trong đó, hỗ trợ đẩy mạnh chế biến nông sản chủ lực tỉnh: dứa, sầu riêng, mít,…và số nơng sản khó tiêu thụ nội địa Dứa loại trái xuất tiêu dùng nội địa chủ lực tỉnh Tiền Giang Để tạo nên giá trị gia tăng cho loại sản phẩm này, cần phải có đầu tư, nghiên cứu sâu khâu chế biến; tạo nên khác biệt giá trị gia tăng cao, từ hình thành sản phẩm chủ lực tỉnh Dứa không dùng làm tráng miệng sau bữa ăn, nước ép trái dứa giúp giải nhiệt giải khát tốt Nước cốt trái dứa giúp giảm mệt mỏi có chứa nhiều vitamin A, C, canxi, mangan giúp mô tránh khỏi tác hại q trình oxy hóa Vì vậy, uống nước ép từ trái dứa giúp giảm stress làm việc hiệu Đặc biệt, dứa có chứa nhiều bromelain nên có tác dụng thủy phân protein thành acid amin, giúp tiêu hóa tốt tăng sức đề kháng cho thể (http://vi.wikipedia.org) Với công dụng, nhu cầu điều kiện thực tế trên, “Nghiên cứu công nghệ tổng hợp phức chất puerarin–maltose enzyme maltogenic amylase ứng dụng sản xuất nước uống lên men từ sắn dây dứa” tạo loại nước uống lên men từ dứa làm giàu thêm puerarin sản phẩm mang lại nhiều giá trị, phù hợp với định hướng tỉnh góp phần quan trọng hình thành chuỗi giá trị sản phẩm nông sản 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu chung Nâng cao giá trị sử dụng hiệu nguồn sắn dây nguyên liệu dứa sẵn có Tiền Giang, nghiên cứu kết hợp hợp chất puerarin sắn dây vào nước ép từ dứa qua q trình chuyển hóa nấm men enzyme 1.2.2 Mục tiêu cụ thể Tối ưu hóa trình tổng hợp phức chất puerarin-maltose từ sắn dây: chọn thông số tối ưu (pH, nhiệt độ, thời gian nồng độ enzyme) trình thủy phân tinh bột sắn dây tác dụng enzyme β-amylase trình tổng hợp phức chất puerarin-maltose tác dụng enzyme maltogenic amylase Đưa quy trình chế biến để tạo nên sản phẩm nước uống lên men từ dứa giàu puerarin: Sử dụng chủng nấm men phù hợp với thông số tối ưu (Brix, pH, nhiệt độ lên men, tỷ lệ nấm men) để lên men hỗn hợp nước sắn dây chế biến trước (có chứa phức chất puerarin-maltose) nước ép trái dứa tạo nên loại nước uống chứa puerarin giàu vitamin 1.3 Nội dung nghiên cứu Phân tích thành phần hóa học ngun liệu sắn dây Nội dung 1: Tối ưu hóa q trình thủy phân tinh bột sắn dây tác dụng enzyme β-amylase thông qua việc khảo sát ảnh hưởng nồng độ chất, pH, nhiệt độ, thời gian nồng độ enzyme β-amylase Nội dung 2: Tối ưu hóa q trình tổng hợp phức chất puerarin-maltose tác dụng enzyme BSMA thông qua việc khảo sát ảnh hưởng pH, nhiệt độ, thời gian nồng độ enzyme BSMA Nội dung 3: Tối ưu hóa q trình lên men nước dứa-sắn dây thông qua việc khảo sát ảnh hưởng pH, Bx, tỷ lệ nấm men điều kiện lên men nhiệt độ thường 1.4 Ý nghĩa nghiên cứu 1.4.1 Ý nghĩa khoa học Mặc dù sắn dây loại nguyên liệu rẻ tiền, giá trị kinh tế không cao, nhiên sắn dây lại chứa hợp chất chức - puerarin - có giá trị sức khỏe người Đây hợp chất khó tan nước, điều ngăn cản ứng dụng puerarin thực phẩm dược phẩm Trải qua q trình biến tính việc kết hợp hai loại enzyme β-amylase enzyme maltogenic