KHOA HỌC CÔNG NGHỆ NGHIÊN CỮU CHÊ TẠO CHÊ PHẨM NHŨ TUÔNG NANO TÙ TINH DẦU LÁ TRẤU KHÙNG [Piper betle L.) ÚNG DỤNG PHÒNG BỆNH HOẠI TÙ GAN TỤY CẤP TÍNH AHPND DTƠM Mai Thị Minh Ngọc1’ *, Nguyễn Thị Thu Hiền1, Vũ Thị Bích Huyền1 2, Bùi Thị Hải Hịa1, Lê Minh Hải3* TĨM TẮT Lá trầu khơng vớ hoạt tính kháng khuẩn mạnh sử dụng rộng rãi để phòng bệnh cho người động vật nuôi Nhghièn cứu thực chế tạo chế phẩm nhũ tương nano tinh dầu trầu không để phịng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính (Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease: AHPND) tôm vi khuẩn V parahat molyticus gây nên Chế phẩm tạo thành điều kiện tỷ lệ tinh dầu: chất hoạt động bề mặt: nước 6:12: 82, thời gian siêu âm 20 phút Với lượng nhũ tưong sử dụng hàng ngày 150 ml/kg thức ăn, tiêu riiền dịch tăng cao nhất, tương ứng 62,91xl06 tế bào/ml máu, 219,60 mg protein tổng số/ml huyết thaih, hiệu giá ngưng kết huyết 240 Đánh giá khả ức chế vi khuẩn V parahaemoỉyticur phương pháp khuếch tán thạch cho kết quả: nhũ tương nano tinh dầu trầu khơng tạo vùng íc chế có đường kính 22,1-22,25 mm, tinh dầu tạo vùng ức chế 17,6-18,1 mm Thử nghiệm hiệu nhũ tương nano cho thấy: Tỷ lệ sống sót tơm gây nhiễm với chủng vi khuẩn V parahaemolyticus V.HOU.01, V.HOU.02, V.HOU.03 bể sử dụng nhũ tương so với bể đối chứng dương tăng tương ứng 62-56% Kết nghiên cứu bước đầu kết luận nhũ tương nano tinh dầu trầu khơng khơn, ỉ có tác dụng phòng bệnh vi khuẩn V parahaemolyticus gây nên mà cịn kích thích tăng trưởng, tăng cường hiệu sử dụng thức ăn Từ khóa: Lá trẩu khơng, nhũ tương nano, bệnh hoại tửgan tụy cấp tính AHPND, V parahaemolyticus, tôm DAT VÁNĐÉ Cây trầu không I Piper betle L.) thuộc họ hồ tiêu Piperaceae, tinh dầu tách chiết từ trầu khơng có chứa thành phần chủ yếu phenolic terpenoid, họp chát quan trọng, có hoạt tính khử trùng kháng khuẩn hydroxychavicol, chavibetol, eugenol allylpyrocatechol Trong lịch sử y học, trầu khơng phím sử dụng nghiên cứu rộng rãi Thói quen ăn trầu nhiều nước cho có tác dụng tránh miệng, làm nướu kích thích hệ tiêu hóa [1 2], Trong thực hành y học cổ truyền, ứng dụng trầu khơng có liên quan đến hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm, [3], làm nước súc miệng 4] điều trị vấn đề miệng, đau đầu, viêm khóp đau khóp [1], chữa bệnh ngồi da [5], Trường Đại học Mở EIà Nội Khoa Sinh học, Trườig Đại học Sư phạm Hà Nội Trường Đại học Vinh Email: minhngoccnsh(ặhou.edu.vn Việt Nam, trầu đến loại thuốc thảo dược có tác dụng sát khuẩn, tiêu viêm, long đờm, hạ sốt, điều trị ho, nhức đầu, hen suyễn, sát khuẩn vết thưong bên ngoài, bỏng, mụn nhọt, chàm [1, 5], Gần đây, trầu khơng chứng minh có khả ức chế hiệu loài vi khuẩn gây bệnh động vật thủy sản [ 1, 3, 4] Hiện nay, nhũ tưong nano nghiên cứu vói vai trị chất mang, kích thước nhũ tưong nano giúp tăng thòi gian lưu giữ thuốc sinh khả dụng hạn chế thất thuốc Nghiên cứu Swathy cs (2018) đề cập đến hiệu nhũ tưong