Xác định mật số và khả năng chịu muối mật của vi khuẩn probiotic trong các sản phẩm men vi sinh sử dụng trong chăn nuôi

DINH DƯỠNG VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI ĂN CHĂN NUÔI DINH DƯỠNG VÀ THỨC XÁC ĐỊNH MẬT SỐ VÀ KHẢ NĂNG CHỊU MUỐI MẬT CỦA VI KHUẨN PROBIOTIC TRONG CÁC SẢN PHẨM MEN VI SINH SỬ DỤNG TRONG CHĂN NUÔI Lê Ngọc Mẫn1, Trần Văn Bé Năm2, Lê Minh Thành2, Lưu Huỳnh Anh2, Phạm Thị Ngọc Yến2, Trịnh Thị Hồng Mơ3, Trần Hoàng Diệp1 Nguyễn Trọng Ngữ1* Ngày nhận báo: 21/3/2022 - Ngày nhận phản biện: 05/4/2022 Ngày báo chấp nhận đăng: 21/4/2022 TÓM TẮT Nghiên cứu tiến hành với mục tiêu xác định mật số khả chịu muối mật vi khuẩn Lactobacillus acidophilus nấm men Saccharomyces cerevisiae hữu sản phẩm men vi sinh thị trường Từ 20 sản phẩm men vi sinh, ghi nhận chủng thuộc chi Lactobacillus, chủng thuộc chi Bacillus, chủng thuộc chi Bifidobacterium chủng thuộc chi Saccharomyces, cịn lại lồi Aspergillus oryzae Đánh giá mật số Lactobacillus acidophilus Saccharomyces cerevisiae sản phẩm thu thập, kết cho thấy số lượng lồi giảm (11,4-42,6%) so với thơng tin ghi bao bì Về khả chịu muối mật, lồi có khả sống phát triển tốt môi trường muối mật 0,3% Như vậy, sau thời gian 7-9 tháng sản phẩm men vi sinh lưu hành thị trường, mật số vi khuẩn Lactobacillus acidophilus nấm men Saccharomyces cerevisiae giảm đặc điểm probiotic quan trọng khả chịu muối mật ổn định Từ khóa: Chế phẩm, muối mật, Lactobacillus acidophilus, Saccharomyces cerevisiae ABSTRACT Determination of density and bile salt tolerance of probiotic bacteria in commercial products used for animal production The present study was conducted with the objective of determining the density and tolerance to bile salts of Lactobacillus acidophilus and Saccharomyces cerevisiae yeast present in probiotic products on the market From 20 probiotic products, strains of the genus Lactobacillus, strains of the genus Bacillus, strains of the genus Bifidobacterium and strain of the genus Saccharomyces were recorded, and the remaining species was Aspergillus oryzae The results of assessing the density of Lactobacillus acidophilus and Saccharomyces cerevisiae on products showed that the number of these two species decreased (11.4-42.6%) compared to the information stated on the package In terms of tolerance to bile salts, these two species were able to live and grow well in 0.3% bile salt environment Thus, probiotic products after 7-9 months being circulated on the market, the density of Lactobacillus acidophilus and Saccharomyces cerevisiae decreased, yet one of the important probiotic characteristics, the tolerance to bile salts, was relatively stable Keywords: Bile salt, Lactobacillus acidophilus, Probiotic, Saccharomyces cerevisiae ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện tại, việc sử dụng sản phẩm probiotic nhằm tăng cường sức khỏe cho máy tiêu hóa vật ni xem giải pháp hữu hiệu phổ biến Trên gia cầm, Trường