amylase, cấu trúc puerarin từ dạng không tan chuyển thành dạng hịa tan nước thơng qua việc biến tính để hình thành phức puerarin-maltose, từ ứng dụng tạo nhiều hướng nghiên cứu khoa học puerarin có sắn dây nói riêng thực vật nói chung 1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn Thành công nghiên cứu mang lại nhiều lợi ích cho ngành sản xuất nơng sản, làm gia tăng chất lượng cho khâu chế biến trái cây, góp phần cải thiện khó khăn cho nơng dân tham gia sản xuất Kết đề tài quy trình chế biến trái cây, tạo sản phẩm có giá trị, góp phần tạo nên mạnh cạnh tranh sản phẩm từ trái tỉnh, khu vực nước 1.5 Tính luận án Đề xuất phương pháp nghiên cứu xây dựng thành cơng quy trình sản xuất nước uống lên men từ dứa làm giàu thêm puerarin với nguồn puerarin chủ động ổn định thông qua tổng hợp puerarin-maltose theo phương pháp enzyme Xác định thơng số tối ưu hóa q trình biến tính hợp chất puerarin thực qua hai bước (1) thủy phân tinh bột sắn dây tác dụng enzyme β-amylase để tạo dịch thủy phân giàu puerarin; (2) quy trình tổng hợp phức chất puerarin-maltose tác dụng enzyme BSMA Thiết lập quy trình cơng nghệ lên men nước dứa có bổ sung phức chất puerarin-maltose từ sắn dây quy mô phịng thí nghiệm với tiêu chất lượng đáp ứng tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN) cho nước uống có cồn Từ làm sở khoa học cho việc phát triển đa dạng hóa sản phẩm giàu dinh dưỡng từ nông sản ĐBSCL (dứa) Việt Nam (sắn dây) nói chung CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Nguyên liệu sắn dây Phân loại khoa học Giới: Plantae Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Fables Họ: Faboideae Tơng: Phaseoleae Chi: Pueraria Lồi: P thomsonii Tên gọi khác: cát căn, cam cát căn, phấn cát căn, bạch cát, củ sắn dây (cách gọi người Thái) khau cát (cách gọi người Tày) 2.1.1 Nguồn gốc nơi trồng Chi Sắn dây (Pueraria DC) thuộc họ Đậu (Fabaceae), phân họ Đậu (Faboideae) thuộc tông Phaseoleae, số chi đặc trưng họ Đậu với nốt sần rễ cộng sinh với vi khuẩn cố định đạm Pueraria DC chi nhỏ, gồm loài dây leo quấn, phân bố chủ yếu vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Châu Á (có 16 lồi), Việt Nam có lồi Một số lồi có rễ củ, nhiều tinh bột, dùng làm thực phẩm hay dược phẩm, vài loài khác có tác dụng che phủ đất, lấy làm thức ăn cho gia súc Cá biệt có lồi P tuberisa (Roxb.ex Willd) DC mọc Nepal, Pakistan Ấn Độ, rễ củ có độc, thường dùng để thuốc cá Sắn dây loài chi Sắn dây thường có thân leo khỏe, chí dây leo, gặp dạng bụi Chúng lớn lên nhiều cách, hầu hết lồi có thân bao phủ nhiều lơng ngắn, cho phép bò lan mặt đất, leo lên bụi, kiến trúc nhân tạo Một số lồi thuộc chi Sắn dây tăng trưởng lên đến 30 cm/ngày, đạt 1830 m mùa Tất loài lâu năm, khơng phải tất lồi sắn dây tái sinh nhờ gốc Hầu hết lồi có mọc so le gồm chét nguyên xẻ thùy Cụm hoa hình chùm mọc kẻ gồm nhiều loại hoa màu xanh tím, có mùi thơm Quả giáp dẹt, màu vàng nhạt, có lơng mềm, thắt lại hạt (Kinjo et al., 1988) Sắn