nano tinh dầu hạt tiêu đen để phịng ngừa bệnh tơm sú (Penaeus monodorì) vi khuẩn Pseudomonas aeruginosa gây nên với giá trị MIC 0,234 pl/ml [6] Cũng tác giả chứng minh nhũ tưong nano tinh dầu neem mang lại hiệu phòng bệnh tốt cá chép {Cyprinus carpiị) đối vói vi khuẩn gây bệnh Aeromonas culicicolavóh MIC 0,93 pl/mL [7], Ravi cs (2019) thử nghiệm thành cơng khả phịng bệnh nhũ tưong nano tinh dầu neem NỊNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIEN nơng thơn - KỲ - THÁNG 6/2022 59 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ cá chêm (Lates calcarifef) gây nhiễm vi khuẩn Vibrio anguillarium [8] Một nghiên cứu khác Fatemeh cs (2020) chứng minh chế phòng bệnh nhũ tương nano tinh dầu oải hương {Lavandula officinalis) cá hồi vàn tâng cường hình thành tế bào máu thông số miễn dịch [9] Nghiên cứu thực nhằm mục đích tạo chế phẩm nhũ tương nano từ tinh dầu trầu không bước đầu thử nghiệm đánh giá hiệu điều trị bệnh hoại tử gan tụy cấp tính AHPND tơm NGUYÊN LIỆU VÀ PHUDNG PHÁP NGHIÊN cuu 2.1 Nguyên liệu - Lá trầu không thu hái từ tỉnh vùng đồng sông Hồng rửa sạch, phơi khô nghiền để tách tinh dầu - chủng vi khuẩn V parahaemolyticus V.HOU.01, V.HOU.02, V.HOU.03 phân lập từ tơm mắc bệnh hoại tử gan tụy cấp tính AHPND 2.2 Phương pháp 2.2.1 Phươngpháp tạo hạt nhũ tưongnano Quy trình tạo hạt nhũ tương nano gồm bước, cụ thể sau: Bước 1: Trộn tinh dầu, nước tween 80 với tỷ lệ tinh dầu tween 80 1: 1, 1: 1: Hỗn họp trộn máy khuấy từ vói tốc độ 500 vòng/phút 10 phút Bước 2: Hỗn dịch tạo nhũ tương thiết bị siêu âm siêu tốc Mỗi nồng độ kiểm tra trước sau siêu âm 5,10,15 20 phút 2.2.2 Các phương pháp xác định đạc tinh vật lý nhũ tương nano - Xác định kích thước hạt nano thiết bị Zetasizer Nano zs (ZEN3600) vói bước sóng He-Ne 633 nm Trước đo, mẫu nhũ tương nano lọc qua lưới lọc PTFE có kích thước lỗ lọc 0,45 ụm (Millipore Merck KGaA, Darmstadt, Germany) Phép đo thực lần nhiệt 25°c - Xác định độ nhớt nhũ tương nano thiết bị đo độ nhớt Brookhed, mẫu đo gia nhiệt bể ổn nhiệt 25°c Phép đo thực lần - Xác định độ ổn định phương pháp đánh giá mức độ phân tách pha sau ly tâm, nhũ tương 60 nano bảo quản theo chu trình luân phiên nhiệt độ 25°c 4°c thịi gian 12 giờ/1 chu trình, sau chu trình nhũ tương ly tâm tốc độ 6.000 vòng/phút 15 phút Q trình thực vói chu trinh liên tiếp 2.2.3 Các phương pháp xác định tính kháng khuẩn Chuẩn bị vi khuẩn kiểm định: mẫu vi khuẩn V parahaemolyticus nuôi cấy tăng sinh mơi trường Nutrient Brorth có bổ sung 2% NaCl tủ ấm lắc 37°c, tốc độ lắc 180 vòng/phút 24 Mật độ vi khuẩn có sinh khối sau nuôi cấy xác định theo phương pháp đo mật độ quang (OD) bước sóng 600 nm máy quang phổ UVVIS Phương pháp khuếch tán đĩa thạch: 100 pl sinh khối vi khuẩn V parahaemolyticus có mật độ 106 CFU/ml cấy trải bề mặt đĩa thạch có chứa mơi trường Muller Hilton đục lỗ thạch với kích thước 6-8 mm Tiếp tục bổ sung vào lỗ thạch dung dịch nhũ tương nano tinh dầu trầu