Đại học Tiền Giang Trường Đại học Cần Thơ Trường Đại học Tây Đô *Tác giả liên hệ: PGS.TS Nguyễn Trọng Ngữ, Khoa Nông nghiệp, Trường Đại học Cần Thơ Điện thoại: 0989828295; Email: ntngu@ctu.edu.vn KHKT Chăn nuôi số 278 - tháng năm 2022 số nghiên cứu ứng dụng thành công chế phẩm probiotic mang lại hiệu tích cực đến tốc độ tăng trưởng gà thịt (Lei ctv, 2015; Ahiwe ctv, 2021), kiểm soát bệnh đường ruột, ngăn ngừa viêm ruột hoại tử (Jayaraman ctv, 2013), kiểm soát bệnh cầu trùng (Dalloul ctv, 2003) Bên cạnh đó, việc ứng dụng probiotic chăn ni heo mang lại nhiều thành công cải thiện tốc độ sinh trưởng giảm tiêu tốn thức ăn 35 DINH DƯỠNG VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI heo cai sữa (Kantas ctv, 2015), heo tăng trưởng (Meng ctv, 2010) giảm chi phí thức ăn (Phan Kim Đăng ctv, 2016) Ngoài ra, sản phẩm probiotic góp phần xử lý mơi trường chăn ni giúp vật ni tăng trưởng tốt (Đồn Thị Vân ctv, 2021) Công bố Gorobets ctv (2021) cho thấy chế phẩm probiotic giúp heo tăng trọng cao nhóm đối chứng giai đoạn 48 đến 148 ngày tuổi Với vai trò quan trọng trên, thị trường Việt Nam sản phẩm probiotic đa dạng thành phần chủng, loài từ nhiều nguồn phân lập khác Tuy nhiên, trình lưu hành, ảnh hưởng nhiều yếu tố, đặc biệt khâu bảo quản thời gian bảo quản, mật số đặc điểm probiotic nhóm vi sinh vật có mặt sản phẩm bị ảnh hưởng Nghiên cứu tiến hành nhằm khảo sát thành phần vi sinh thường sử dụng, số lượng khả chịu muối mật nhóm vi khuẩn probiotic phổ biến sản phẩm men vi sinh sử dụng chăn nuôi gia súc, gia cầm VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Thu thập xử lý mẫu Tổng cộng 20 sản phẩm (SP) sử dụng để ghi nhận tần số chủng vi sinh vật sử dụng Các SP thu thập cửa hàng đại lý bán lẻ địa bàn Thành phố Cần Thơ tỉnh Vĩnh Long Đa số SP có hạn sử dụng 24 tháng, ngoại trừ SP1 SP3 có hạn dùng 12 tháng SP4 có hạn dùng 18 tháng Thời điểm phân tích mẫu dao động 7-9 tháng sau SP lưu hành thị trường 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phân lập, định danh Lactobacillus acidophilus nấm men Saccharomyces cerevisiae Quy trình phân lập vi khuẩn Lactobacillus acidophilus (L acidophilus) nấm men Saccharomyces cerevisiae (S cerevisiae) thực theo phương pháp Weiss ctv (2005) Quy trình lập lại nhiều lần cho 36 đến thu khuẩn lạc rời có hình dạng, kích thước màu sắc đồng Vi khuẩn nấm men giữ giống ống Eppendorf 2ml chứa môi trường NB lỏng, nhiệt độ 8°C Định danh sơ L acidophilus thông qua kiểm tra khả di động nhuộm Gram (Cao Ngọc Điệp Nguyễn Hữu Hiệp, 2008) 2.2.2 Hình thái vi khuẩn L acidophilus nấm men S cerevisiae Quan sát kính hiển vi xác định vi khuẩn gram dương bắt màu tím hay xanh đen Crystaviolet vi khuẩn gram âm bắt màu hồng Safra (Weiss ctv, 2005) Đối với nấm men, quan sát kính hiển vi xác định S cerevisiae có hình dạng trịn đều, nhơ, có màu trắng đục đồng (Lương Đức Phẩm, 2006) 2.2.3 Mật số vi khuẩn L acidophilus nấm men S cerevisiae Sản phẩm probiotic thương