dây có nguồn gốc từ miền nam Nhật Bản miền đông nam Trung Quốc, trồng nhiều miền đông Châu Á, làm thuốc quan trọng quốc gia phương Đông mọc nhiều nơi giới như: miền Đông Bắc nước Úc, vùng cô lập miền Bắc nước Ý chung quanh hồ Maggiore, đặc biệt phát triển tốt miền nam nước Mỹ số nước khác có Việt Nam lượng enzyme cần sử dụng để giải phóng µmol đường khử phút điều kiện phản ứng (Le Quang Tri et al., 2009) Dựa vào đường chuẩn glucose xác định số lượng đường khử giải phóng hoạt tính enzyme xác định theo cơng thức: í ℎ( a: Nồng độ glucose suy từ đường chuẩn (µmol/mL) V: Tổng thể tích mẫu thực phản ứng (1,5 mL) k: Độ pha loãng v: Thể tích enzyme sử dụng (150 µL) t: Thời gian phản ứng (10 phút) Bảng PL 2: Xây dựng đường chuẩn glucose Xác định độ ẩm theo AOAC 934.06 (phương pháp sấy khô đến khối lượng không đổi) Nguyên lý: dùng nhiệt làm bay hết nước sản phẩm, cân trọng lượng thực phẩm trước sau sấy khơ, từ tính phần trăm nước có thực phẩm Tiến hành Lấy cốc nắp sấy nhiệt độ 105 C đến khối lượng không đổi (khoảng giờ), để nguội bình hút ẩm, cân xác định khối lượng cốc khơ (tính ln nắp) Sau cho vào cốc khoảng 5-10 g mẫu nghiền nhỏ, cân tất cân phân tích với độ xác Đặt cốc vào tủ sấy nhiệt độ 60-80 C 30 phút Sau nâng dần nhiệt độ đến 105 C sấy Đậy nắp lại, lấy mẫu ra, để nguội bình hút ẩm, đem cân Tiếp tục sấy thêm 30 phút nhiệt độ 105 C, lấy để nguội bình hút ẩm cân Cứ lặp lại trọng lượng không đổi Kết lần cân liên tiếp sau khơng cách q 0,001g Tính kết =1 − × 100% 1− x: Hàm lượng ẩm mẫu (%) G: Khối lượng cốc (g) G1: Khối lượng cốc mẫu trước sấy (g) G2: Khối lượng cốc mẫu sau sấy (g) Sai lệch lần xác định song song không lớn 5% Kết cuối trung bình cộng lần xác định song song Xác định tổng hàm lượng chất khơ hịa tan Sử dụng khúc xạ kế Atago (xuất xứ Nhật, có thang đo – 32 Bx) Xác định hàm lượng đường khử (phương pháp Miller, 1959) Nguyên tắc Có vài tác nhân sử dụng để định lượng đường nhờ đặc tính khử đường 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) có màu vàng dung dịch kiềm bị khử thành acid 3-amino-5nitrosalicylic có màu đỏ cam Phương pháp dựa sở phản ứng tạo màu đường khử với thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS) Cường độ màu hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử phạm vi định So màu tiến hành bước sóng 540 nm, dựa theo đồ thị đường chuẩn maltose tinh khiết với thuốc thử DNS tính hàm lượng đường khử mẫu nghiên cứu Phương trình phản ứng tạo màu đường khử thuốc thử acid DNS: Hình PL 1: Sơ đồ phản ứng đường khử DNS Cách pha DNS Cân g DNS pha 100 mL NaOH N, thêm 250 mL nước cất 150 g muối kali natri tartrate, đun nhẹ định mức 500 mL Chỉ pha thuốc thử DNS dùng cho phản ứng trước sử dụng, dung dịch DNS đựng lọ thủy tinh màu sẫm Chuẩn bị dung dịch thí nghiệm Mẫu sau thủy phân enzyme β-amylase lọc, pha loãng tiến hành xác định đường khử Hút mL dung dịch mẫu có chứa đường vào ống nghiệm, thêm vào mL thuốc thử DNS Dùng miếng nilon bịt kín đầu ống