không, lỗ thạch 50 pl ủ đĩa thạch tủ ấm 37°c quan sát mức độ ức chế vi khuẩn sau 24 ni cấy Thí nghiệm lặp lại lần Phương pháp đánh giá hiệu phòng AHPND nhũ tương nano tinh dầu trầu không: tôm sú thí nghiệm có khối lượng trung bình g, bể thí nghiệm gồm 50 cá thể, dung tích bể thí nghiệm 400 lít Tơm ni nước biển tuần trước thực thí nghiệm Tinh dầu nhũ tương nano từ tinh dầu trầu khơng trộn vói thức ăn tơm vói lecithin sử dụng cho tơm ăn vịng 20 phút kể từ phối trộn, cho tơm ăn lần/ngày, đồng thịi gây nhiễm tơm thí nghiệm cách tiêm vào xoang bụng đốt với sinh khối vi khuẩn V parahaemolyticus có mật độ tương ứng liều LD50 Thí nghiệm thực vói nhóm nghiệm thức, nghiệm thức bố trí bể ni cụ thể sau: nhóm nghiệm thức thử nghiệm tinh dầu trầu không bể nuôi tôm gây nhiễm với chủng V parahaemolyticus V.HOU.01, V.HQU.02, V.HQU.03, nghiệm thức thử nghiệm nhũ tương nano tinh dầu trầu không với bể nuôi tôm gây nhiễm với chủng V Parahaemolyticus nêu Theo dõi thí nghiệm vịng 42 ngày NỊNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIEN nơng thơn - KỲ - THÁNG 6/2022 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ Phương pháp xác định tế bào máu tổng số nồng độ protein huyết thanh: Máu tôm lấy từ nghiệm - khối lượng trung bình trước thí nghiệm)/tổng số ngày theo dõi thí nghiệm X xoang bụng tơm (ở nhóm nghiệm thức, nghiệm thức 15 tơm) đưa vào dung dịch chóng đơng máu Alsever (27 mM sodium citrate, IĨ1M EDTA, 115 mM g ucose, 336 mM NaCl, pH 7,2) dung dịch formaldehyde 4% Tế bào máu đếm trực tiếp buồng Neubauer; nồng độ protein huyết thực đĩa 96 giếng đáy phảng íược tính tốn phương pháp Bradford với chất chuẩn albumin huyết bò Phương pháp xác định khả gày kết tủa huyết thanh: 50 |11 dung dịch of TBS-2 (50 mM Tris, mM MgC12, 10 mM CaC12, 150 mM NaCl, pH 7,4) nhỏ vào đĩa 96 gịếng, đáy chữ u với 50 pl huyết tơm pha lỗng theo hệ số 10 50 |d dung dịch chứa 2% hồng cầu chó Trộn hỗn dịch ủ tiếng nhiệt độ phòng Hiệu giá ngưng kết huyết định nghĩa nghịch đảo độ pha lỗng cuối có khả ngưng kết hồng cầu Cơng thức tính thơng sơ' sinh trưởng: Tỷ lệ tăng trọng= (khối lượng trung bình sau thí Tỷ lệ chuyển đổi thức ăn (FCR)= tổng lượng thức ăn tiêu thụ/tổng khối lượng sinh khối tôm thu sau thí nghiệm KẾT QUÀ NGHIÊN cuu VÀ THÀO LUẬN 3.1 Kết tạo dịch nano nhũ tương từ tinh dầu trầu không Tinh dầu trầu không tách chiết phương pháp lôi nước Lá trầu không nghiền nhỏ, tỷ lệ nước trầu 1:3 (w/v), nồng độ muối NaCl 15%, thời gian chưng cất Bằng phương pháp chưng cất lôi nước, lượng tinh dầu trầu không thu 18,98 ml/g, thành phần tinh dầu gồm có phenol 77,59% eugenol 22,41% Bằng phương pháp siêu âm siêu tốc, với tỷ lệ tinh dầu, chất hoạt động bề mặt Tween 80 nước, kết tạo nhũ tương nano tinh dầu trầu khơng trình bày bảng nano tình dâu trầ Cơng thức Tỷ lệ tinh dầu Tỷ lệ tinh dầu: Thời gian siêu Kích thước giọt Độ nhớt dịch thí nghiệm Tween 80 (v/v) Tween 80: Nước (%) âm (phút) nhũ tương (nm) nhũ tương (cP) A1.1 1:1 6:6:88 3,33 253,5 A1.2 1:1 6:6:88 183,2 3,85 A1.3 1:1 6:6:88 10 76,8 3,92 A1.4 1:1 6:6:88 15 53,1 4,07 A1.5 1:1 6:6:88 20 45,4 4,11 Bl.l 1:2 6:12:82 281,6 3,41 B1.2 1:2 6:12:82 197,2 3,63 B1.3 1:2 6:12:82 10 44,7 3,98 B1.4 1:2 6:12:82 15 39,5 4,11 B1.5 1:2 6:12:82 20 34,2 4,27 Cl.l 1:3 6:18:76 272,2 3,59 C1.2 1:3 6:18:76 176,4 3,74 C1.3 1:3 6:18:76 10 34,7 4,28 C1.4 1:3 6:18:76 15 33,5 4,32 C1.5 1:3 6:18:76 20 31,2 4,41 Kết bảng rằng: kích thước hạt thức tỷ lệ dầu chất hoạt động bề mặt 3:1 thi nhũ tương tỷ lệ nghịch vói nồng độ chất hoạt động đường kính giọt nano đạt kích thước nhỏ Bên bề mặt thòi gian siêu âm Cụ thể, thời gian siêu cạnh đó, theo D Morwanti (2006) [10], vật liệu có độ âm 20 phút, đường kính giọt cơng thức thí nhớt cao ổn định mật độ hạt nghiệm đạt kích thươc nhỏ 55,4 nm, 33,2 nm vật liệu tưong đối dày chuyển động hạt 31,2 nm, tương ứng vói tỷ lệ dầu chất hoạt động có xu hướng khó khăn Số liệu bảng cho mặt 1:1,1: 1: 3; đồng thịi, xét cơng thấy, cơng thức thí nghiệm B1.5 (tỷ lệ tinh dầu: NỊNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIEN nịng thơn - KỲ - THÁNG 6/2022 61 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ chất hoạt động bề mặt: nước 6: 12: 82) c 1.5 (tỷ lệ tinh dầu: chất hoạt động bề mặt: nước 6:18: 76), khả phòng bệnh nhũ tương bệnh vi khuẩn V parahaemolyticus gây nên sau thời gian siêu âm 20 phút, nhũ tương nano tinh dầu có dạng suốt, khơng tạo tượng tách lóp ly tâm tốc độ cao thời gian dài Bảng Ảnh hưởng nhũ tương nano tinh dầu Theo Nirmala cs (2020) [9], gia tăng thòi gian siêu âm làm tăng lượng đầu vào gây phá vỡ giọt tinh dầu thành giọt nano có diện tích bề mặt lớn hơn, làm tăng tính thấm họp chất hoạt tính qua màng mạch máu mơ Cùng với độ nhớt, pH dịch nhũ tương yếu tố ảnh hưởng trực tiếp tới chế phàn phối thuốc thể động vật sử dụng, pH dịch nano tinh dầu trầu không tạo thành từ công thức nghiệm B1.5 C1.5 tương ứng 5,85 6,01 Kết thu cho phép kết luận, nồng độ chất hoạt động bề mặt thòi gian siêu âm yếu tố định ổn định nhũ tương nano, điều kiện thích họp để tạo nhũ tương nano tinh dầu trầu không là: tỷ lệ tinh dầu: chất hoạt động bề mặt: nước 6: 12: 82, thời gian siêu âm 20 phút 3.2 Kết đánh giá ảnh hưởng nhũ tương nano tinh dầu trầu không đến số miễn dịch tôm Hệ thống miễn dịch giáp xác nói chung tơm nói riêng chủ yếu dựa vào đáp ứng miễn dịch tự nhiên, khả đề kháng vói tác nhân gây bệnh có liên quan chủ yếu tới thành phần tế bào máu, hàm lượng protein tổng số, khả gây ngưng kết huyết thanh, hoạt tính phenoloxidase, khả tạo họp chất kháng khuẩn superoxid [11] Trong nghiên cứu này, hiệu tăng cường miễn dịch nhũ tương nano tinh dầu trầu không tôm sú đánh giá thông qua tiêu tế bào máu tổng số, hàm lượng protein tổng số, khả gây ngưng kết huyết Nhìn chung nhũ tương nano tinh dầu trầu khơng có ảnh hưởng đến miễn dịch tự nhiên tôm theo chiều hướng làm tăng tế bào máu tổng số, hàm