mại cân dẫn bao bì sản phẩm hịa tan với 9ml nước cất vô trùng ống nghiệm, lắc cho chế phẩm tan hồn tồn Pha lỗng mẫu với nồng độ khác nhau, ủ mẫu 37°C cho khuẩn lạc phát triển Chọn mức pha lỗng có số lượng khuẩn lạc rời rõ để đếm số khuẩn lạc, khuẩn lạc phát triển từ tế bào vi khuẩn, từ đếm khuẩn lạc xác định mật số vi khuẩn nấm men mức pha lỗng tương ứng, từ xác định mật số ban đầu (Hoben Somasegaran, 1982) 2.2.4 Khả chịu muối mật L acidophilus nấm S cerevisiae Thí nghiệm tiến hành theo phương pháp Gilliland ctv (1984) nồng độ muối mật 0,3% Các dịng vi khuẩn, nấm ni tăng sinh môi trường lỏng NB, lắc máy lắc với tốc độ 120 vòng/ phút 37°C sau 24 đến 36 Sau mang dịch tăng sinh đo OD (108 cfu/ml) với bước sóng 600 nm Tiếp theo hút 1,5 ml dung dịch chứa dòng vi khuẩn, nấm đo OD cho vào Eppendorf ml (mỗi mẫu ống Eppendorf tương ứng với bốn khung 0h, 1h, KHKT Chăn nuôi số 278 - tháng năm 2022 DINH DƯỠNG VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI 2h, 3h) tiến hành ly tâm 2.000 vòng/phút 15 phút 4°C để thu cặn, hút 1,5 ml nước cất vô trùng cho vào Eppendorf để rửa tế bào, thu cặn, nuôi cấy đếm mật số 2.3 Phương pháp xử lý số liệu Số liệu tổng hợp xử lý phần mềm Microsoft Excel 2013 Minitab 16.0 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Các chủng vi sinh vật thường gặp men vi sinh Kết khảo sát 20 sản phẩm men vi sinh ghi nhận tất 13 chủng vi sinh vật bao gồm chủng thuộc chi Lactobacillus, chủng thuộc chi Bacillus, chủng thuộc chi Bifidobacterium chủng thuộc chi Saccharomyces, cịn lại lồi Aspergillus oryzae Trong đó, vi khuẩn L acidophilus nấm men S cerevisiae với xuất sản phẩm cao, 60, 55% số SP probiotic khảo sát (Hình 1) Kết phù hợp với nghiên cứu Nguyễn Thị Huyền ctv (2014) khảo sát 24 SP men vi sinh thị trường ghi nhận chủng thuộc chi L acidophilus chiếm 79,2% số SP probiotic thu được, hai chủng thuộc chi Streptococcus, chủng thuộc chi Bacillus Bacillus clausii, lại chủng Bifidobacterium spp nấm men S cerevisiae môi trường PDA cho thấy hầu hết phát triển tốt, khuẩn lạc quan sát rõ sau 12-24 ủ nhiệt độ 37°C Trong SP khảo sát, có sản SP vi khuẩn L acidophilus (SP1, SP2, SP3, SP4, SP5, SP6, SP7, SP8) cho thấy khuẩn lạc có hình dạng hình cầu, nhơ khỏi mặt agar có màu vàng nhạt Kết phù hợp với nghiên cứu Tô Minh Châu (2000), cho khuẩn lạc có hình cầu, nhơ cao có màu vàng nhạt đồng Bên cạnh đó, có SP chứa nấm men S cerevisiae ký hiệu SP2, SP3, SP4, SP5, SP6, SP7 cho thấy đồng dạng khuẩn lạc mọc trịn đều, nhơ có màu trắng đục, có hình oval đặc trưng với tỷ lệ 100% Kết phù hợp với nghiên cứu Hartwell (1974) quan sát hình thái nấm S cerevisiae ghi nhận có hình oval, điểm đặc trưng để nhận dạng dòng nấm men Ngoài ra, kết phù hợp với nghiên cứu Jermini Schmidt-Lorenz (1987) cho khuẩn lạc nấm men phân lập nấm men tự nhiên mơi trường PDA có hình trịn láng, trắng đục, bìa ngun mơ 3.3 Khả di động, kiểu bắt màu nhuộm Gram vi khuẩn L acidophilus 3.3.1 Khả di động Kết cho