nghiệm, đặt vào cốc nước sơi phút Làm lạnh nhiệt độ phòng đo độ hấp thu OD bước sóng 540 nm Ống đối chứng gồm nước cất DNS Chú ý tất ống nghiệm phải làm lạnh nhiệt độ phịng trước đo độ hấp thu nhạy cảm với nhiệt độ Dựa vào đồ thị đường chuẩn maltose suy nồng độ đường khử có dung dịch thí nghiệm Dựng đồ thị chuẩn maltose Cân xác 0,1 g maltose hịa tan thành 100 mL với nước cất, sử dụng bình định mức Lập đồ thị chuẩn: lấy ống nghiệm, đánh số thứ tự từ – 6, sau cho vào ống nghiệm chất tham gia phản ứng sau: Bảng PL 3: Bảng pha dung dịch xác định đồ thị chuẩn STT Dùng miếng nilon bịt kín đầu ống nghiệm, đặt vào cốc nước sôi phút Làm lạnh nhiệt độ phòng đo độ hấp thu OD bước sóng 540 nm Dùng ống nghiệm đối chứng để chuẩn độ truyền suốt 100% Chú ý tất ống nghiệm phải làm lạnh nhiệt độ phịng trước đo độ hấp thu nhạy cảm với nhiệt độ Vẽ đồ thị biểu diễn biến thiên nồng độ đường độ hấp thu OD bước sóng 540 nm Vẽ đường chuẩn maltose với trục tung mật độ quang, trục hoành nồng độ maltose Xác định hàm lượng đường tổng (TCVN 4594-88) Nguyên lý: Chiết đường tổng số từ mẫu nước nóng, dùng acid clohydric thủy phân thành đường glucose, lượng glucose xác định qua phản ứng với dung dịch pheling, sắt (III) sunphate kali pemanganat Xử lý mẫu: Đối với nguyên liệu chứa nhiều tinh bột hay inulin (khoai lang, sắn, khoai tây), o trích ly đường rượu 70÷80 Đun cách thủy hỗn hợp bình có lắp ống sinh hàn Cân 5-20 g mẫu cho vào bình cầu, tráng kỹ cốc cân cồn, lượng cồn cho vào bình khoảng ½ thể tích Trong trường hợp khơng cần kết tủa protein lượng protein chuyển vào dung dịch không đáng kể Lọc qua giấy lọc gấp nếp, thu dịch lọc vào bình định mức 500 mL, rửa kỹ kết tủa, thêm nước cất đến vạch mức, lắc kỹ Hút 50-100 mL dịch lọc chuyển vào bình cầu 250 mL thêm 15 mL acid clohydric đặc, đun cách thủy có lắp ống sinh hàn 15 phút lấy để nguội Trung hòa dung dịch mẫu NaOH 30% thử giấy thị Chuyển toàn dịch mẫu vào bình định mức 250 mL, thêm nước cất đến vạch, lắc kỹ Hút 10-25 mL dung dịch mẫu vào bình tam giác 250 mL, cho vào bình hỗn hợp gồm 25 mL dung dịch pheling A 25 mL dung dịch pheling B, lắc nhẹ, đặt bếp điện có lưới amiăng đun phút kể từ lúc sôi Để nguội bớt lắng kết tủa đồng oxit Gạn bỏ lớp nước bên lọc lấy kết tủa, ý để lúc mặt kết tủa có lớp dung dịch hay nước cất Rửa kỹ kết tủa nước cất nóng, chuyển phễu lọc chứa kết tủa sang bình tam giác khác hịa tan kết tủa 10-20 mL dung dịch sắt (III) sulphate 5% Chuẩn độ lượng sắt (II) hình thành bình tam giác dung dịch kali pemanganat 0,1 N dung dịch có mầu hồng sẫm bền vững phút Ghi số mL kalipemanganat 0,1 N dùng Tra bảng Bectrand số mg glucose tương ứng, Hàm lượng đường tổng X (%): a: Số mg glucose tương ứng, g V1: Thể tích bình định mức trích ly đường, 500 mL V3: Thể tích bình định mức sau thủy phân, 250 mL m: Khối lượng mẫu, g V: Thể tích mẫu lấy để thủy phân, mL V2: Thể tích mẫu lấy để thực phản ứng pheling, mL Xác định hàm lượng tinh bột (TCVN 4594-88) Hàm