lượng protein tổng số hiệu ngưng kết huyết (Bảng 2) Tôm sử dụng lượng nhũ tương 150 ml/kg có kết tiêu miễn dịch theo dõi tăng cao nhất, tương ứng 62,91xl06 tế bào/ml máu, 219,60 mg protein tổng số/ml huyết thanh, hiệu giá ngưng kết huyết 210 Kết lụa chọn để thực thí nghiệm 62 trầu không đến số số miễn dịch tôm Protein Tế bào STT Tỷ lệ tinh Hiệu dầu/kg huyết máu tổng giá ngưng số (xio6 thức ăn kết tế bào/ml (mg/ml huyết huyết máu) thanh) (log 2) 50 ml/kg 49,95 208,23 100 ml/kg 212,75 10 56,13 62,91 219,50 10 150 ml/kg 211,60 10 200ml/kg 58,12 205,15 Đối chứng 50,26 3.3 Đánh giá khả ức chế vi khuẩn V parahaemolyticiis nhũ tương nano tinh dầu trầu không phương pháp khuếch tán đĩa thạch chủng vi khuẩn V parahaemolyticus ký hiệu V.HOU.01, V.HOU.02, V.HOU.03 gay bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tôm sử dụng để đánh giá khả ức chế vi khuẩn nano tinh dầu trầu không phương pháp khuếch tán đĩa thạch, mật độ vi khuẩn thử nghiệm 108 CFU/ml, kết thử nghiệm thể hình Hình Kết đánh giá mức độ ức chế vi khuẩn V parahaemolyticus tinh dầu nhũ tương nano tinh dầu trầu khơng Nhìn chung, nhũ tương nano tinh dầu trầu không cho hiệu ức chế vi khuẩn V parahaemolyticus mạnh so vói tinh dầu, cụ thể, tinh dầu trầu không tạo vùng ức chế khoảng NƠNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIÊN NĨNG THƠN - KỲ - THÁNG 6/2022 KHOA HỌC CÔNG NGHỆ 17,6-18,1 mm, nhũ tương nano tạo vùng ức chế có đường kính 22,1-22,25 mm, mức độ gây ức chế vi khuẩn tinh dầu nhũ tương nano tương tự chủng khác Nghiên cứu Nevas cs (2004) [13], Gilles cs (2010) [12] rằng, khuếch tán tinh dầu chậm so vói nhũ tương nano dẫn tới hiệu ức chế vi khuẩn hơn, bên cạnh đó,, ảnh hưởng cấu trúc màng vi khuẩn có liên quan tói nhạy cảm vói tinh dầu thực vật, kết phù họp vói kết nghiên cứu Với kết thử nghiệm ức chế vi khuẩn V parahaemolyticus tinh dầu nhũ tương nano tinh dầu trầu khơng thấy, nhũ tương có tiềm tốt phịng' rè điều trị bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm 3.4 Đánh giá hiệu phòng bệnh hoại tử gan tụy cấp tính tơm nhũ tương nano tinh dầu trầu khơng Thí nghiệm đánh giá hiệu phòng bệnh nhũ tương nano tinh dầu trầu khơng thực tơm sú có khối lượng trung binh g/con, lượng nhũ tương tinh dầu trầu không bổ sung vào thức ăn hàng ngày 150 ml/kg, tơm gây bệnh vói chủng vi khuẩn V parahaemolyticus ký hiệu V.HOU.01, V.HOƯ.02, V.HOU.03 có LD50 tương ứng 2,6xl08, 2,7xl06, 2,6xl05 CFU/ml Bể đối chứng dương, tôm gây nhiễm với vi khuẩn V parahaemolyticus mà không sử dụng nhũ tương; bể đối chứng âm, tôm không gây nhiễm với vi khuẩn không sử dụng nhũ tương; bể đối chứng nhũ tương, tôm không gây nhiễm vói vi khuẩn sử dụng nhũ tương với hàm lượng 150 ml/kg thức ăn, cho ăn hàng ngày Thí nghiệm theo dõi tuần, giá trị theo dõi bao gồm: tỷ lệ sống sót, tỷ lệ tăng trọng hệ số chuyển đổi thức ăn Bảng Kết thử nghiệm nhũ tương nano tinh dầu trầu không tôm Tỷ lệ sống Hệ số chuyển Tăng trưởng bình