thấy 100% SP chứa vi khuẩn L acidophilus vi khuẩn khả di động Kết phù hợp với công bố Nguyễn Lân Dũng ctv (2000), tác giả cho rằng, vi khuẩn L acidophilus khơng có khả di động, chúng có khả bám dính tốt thành ruột nhằm cạnh tranh vi trí với vi khuẩn bất lợi khác 3.3.2 Kiểu bắt màu nhuộm Gram Hình Tần số xuất số chủng, loài vi sinh vật sử dụng làm probiotic 3.2 Hình thái vi khuẩn L acidophilus nấm S cerevisiae Kết khảo sát đặc điểm hình thái khuẩn lạc vi khuẩn L acidophilus KHKT Chăn nuôi số 278 - tháng năm 2022 Kết nhuộm Gram cho thấy 100% mẫu có chứa vi khuẩn bắt màu tím (Gram dương), hình que ngắn, kết chuỗi hay riêng lẻ Kết phù hợp với nghiên cứu Pyar Peh (2014), cho nhuộm vi khuẩn L acidophilus môi trường LB vi khuẩn Gram dương, hình que ngắn 37 DINH DƯỠNG VÀ THỨC ĂN CHĂN NUÔI 3.4 Khảo sát mật số vi khuẩn Lactobacilus acidophilus Bảng Số lượng vi khuẩn nhãn thực tế (cfu/g) SP SP1 SP2 SP3 SP4 SP5 SP6 SP7 SP8 Trên nhãn 1×108 2×108 6×1010 1×108 2×109 1×108 106‑109 5×1010 Thực tế 1,58×105 1,15×105 1,12×107 3,80×106 1,18×106 1,51×106 2,08×105 1,37×106 % giảm 35,0 39,0 34,6 17,8 34,7 22,8 11,4-40,9 42,6 Qua bảng cho thấy, tổng số SP khảo sát ghi nhận vi khuẩn sống mật số tất SP giảm so với thông tin ghi nhãn (11,4-42,6%) Trong đó, SP4 SP6 có thay đổi mật số L acidophilus thấp so với SP lại Kết nghiên cứu phù hợp với công bố Nguyễn Thị Huyền ctv (2014) khảo sát 24 SP men vi sinh thị trường dùng cho người Hà Nội Theo đó, vi khuẩn probiotic cịn sống tất chế phẩm có SP với số lượng vi khuẩn thấp nhiều so với công bố nhãn ngược lại, có 13 SP chứa nhiều chủng vi sinh vật so với chủng cơng bố nhãn Ngồi ra, nghiên cứu Nimrat Vuthiphandchai (2011) xác định 12 SP probiotic dùng cho thủy sản Thái Lan ghi nhận vi khuẩn chết dần trình lưu trữ bảo quản 3.5 Khả chịu muối mật L acidophilus Kết bảng ghi nhận tất SP chứa L acidophilus thể khả chịu muối mật tốt Trong đó, khả chịu muối mật tốt mốc thời gian cho thấy mốc thời gian T0 SP2 có mật số trung bình cao (9,56 log cfu/ml) (P≤0,001) Sau giờ, mật số trung bình vi khuẩn SP2 cao (8,26 log cfu/ml) (P≤0,001) Khi xét tính ổn định mốc thời gian T1-T3, SP4 có mật số trung bình tương đối tốt với giá trị 7,95; 7,65; 7,18 log cfu/ml Bảng Mật số vi khuẩn theo thời gian điều kiện có muối mật 0,3% SP SP1 SP2 SP3 SP4 SP5 SP6 SP7 SP8 P T0 4,43d±0,03B 9,56a±0,06A 4,83c±0,06C 5,83b±0,02D 4,39d±0,06C 4,73c±0,04D 4,43d±0,01D 4,44d±0,01D 0,000 Mật số trung bình vi khuẩn (log cfu/ml) T1 T2 4,55e±0,07B 4,74f±0,01A 6,70b±0,06C 9,75a±0,02A c A 5,71 ±0,04 5,78d±0,04A a A 7,95 ±0,00 7,65b±0,04B e C 4,44 ±0,02 4,91e±0,02B cd B 5,62 ±0,06 6,49c±0,02A 5,53cd±0,04B 4,81ef±0,03A 5,45d±0,03B 4,83ef±0,03C 0,000 0,000 T3 4,83f±0,02A 8,26a±0,02B 5,10e±0,02B 7,18b±0,00C 6,69c±0,03A 5,08e±0,06C 4,92f±0,03C 6,16d±0,04A 0,000 P 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 Ghi chú: Các giá trị cột với chữ a, b, c, d hàng với chữ A, B, C, D khác khác biệt có ý nghĩa mức P