lượng tinh bột mẫu hiệu số hàm lượng glucid tổng số hàm lượng đường tổng số xác định theo phương pháp Bectrand nhân với hệ số 0,9 Xác định hàm lượng glucid tổng số: Cân 5-20 g mẫu, chuyển toàn vào bình cầu 250 mL, tráng kỹ cốc cân nước cất, lượng nước cho vào bình khoảng 100-150 mL Thêm 25 mL acid clohydric đặc vào bình mẫu, đun cách thủy bếp có lắp ống sinh hàn Lấy bình làm nguội, trung hịa mẫu NaOH 30%, lọc, định mức 250 mL Hút 5-25 mL dịch lọc, chuyển vào bình tam giác dung tích 250 mL, thêm vào bình 50 mL hỗn hợp pheling A, B tiếp tục đun, lọc, hòa tan chuẩn độ hàm lượng đường tổng Ghi số mL kali pemanganat 0,1 N dùng Hàm lượng glucid tổng X (%): a: Số mg glucose tương ứng, g V1: Thể tích bình định mức, 250 mL m: Khối lượng mẫu, g V: Thể tích mẫu lấy để thực phản ứng pheling, mL Hàm lượng tinh bột X(%): =( − 2) × 0,9 Hàm lượng amylose Hàm lượng amylose xác định cách đo màu tinh bột tạo phức với iodine theo phương pháp chuẩn Juliano cs (1971) có điều chỉnh Cân xác mg bột sắn dây, thêm vào 20 μL ethanol 180 μL NaOH N, hồ hóa phút Bổ sung nước cất để mL, hút 0,2 mL hỗn hợp dịch tinh bột, thêm 40 μL CH 3COOH, 80 μL Lugol, 3680 μL nước cất để mL dung dịch Cho vào cuvette mL, để ổn định 20 phút đo quang bước sóng 680 nm Từ giá trị đo quang thu dựa vào đường chuẩn amylose xác định % amylose có mẫu Hàm lượng amylopectin % amylopectin = - % amylose 10 Hàm lượng ethanol (TCVN 5562-2009, phương pháp dùng bình tỷ trọng) Nguyên lý: Chưng cất lượng mẫu cân sẵn để tách ethanol Xác định tỷ trọng dịch cất bình tỷ trọng Tra bảng tỷ trọng hỗn hợp ethanol-nước để xác định hàm lượng ethanol Chuẩn bị bình tỷ trọng: Bình tỷ trọng rửa cẩn thận hỗn hợp sulfocromic, sau rửa nhiều lần nước, tráng rượu hỗn hợp rượu-ete Rửa tráng nước cất, sau sấy nhiệt độ 70°C đến 80°C h đến thu khối lượng không đổi (m1) Cho nước cất 20°C đến đầy bình tỷ trọng cân (m2) Tiến hành chưng cất: Cân 100 g ± 0,1 g mẫu rượu cho vào bình cầu Thêm khoảng 200 mL nước cất, đồng thời cho khoảng 50 mL nước cất vào bình hứng Kiểm tra độ kín hệ thống chưng cất lượng nước làm lạnh Đun nhẹ bình chưng cất (khơng cho bọt trào qua bầu bảo hiểm) Khi bình chưng cất bắt đầu sơi tăng dần nhiệt độ Nhiệt độ nước làm lạnh đầu không vượt 25°C Tiến hành chưng cất với tốc độ đều, thể tích bình hứng đạt khoảng 90 mL khoảng thời gian 30 phút đến 60 phút Đặt bình hứng hỗn hợp nước đá để làm lạnh Kết thúc chưng cất, tráng rửa đầu cuối ống sinh hàn nước cất thêm nước vào bình hứng cho vừa đủ 100 g Nếu khối lượng dịch cất 100 g phải tính hệ số hiệu chỉnh Giữ dịch cất sau cân 20°C±0,5°C khoảng 30 phút Xác định tỷ trọng dịch cất: Rót dịch cất vào bình tỷ trọng tráng từ lần đến lần dịch cất điều chỉnh đến 20°C.Rót nhẹ theo thành bình để tránh tạo thành bọt khí Rót đầy đến miệng bình, đậy nút bình tỷ trọng Dùng giấy lọc vải mềm lau khơ tồn phía ngồi bình Chỉ cần lau cổ bình để tránh làm thay đổi nhiệt độ dung dịch bình, đặt bình vào buồng cân cân (m3) Khi cân phải bảo đảm nhiệt độ dung dịch bình tỷ trọng 20°C±0,5°C o Tỷ trọng tương đối (d20/20 C) tính theo cơng thức: d m1 m2 m3 khối lượng bình tỷ trọng, tính gam khối lượng bình tỷ trọng với nước 20°C, tính gam khối lượng bình tỷ trọng dịch cất 20°C, tính gam Từ tỷ trọng tương đối ,tra bảng xác định hàm lượng ethanol tính % khối lượng Nếu khối lượng dịch cất khơng 100 g kết nhân với hệ số hiệu chỉnh k tính theo cơng thức sau: k  m D m B mD khối lượng dịch cất, tính gam; mB khối lượng mẫu, tính gam Kết cuối giá trị trung bình cộng lần xác định song song Chênh lệch kết hai lần xác định song song không vượt 0,06 % 11 Số tế bào nấm men, xác định cách đếm trực tiếp buồng đếm hồng cầu Lắc mạnh dịch huyền phù tế bào, nhỏ giọt lên bề mặt buồng đếm kề với cạnh kính nhờ pipet Dịch huyền phù vào buồng đếm nhờ chế mao dẫn Di chuyển nhẹ nhàng khung đếm để dịch huyền phù tràn đầy khoang Đặt buồng đếm vào bàn kính hiển vi để yên vài phút Trước tiên chỉnh kính hiển vi với vật kính x10 sau thấy ô buồng đếm chỉnh đến vật kính x40 để thấy rõ ràng tế bào lẫn đường kẻ Đếm số tế bào có vng lớn đại diện Hình PL 2: Cách đếm số tế bào nấm men buồng đếm Số lượng tế bào mL mẫu nghiên cứu: n N = [(a/b) x 400/0,1] x 10 x 10 a:số lượng tế bào nấm men ô vuông lớn (80 ô vuông nhỏ) b: số ô vuông nhỏ ô vuông lớn 400: tổng số ô vuông nhỏ ô trung tâm 0,1: thể tích dịch tế bào (tính mm ) chứa ô trung tâm 3 10 : số chuyển mm thành mL n 10 : độ pha loãng mẫu 12 Xác định hàm lượng puerarin Hàm lượng puerarin xác định theo phương pháp Zhao et al., 2014) có điều chỉnh Hàm lượng puerarin ngun liệu: Sử dụng sóng siêu âm để trích ly puerarin nguyên liệu (bột sắn dây) theo phương pháp Wu et al (2011) điều kiện tối ưu: nồng độ ethanol 71,35%, thời gian trích ly 49,08 phút, tỷ lệ nguyên liệu:dung môi: 21,72 (mL/g), tần số 40 kHz Mẫu sau trích ly pha lỗng xác định hàm lượng puerarin Hàm lượng puerarin dịch thủy phân: dịch đường thu sau trình thủy phân lọc qua giấy lọc membrane (0,45 μm), pha loãng xác định hàm lượng puerarin Sử dụng thiết bị HPLC để phân tích hàm lượng puerarin có mẫu Mẫu trước bơm vào thiết bị HPLC lọc qua đầu lọc Syringe Filter (đường kính 13 mm, kích thước lỗ lọc 0,45 μm) 10 μL dịch bơm vào thiết bị HPLC (Hitachi, Nhật Bản) với hệ thống bơm tự động Sử dụng cột sắc ký C18 (250 mm x 4,6 mm, μm), pha động gồm hỗn hợp methanol:nước (55:45) với tốc độ dịng chảy 0,8 mL/phút đo bước sóng 250 nm để xác định hàm lượng puerarin ( A: Nồng độ puerarin suy từ đường chuẩn (μg/mL) V: Thể tích dịch lọc (mL) n: Độ pha lỗng g: Khối lượng mẫu (g) Bảng PL 4: Xây dựng đường chuẩn puerarin 13 Phương pháp đánh giá cảm quan theo TCVN 3215-79  Phương pháp cảm quan cho điểm theo mức độ yêu thích Các mẫu thực theo trật tự ngẫu nhiên mã hóa chữ số, người thử thử nếm mẫu theo thứ tự từ trái sang phải cho biết mức độ yêu thích họ mẫu theo thang điểm Hedonic từ đến vào phiếu đánh giá cảm quan Các mức độ yêu thích tăng dần từ đến (1 – khơng thích nhiều, – khơng thích, – thích, – thích nhiều, – thích nhiều) Số lượng cảm quan viên 10 người Mỗi mẫu ứng với phiếu đánh giá (phụ lục 2.1)  Phương pháp cho điểm theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 3215 – 79 Các mẫu thực theo trật tự ngẫu nhiên mã hóa chữ số, người thử thử nếm mẫu theo thứ tự từ trái sang phải cho biết mức độ yêu thích họ mẫu với tiêu màu sắc, mùi, vị, trạng thái quy định bảng hướng dẫn đánh giá chất lượng sản phẩm (phụ lục PL 5) theo thang điểm từ đến vào phiếu đánh giá cảm quan Các mức độ chất lượng tăng dần từ đến Số lượng cảm quan viên 10 người Mỗi mẫu ứng với phiếu đánh giá (phụ lục PL 5) Bảng PL 5: Bảng điểm đánh giá cảm quan theo TCVN 3215 – 79 Chỉ Trọ tiêu s Độ trong, màu sắc Mùi Vị Phụ lục 2: CÁC BẢNG SỐ LIỆU THỐNG KÊ Ảnh hưởng nồng độ chất ANOVA Table for Duong khu by Nong co chat Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for Duong khu by Nong co chat Method: 95.0 percent LSD Ảnh hưởng pH đến hàm lượng đường khử tạo thành ANOVA Table for Duong khu by pH Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for Duong khu by pH Method: 95.0 percent LSD Tối ưu hóa q trình thủy phân tác dụng β-amylase Analysis of Variance Source Model Residual Total (Corr.) Analysis of Variance for Duong khu Source A:Nhiet B:Thoi gian C:Nong AA AB AC BB BC CC blocks Lack-of-fit Pure error Total (corr.) R-squared = 98.8158 percent R-squared (adjusted for d.f.) = 98.5113 percent Standard Error of Est = 1.60768 Mean absolute error = 1.2153 Durbin-Watson statistic = 2.0407 (P=0.3997) Lag residual autocorrelation = -0.0252818 The StatAdvisor This pane displays the regression equation which has been fitted to the data The equation of the fitted model is 10 Duong khu = -520.813 + 21.5708*Nhiet + 16.9202*Thoi gian + 2.8513*Nong - 0.205667*Nhiet do^2 + 0.00129995*Nhiet do*Thoi gian + 0.0187132*Nhiet do*Nong - 1.74789*Thoi gian^2 - 0.052651*Thoi gian*Nong 0.0439538*Nong do^2 Optimize Response Goal: maximize Duong khu Optimum value = 160.225 Factor Nhiet Thoi gian Nong Mơ hình lược bỏ tương tác nhiệt độ-thời gian Multiple Regression - Ham luong duong khu Dependent variable: Ham luong duong khu Independent variables: Nhiet Nong Thoi gian Nhiet do*Nhiet Nong do*Nong Thoi gian*Thoi gian Nhiet do*Nong Nong do*Thoi gian Parameter CONSTANT Nhiet Nong Thoi gian Nhiet do*Nhiet Nong do*Nong Thoi gian*Thoi gian Nhiet do*Nong Nong do*Thoi gian Analysis of Variance Source Model Residual Total (Corr.) R-squared = 98.6709 percent R-squared (adjusted for d.f.) = 98.3755 percent Standard Error of Est = 1.78153 Mean absolute error = 1.26565 Durbin-Watson statistic = 1.79296 (P=0.2245) Lag residual autocorrelation = 0.0912349 The StatAdvisor The output shows the results of fitting a multiple linear regression model to describe the relationship between Ham luong duong khu and independent variables The equation of the fitted model is Ham luong duong khu = -521.099 + 21.576*Nhiet + 2.8513*Nong + 16.9917*Thoi gian - 0.205667*Nhiet do*Nhiet - 0.0439538*Nong do*Nong - 1.74789*Thoi gian*Thoi gian + 0.0187132*Nhiet do*Nong - 0.052651*Nong do*Thoi gian Ảnh hưởng pH đến hàm lượng puerarin tổng hợp ANOVA Table for puerarin by pH Source Between groups Within groups Total (Corr.) Multiple Range Tests for puerarin by pH Method: 95.0 percent LSD 11 Tối ưu hóa q trình tổng hợp puerarin tác dụng BSMA Analysis of Variance Source Model Residual Total (Corr.) Analysis of Variance for Puerarin Source A:Nhiet B:Thoi gian C:Nong AA AB AC BB BC CC blocks Lack-of-fit Pure error Total (corr.) R-squared = 96.0209 percent R-squared (adjusted for d.f.) = 94.9977 percent Standard Error of Est = 0.0301207 Mean absolute error = 0.0246634 Durbin-Watson statistic = 2.17873 (P=0.5727) Lag residual autocorrelation = -0.0901671 The StatAdvisor This pane displays the regression equation which has been fitted to the data The equation of the fitted model is Puerarin = 1.59074 + 0.129549*Nhiet + 0.32109*Thoi gian + 0.197767*Nong - 0.00116001*Nhiet do^2 0.000426667*Nhiet do*Thoi gian + 0.000357167*Nhiet do*Nong - 0.0483066*Thoi gian^2 + 0.00614*Thoi gian*Nong - 0.00786672*Nong do^2 Optimize Response Goal: maximize Puerarin Optimum value = 7.49238 Factor Nhiet Thoi gian Nong Mơ hình lược bỏ tương tác nhiệt độ-thời gian, nhiệt độ-nồng độ Multiple Regression - Puerarin Dependent variable: Puerarin Independent variables: Nhiet Nong Thoi gian Nhiet do*Nhiet Nong do*Nong Thoi gian*Thoi gian Nong do*Thoi gian Parameter CONSTANT 12 Nhiet Nong Thoi gian Nhiet do*Nhiet Nong do*Nong Thoi gian*Thoi gian Nong do*Thoi gian Analysis of Variance Source Model Residual Total (Corr.) R-squared = 95.4382 percent R-squared (adjusted for d.f.) = 94.5752 percent Standard Error of Est = 0.0361529 Mean absolute error = 0.0259845 Durbin-Watson statistic = 2.28017 (P=0.7633) Lag residual autocorrelation = -0.140872 The StatAdvisor The output shows the results of fitting a multiple linear regression model to describe the relationship between Puerarin and independent variables The equation of the fitted model is Puerarin = 1.38994 + 0.133199*Nhiet + 0.217411*Nong + 0.297624*Thoi gian - 0.00116001*Nhiet do*Nhiet 0.00786672*Nong do*Nong - 0.0483066*Thoi gian*Thoi gian + 0.00614*Nong do*Thoi gian 13 ... Với công dụng, nhu cầu điều kiện thực tế trên, ? ?Nghiên cứu công nghệ tổng hợp phức chất puerarin? ? ?maltose enzyme maltogenic amylase ứng dụng sản xuất nước uống lên men từ sắn dây dứa? ?? tạo loại nước. .. trình tổng hợp phức chất puerarin- maltose từ sắn dây: chọn thông số tối ưu (pH, nhiệt độ, thời gian nồng độ enzyme) trình thủy phân tinh bột sắn dây tác dụng enzyme β -amylase trình tổng hợp phức chất. .. độ lên men, tỷ lệ nấm men) để lên men hỗn hợp nước sắn dây chế biến trước (có chứa phức chất puerarin- maltose) nước ép trái dứa tạo nên loại nước uống chứa puerarin giàu vitamin 1.3 Nội dung nghiên